CN105695637A - 一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型rt-pcr-rflp方法 - Google Patents

一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型rt-pcr-rflp方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的RT-PCR-RFLP方法，该方法是利用牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’端的保守区基因序列酶切位点差异来进行区别的，包括RNA的提取，RT-PCR扩增得，PstⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法简单，操作简便，可有效用于牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型简便诊断。

Description

一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法
技术领域
本发明属于动物传染病学技术领域，涉及一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法，具体涉及一种利用牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’端基因序列酶切位点差异来区分牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的逆转录（RT，reversetranscription）-聚合酶链式反应(PCR，polymerasechainreaction)—限制性片段长度多态性（RFLP，restrictionfragmentlengthpolymorphism）方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，可引起牛病毒性腹泻/粘膜病。该病除可感染牛（尤其是犊牛）外，还见有感染猪、羊和鹿等动物。
当前，牛病毒性腹泻病毒分为2个基因型：基因1型和基因2型。基因1型牛病毒性腹泻病毒感染的主要症状为一过性发热、腹泻和急慢性粘膜病。基因2型引起的症状主要表现为发烧、腹泻、呼吸失调和血小板减少等，主要导致奶牛流产，对牛的致死性较高。
当前，基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒在我国均见有报道，急需一种快速鉴别诊断方法来区分牛群中的基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒感染。目前，BVDV的病原诊断主要有病毒分离、血清中和、ELISA及PCR方法等。当前，检测基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的PCR已见有研究报道，但使用的引物一般在两组（4条）及以上，分别针对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征来设计。
本发明通过分析比较基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征，建立一种可用于基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的鉴别诊断方法。该方法仅需一组特异性引物对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的核酸RNA进行RT-PCR扩增，通过基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增产物中酶切位点的差异进行酶切鉴定，建立区分基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP鉴别诊断方法。
目前，国内外尚无有关利用RT-PCR-RFLP方法来区分基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的报道，本发明填补该领域的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法，根据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒全基因序列5’末端序列的特征，设计一组（2条）引物可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT-PCR扩增。在基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增中，基因1型牛病毒性腹泻病毒中含有PstⅠ酶（酶切位点序列为CTGCAG），而基因2型牛病毒性腹泻病毒中没有该酶切位点，通过对RT-PCR产物的PstⅠ酶切来建立基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒快速鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。
本发明采用以下技术方案：
一种区别基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP方法，包括以下步骤：
（1）提取基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因核酸RNA；
（2）用引物BVDV-12F和BVDV-12R同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT-PCR扩增，得到相应的RT-PCR扩增片段；
（3）取RT-PCR扩增片段产物进行经PstⅠ酶切分析。
其中，RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）需满足如下要求：
①该组RT-PCR扩增引物区需根据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因组保守区设计，可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行阳性RT-PCR扩增，目的片段大小为335bp。
②该组RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）扩增基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的片段中，仅基因1型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中含有PstⅠ酶切位点，可被切成2段（236bp和99bp），而基因2型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中没有PstⅠ酶切位点，被PstⅠ酶切后大小不变，仍为335bp。
根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物BVDV-12F和BVDV-12R的序列为：
上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，
下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’；
其中，所述的步骤（2）的RT-PCR扩增产物大小为335bp。所述的步骤（3）的RT-PCR扩增产物，牛病毒性腹泻病毒1型RT-PCR扩增产物的236-241处序列为CTGCAG，可被PstⅠ酶切成236bp和99bp大小的两段；牛病毒性腹泻病毒1型RT-PCR扩增产物的236-241处序列为TAGCAG，被PstⅠ酶切后大小不变，还是335bp。
所述的引物在制备区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型检测试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：鉴定方法准确有效。使用本方法对临床收集的牛病料50份进行RT-PCR-RFLP检测，其中基因1型牛病毒性腹泻病毒阳性6份、基因2型牛病毒性腹泻病毒2份，没有检测到基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒共感染（co-infection）情况。
附图说明
图1为基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR-RFLP方法的电泳图；
M为DL500DNAMarker；1为基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；2为基因1型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；3为经PstⅠ酶切的基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；4为经PstⅠ酶切的基因1型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；5为实验阴性对照。
图21型BVDV和2型BVDV基因组比较。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、引物设计
根据GenBank中登陆的基因1型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号AB078951、AF041040、AJ133738、EU183197、KP941584和M96751）和基因2型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号U18059、KT823819、KF835701、AY149216、AF502399和AF002227）的基因序列进行分析比较，发现基因1型牛病毒性腹泻病毒中含有PstⅠ酶（酶切位点序列为CTGCAG），而基因2型牛病毒性腹泻病毒中没有该酶切位点（该处序列为TAGCAG）（图2）。
实验所需的引物根据基因1型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号M96751）和基因2型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号U18059）设计，引物序列为
上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，
下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’；
2、RT-PCR扩增
以常规方法提取基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒核酸RNA。用所设计的特异性引物BVDV-12F和BVDV-12R进行RT-PCR扩增，扩增片段大小约335bp。扩增体系为40μL，其中提取的RNA模板4μL、上下游引物（BVDV-12F和BVDV-12R、20μM）各0.5μL、2×One-stepReactionMix10μL，EasyScriptOne-stepEnzymeMix0.8μL，补充灭菌去离子水至终体积40μL。反应条件为45℃反转录30min，94℃预变性5min，随后进行94℃30s、54℃30s、72℃30s，进行40个循环后，72℃延伸10min。
3、RFLP分析
RT-PCR反应结束后，将基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR产物分别经胶回收试剂盒纯化后进行PstⅠ酶切。酶切体系为20μL，其中10×HBuffer2μL，胶回收产物10μL，PstⅠ酶2μL、补充灭菌去离子水至终体积20μL。混匀后，经37℃水浴1小时，加入2μL10×LoadingBuffer终止，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒感染分析鉴定。结果可见，仅基因1型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中含有PstⅠ酶切位点，可被切成2段（236bp和99bp），而基因2型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中没有PstⅠ酶切位点，被PstⅠ酶切后大小不变，仍为335bp。
4、临床应用
使用本方法对临床收集的牛病料50份进行RT-PCR-RFLP检测，其中基因1型牛病毒性腹泻病毒阳性6份、基因2型牛病毒性腹泻病毒2份，没有检测到基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒共感染（co-infection）情况。
SEQUENCELISTING
<110>福清市默克兽医院
<120>一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法
<130>2
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gctagccatgcccttagta19
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggtttttgtttrtatgttttgtat24

Claims (2)

1.一种用于区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型的RT-PCR-RFLP方法的引物，其特征在于：所述引物序列为：
上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，
下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’。
2.一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型的RT-PCR-RFLP方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）提取牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的核酸RNA；
（2）用针对牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’端的保守区设计的一组引物，对牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的核酸进行逆转录-聚合酶链式反应，上游引物BVDV-12F和下游引物BVDV-12R序列分别为：
上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，
下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’；
（3）取扩增RT-PCR产物，利用PstⅠ酶进行RT-PCR产物酶切，被切开为2段的是牛病毒性腹泻病毒1型，酶切后条带大小不变的是牛病毒性腹泻病毒2型。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106167837A (zh) * 2016-08-31 2016-11-30 金宇保灵生物药品有限公司 牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物和探针
CN106367532A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 基于序列多态性区别clade2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法
CN106929609A (zh) * 2017-05-05 2017-07-07 金宇保灵生物药品有限公司 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的pcr检测试剂盒及其专用引物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343170A (zh) * 2013-07-26 2013-10-09 中国兽医药品监察所 牛病毒性腹泻病毒rt-pcr检测试剂盒
CN103397107A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 中国兽医药品监察所 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103981285A (zh) * 2014-05-06 2014-08-13 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法
CN104313192A (zh) * 2014-11-18 2015-01-28 成都天邦生物制品有限公司 一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343170A (zh) * 2013-07-26 2013-10-09 中国兽医药品监察所 牛病毒性腹泻病毒rt-pcr检测试剂盒
CN103397107A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 中国兽医药品监察所 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103981285A (zh) * 2014-05-06 2014-08-13 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法
CN104313192A (zh) * 2014-11-18 2015-01-28 成都天邦生物制品有限公司 一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J PIZARRO-LUCERO ET AL.: "Molecular characterization of pestiviruses isolated from bovines in Chile", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》 *
M O CELEDON ET AL.: "Isolation and identification of pestiviruses in alpacas (Lama pacos) and llamas (Lama glama) introduced to the Region Metropolitana, Chile", 《ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA》 *
S VILCEK ET AL.: "Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis", 《ARCH VIROL》 *
任敏等: "基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用", 《中国预防兽医学报》 *
刘亮伟等: "《基因工程原理与实验指导》", 30 September 2010, 中国轻工业出版社 *
陆家等: "计算机在确定牛病毒性腹泻病毒基因组常用限制性内切酶位点中的应用", 《中国病毒学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367532A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 基于序列多态性区别clade2.3.4和clade2.3.4.4 H5 AIV的PCR‑RFLP方法
CN106167837A (zh) * 2016-08-31 2016-11-30 金宇保灵生物药品有限公司 牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物和探针
CN106929609A (zh) * 2017-05-05 2017-07-07 金宇保灵生物药品有限公司 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的pcr检测试剂盒及其专用引物

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