CN106367532A - 基于序列多态性区别clade2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法 - Google Patents

基于序列多态性区别clade2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106367532A
CN106367532A CN201610770324.2A CN201610770324A CN106367532A CN 106367532 A CN106367532 A CN 106367532A CN 201610770324 A CN201610770324 A CN 201610770324A CN 106367532 A CN106367532 A CN 106367532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clade
pcr
aiv
rflp
avian influenza
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610770324.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106367532B (zh
Inventor
施少华
万春和
陈珍
刘荣昌
黄瑜
程龙飞
傅光华
傅秋玲
陈红梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610770324.2A priority Critical patent/CN106367532B/zh
Publication of CN106367532A publication Critical patent/CN106367532A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106367532B publication Critical patent/CN106367532B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV的PCR‑RFLP方法。包括以下步骤：1)从检测样品中提取病毒基因组RNA；2)用引物P1和P2对clade2.3.4和clade 2.3.4.4病毒进行RT‑PCR扩增，得到相应的HA基因片段；3)取RT‑PCR扩增产物经Sac I酶切后进行RFLP分析。本发明的方法仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需常规限制性内切酶Sac I进行RFLP酶切后加以鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV快速鉴别诊断上快捷准确，可填补国内外相关领域的研究空白。

Description

基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV 的PCR-RFLP方法
技术领域
本发明涉及兽医传染病快速诊断技术领域，特别涉及一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法。
背景技术
禽流感(Avian influneza，AI)是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒(H5subtype avian influenzavirus,H5 AIV)引起的感染目前已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。
关于流感的最早记录可追溯到18115年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV[A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)，GS/GD/96]，紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1HPAIV统一分类准则将H5N1HPAIV分为0～9共计10个不同clade，其中clade 2.3.4最早于2003～2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006～2009年clade 2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株。近年来，clade 2.3.4分支出现了新的分支clade 2.3.4.4的H5N6亚型、H5N8亚型病毒，并广泛流行于我国多个省市。针对clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗(Re-5株)和clade 2.3.4.4 H5 AIV的疫苗(Re-8株)已研制成功，对clade 2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。
然而，clade 2.3.4和clade 2.3.4.4二者之间的基因序列同源率为94.4％(以经典参考毒株比较为例)，很难通过常规的分子生物学方法进行鉴别，限制性内切酶片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间(基因差异往往很小)的分型研究工作中，应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。
目前，仅需要1组引物并结合clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素HA基因的核苷酸特征，利用Sac I酶进行RFLP酶切分析对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行鉴别诊断。本发明检测方法快捷准确，可填补国内外相关领域的研究空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP，方法该方法能有效区分clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5AIV感染，为水禽业健康养殖提供技术保证。
基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：
1)从检测样品中分别提取H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支病毒基因组RNA；
2)用引物P1和P2同时对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV核酸RNA进行RT-PCR扩增，得到相应的HA基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为499bp；
3)取RT-PCR扩增产物，经Sac I酶切后进行RFLP分析。
优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的扩增引物的序列为：
上游引物P1：5’-GTGCCGGAATGGTCTTAC-3’，
下游引物P2：5’-TTGCATCATTCGGTTTTAAAAT-3’。
优选地，上述技术方案中，所述步骤3)中，Sac I酶切位点位于clade 2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物的177-182位，clade 2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物可被切成2段，大小分别为181bp和318bp；而clade2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有Sac I酶切位点，经酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为499bp。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
本发明鉴定方法简单，快捷和准确率高：本发明对115份临床采集的流感症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR扩增后进行Sac I酶切，其中clade 2.3.4 H5AIV分支4份阳性，阳性率为3.48％(4/115)；clade 2.3.4.4 H5 AIV分支8份阳性，阳性率为6.96％(8/115)，检测到clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支H5 AIV共感染2份，阳性率为1.74％(2/115)。
本发明在操作中，仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需常规限制性内切酶Sac I进行RFLP酶切后加以鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支H5 AIV快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。当前，针对clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗(Re-5株)和clade 2.3.4.4 H5 AIV的疫苗(Re-8株)已研制成功，对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。
附图说明
图1为根据本发明的基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法的上下游引物扩增区域对两种病毒血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异图。
图2为根据本发明基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法的电泳图。
其中：泳道M-DNA分子量标准2000，1-clade 2.3.4.4H5AIV的RT-PCR产物，2-clade2.3.4 H5 AIV的RT-PCR产物，3-clade 2.3.4.4 H5 AIV的RT-PCR产物的酶切图，4-clade2.3.4 H5 AIV的RT-PCR产物的酶切图，5-clade 2.3.4.4和clade 2.3.4 H5 AIV共感染的RT-PCR产物的酶切图，6-阴性对照。
图3为根据本发明基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法的阳性样品的RT-PCR产物克隆测序图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
1、提取病毒的核酸RNA；
(1)病毒来源：
H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4分支(CX1株)和clade 2.3.4.4分支(DK10株)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
(2)提取病毒RNA：
用常规方法分别提取clade 2.3.4分支(CX1株)和clade 2.3.4.4分支(DK10株)H5AIV的基因组RNA，以备RT-PCR扩增使用。
2、RT-PCR扩增
(1)扩增引物的设计和选择：
根据clade 2.3.4 H5 AIV和clade 2.3.4.4 H5 AIV的HA基因特征设计上游引物P1和下游引物P2，其中，引物的序列如下：
上游引物P1：5’-GTGCCGGAATGGTCTTAC-3’，
下游引物P2：5’-TTGCATCATTCGGTTTTAAAAT-3’。
如图1所示：本发明设计的上下游引物扩增区域对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5 AIV血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异(H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4血凝素基因HA核苷酸序列为GAGCTC(Sac I酶切识别位点)，而H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4.4血凝素HA基因HA核苷酸序列为GAGCGC。
(2)RT-PCR扩增：
用上述设计的特异性引物P1和P2进行RT-PCR扩增，扩增反应体系如下：
采用Trans ScriptⅡOne-Step RT-PCR Super Mix(购自北京全式金生物技术有限公司)推荐的RT-PCR扩增反应体系(40μL，见表1)。其中，提取的病毒RNA模板2μL、上游引物P1(10μM)1μL、下游引物P2(10μM)1μL、2×One-Step Reaction Mix 20μL、Trans ScriptⅡOne-Step Enzyme Mix 1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL。
表1 RT-PCR反应体系
RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30min后进行PCR扩增。条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存备用。
(3)凝胶电泳检测：
扩增产物用常规的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像，结果如图2所示。
如图2所示：在上述条件下，clade 2.3.4.4H5AIV(泳道1)和clade 2.3.4 H5 AIV(泳道2)的样品分别扩增出大小为499bp的片段。
3、RFLP分析
将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行Sac I酶切分析。酶切体系如下：
采用Sac I(购自宝生物工程(大连)有限公司)推荐的酶切反应体系(30μL，见表2)，其中RT-PCR产物20μL、10×Quickcut Buffer 3μL、Sac I酶1μL，补充灭菌去离子水6μL至终体积30μL。
反应条件：37℃水浴反应30min。
表2酶切反应体系
反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV类型，结果如图2所示。
如图1所示：Sac I酶切位点位于clade 2.3.4病毒血凝素基因HA的扩增产物的177-182位(GAGCTC)；clade 2.3.4.4H5AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有Sac I酶切位点，此处序列为GAGCGC。
如图2所示：clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有Sac I酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为499bp(泳道3)，而clade 2.3.4 H5AIV可被切成2段，大小分别为181bp和318bp(泳道4)。
4、临床应用
本发明对115份临床采集的流感症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测，经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行Sac I酶切，其中clade 2.3.4 H5 AIV分支4份阳性，阳性率为3.48％(4/115)；clade 2.3.4.4 H5 AIV分支8份阳性，阳性率为6.96％(8/115)，检测到clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支H5AIV共感染2份，阳性率为1.74％(2/115)。。
随机选取检测为H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4阳性1个样品(clade 2.3.4阳性1)、H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4.4阳性1个样品(clade2.3.4.4阳性1)以及检测为clade2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支H5AIV共感染1个样品(记为clade 2.3.4混合阳性1和clade 2.3.4.4混合阳性1)的RT-PCR产物进行克隆测序，结果符合预期。clade 2.3.4阳性1在此处核苷酸序列均为GAGCTC；clade2.3.4.4阳性1在此处核苷酸序列均为GAGCGC；检测为clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支H5AIV共感染1个样品中记为clade 2.3.4混合阳性1在此处核苷酸序列均为GAGCTC且记为clade 2.3.4.4混合阳性1在此处核苷酸序列均为GAGCGC，均符合引物设计时的基因特征，结果如图3所示。
本发明的优点在于，其仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需限制性内切酶Sac I进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程。
本发明在H5亚型禽流感病毒clade 2.3.4分支和clade 2.3.4.4分支快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。当前，针对clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗(Re-5株)和clade 2.3.4.4H5AIV的疫苗(Re-8株)已研制成功，对clade 2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (3)

1.基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从检测样品中提取clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV基因组RNA；
2)用引物P1和P2同时对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV基因组RNA进行RT-PCR扩增，得到相应的HA基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为499bp；
3)取RT-PCR扩增产物，经Sac I酶切后进行RFLP分析。
2.根据权利要求1所述基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述步骤2)的扩增引物的序列为：
上游引物P1：5’-GTGCCGGAATGGTCTTAC-3’，
下游引物P2：5’-TTGCATCATTCGGTTTTAAAAT-3’。
3.根据权利要求1所述基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述步骤3)中，Sac I酶切位点位于clade 2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物的177-182位，clade 2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物可被切成2段，大小分别为181bp和318bp；而clade 2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有Sac I酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为499bp。
CN201610770324.2A 2016-08-30 2016-08-30 基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法 Active CN106367532B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610770324.2A CN106367532B (zh) 2016-08-30 2016-08-30 基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610770324.2A CN106367532B (zh) 2016-08-30 2016-08-30 基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106367532A true CN106367532A (zh) 2017-02-01
CN106367532B CN106367532B (zh) 2020-09-18

Family

ID=57901670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610770324.2A Active CN106367532B (zh) 2016-08-30 2016-08-30 基于序列多态性区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106367532B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663531A (zh) * 2017-11-15 2018-02-06 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr‑rflp引物及其检测方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409562A (zh) * 2013-09-02 2013-11-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的pcr-rflp方法
CN103602759A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的pcr-rflp方法
CN105132589A (zh) * 2015-10-12 2015-12-09 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法
CN105177186A (zh) * 2015-10-12 2015-12-23 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 快速鉴别鸭圆环病毒基因型的pcr-rflp引物及方法
CN105695637A (zh) * 2016-04-19 2016-06-22 福清市默克兽医院 一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型rt-pcr-rflp方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409562A (zh) * 2013-09-02 2013-11-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的pcr-rflp方法
CN103602759A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的pcr-rflp方法
CN105132589A (zh) * 2015-10-12 2015-12-09 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法
CN105177186A (zh) * 2015-10-12 2015-12-23 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 快速鉴别鸭圆环病毒基因型的pcr-rflp引物及方法
CN105695637A (zh) * 2016-04-19 2016-06-22 福清市默克兽医院 一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型rt-pcr-rflp方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663531A (zh) * 2017-11-15 2018-02-06 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr‑rflp引物及其检测方法和应用
CN107663531B (zh) * 2017-11-15 2021-06-25 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr-rflp引物及其检测方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106367532B (zh) 2020-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105132589B (zh) 一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法
CN101691614B (zh) 一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法
CN103060478B (zh) 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法
CN104789700B (zh) 基于荧光定量pcr熔解曲线法的dhav分型检测法
CN101935710B (zh) 一种鸽性别鉴别方法
CN101684481A (zh) 丹参est-ssr分子标记的制备方法、特异引物及其应用
CN105177186A (zh) 快速鉴别鸭圆环病毒基因型的pcr-rflp引物及方法
CN102676701B (zh) 禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
CN102559928A (zh) 特异性引物组、包含其的试剂盒、使用方法及检测方法
CN105200162B (zh) 一种快速区分hp-prrs活疫苗jxa1-r株与野毒株的hrm检测方法及其引物
CN105018645B (zh) 用于检测经典型和变异型猪伪狂犬病毒的实时荧光pcr-hrm引物
CN109593892A (zh) 一种扩增h5n6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组、试剂盒及方法
CN103436618A (zh) 棉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
CN106367532A (zh) 基于序列多态性区别clade2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法
CN106119422B (zh) 区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5 AIV的PCR-RFLP方法
CN105671209A (zh) 一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法
CN104611327A (zh) 鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法和专用引物
CN104789666A (zh) 基于dna条形码登革热传播媒介白纹伊蚊标准基因及应用
CN107937620A (zh) 一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr‑rflp方法
CN106282409A (zh) 区别clade 2.3.4和clade 7.2H5AIV的PCR‑RFLP方法
CN106755566A (zh) 一种区别clade2.3.2.1和clade2.3.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法
CN106319090A (zh) 基于序列多态性区别clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV的PCR‑RFLP方法
CN104450951A (zh) 植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定的引物及方法
CN102719567A (zh) 禽传染性支气管炎病毒h120毒株的pcr检测引物及检测方法
CN106755586B (zh) 区分clade 7．2和clade 2．3．4．4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant