CN104313192A - 一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒用于临床及科研领域，可以广泛用于BVDV的快速检测，特别是对BVDV感染的快速检测及其对牛源原材料、猪瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速监测。本发明还提供了用于检测牛病毒性腹泻病毒感染的荧光定量RT-PCR方法，该方法检测结果准确，具有特异性高，灵敏度高，重复性好，扩增与检测一步完成，操作更简单，检测可在两个小时内完成的优点。

Description

一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，又称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD-MDV)，属于黄病毒科(Flavivixidae)、瘟病毒属(Pestivirus)的成员。该病毒与猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)为同一个属。牛血清、冷冻胚胎、牛精液等牛源产品都可能污染BVDV，造成BVDV的传播。在兽用疫苗生产中，常使用牛血清、牛睾丸细胞、胰酶等牛源材料作为原材料。因此，一旦这些原材料中若有BVDV病原，会导致疫苗污染，尤其是猪用疫苗污染后，会导致免疫猪感染BVDV，造成自身类似猪瘟的临床症状给猪瘟的诊断带来困难外，还会成为BVDV的污染源。
国内对于猪瘟苗原材料中检测BVDV的方法主要有Vero传代细胞检测法、致细胞病变和红细胞吸附外源病毒检验法、荧光抗体检测法、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、PCR技术等。常规的检测方法存在费时费力，灵敏度低等缺点。随着生物技术水平的发展，荧光定量RT-PCR方法的出现，为BVDV的检测提供了一种有力的工具。而荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比具有灵敏性更强、特异性更好、污染几率小、自动化高、高通量等优势，因而成为一种越来越重要的检测技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒能够快速准确的对牛病毒性腹泻病毒进行定量检测。
本发明的另一目的在于提供检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，包括临床及科研中对于牛病毒性腹泻病毒感染的快速定量检测盒对牛血清及猪瘟弱毒活疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹泻病毒进行监测。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括一对BVDV的特异性引物及一条特异性探针，其中所述引物对的上游序列(BVDV-P1)为5’-GGG(A/G/T)AGTCGTCA(A/G)TGGTTCG-3’，下游序列(BVDV-P2)为5’-CCTATCAGGC TGT(A/G)T(C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3’，所述的特异性探针序列(BVDV-MGB)为5’-FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3’。
进一步地，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2×RT-PCR Buffer缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、特异性探针、Total RNA、RNase Free dH2O。
作为最优方案，所述RT-PCR反应液的总体积为25μL，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2×One step RT-PCR BufferⅢ：12.5μL；5U/μL Takara Ex Taq HS：0.5μL；PrimeScriptRT enzyme MixⅡ：0.5μL；10μM上游引物BVDV-P1：1.5μL；10μM下游引物BVDV-P2：1.5μL；特异性探针：1μL；Total RNA：5μL、RNase Free dH2O：2.5μL。
所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
所述的检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，该试剂盒使用时包括如下步骤：
S1.提取待检样品的RNA；
S2.一步法PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA，同时进行荧光定量PCR；
S3.对数据进行处理、判定检测结果；
其中，所述应用不用于诊断目的。
本发明所述的RNA提取是指商品化病毒RNA试剂盒提取RNA。
本发明中最优反应程序是指1个循环反转录42℃，5min；40个循环95℃，10sec；95℃，5sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。
本发明所述的结果判定：点击PCR仪分析界面，取3～15个循环荧光信号为基线。阈值为阈值线刚好超过正常阴性对照品的扩增曲线的最高点，无Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。当检测样Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长期，结果可直接判定为阳性；当检测样35<Ct值<40，需重检一次，若Ct值仍<40，且扩增曲线有明显的指数增长期，可判定结果为阳性，否则为阴性；检测结果无Ct值或Ct值为40，结果判定为阴性。
用于检测BVDV的方法，包括应用荧光定量RT-PCR方法检测待测样本中是否存在BVDV的RNA步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和探针：序列为5’-GGG(A/G/T)AGTCGTCA(A/G)TGGTTCG-3’的上游引物，序列为5’-CCTATCAGGC TGT(A/G)T(C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3’的下游引物，以及序列为5’-FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3’的探针，所述用于检测BVDV的方法不用于诊断目的。
用于检测BVDV的方法，包括应用上述荧光定量RT-PCR检测试剂盒检测待测样本中是否存在BVDV的RNA的步骤。
本发明具有以下优点：本发明根据GenBank中的牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的基因序列设计一对BVDV的特异性引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件进行相应的优化，具有较好的重复性、灵敏度和特异性，可以广泛用于BVDV的快速检测，特别是对BVDV感染的快速检测及其对牛源原材料、猪瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速监测；本发明采用探针法荧光定量RT-PCR方法其假阳性率低于SYBR Green染料法，其检测结果更加准确，与普通的PCR检测方法相比，本发明的方法具有特异性高，灵敏度高，重复性好，扩增与检测一步完成，操作更简单，检测可在两个小时内完成。
附图说明
图1为本发明方法特异性的动力学曲线。图中a是BVDV，b-g分别是猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、CSFV和阴性对照；
图2为本发明方法重复性的动力学曲线。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒
1.一对BVDV的特异性引物：引物对的上游序列(BVDV-P1)为5’-GGG(A/G/T)AGTCGTCA(A/G)TGGTTCG-3’，下游序列(BVDV-P2)为5’-CCTATCAGGC TGT(A/G)T(C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3’；
2.一条特异性探针：特异性探针序列(BVDV-MGB)为5’-FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3’；
3.RT-PCR反应液组分(总体积为25μL)：
2×One step RT-PCR BufferⅢ：12.5μL；
5U/μL Takara Ex Taq HS：0.5μL；
PrimeScript RT enzyme MixⅡ：0.5μL；
10μM上游引物BVDV-P1：1.5μL；
10μM下游引物BVDV-P2：1.5μL；
特异性探针：1μL；
Total RNA：5μL、
RNase Free dH2O：2.5μL。
4.阳性对照：BVDV C24V毒株MDBK细胞系产物，其病毒滴度为106.5TCID50/ml，灭活提取RNA分装。
5.阴性对照：MDBK细胞培养产物，灭活提取RNA分装。
实施例2：牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1.材料
根据BVDV核苷酸序列，利用DNAStar软件进行序列分析，利用Oligo 6.0引物设计软件设计一对引物及探针用于鉴定BVDV及CSFV病毒。引物由上海英骏公司合成，探针由ABI公司合成。One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购置宝生物(大连)有限公司；病毒RNA提取试剂盒购置天根生化科技(北京)有限公司。
2.方法与结果
(1)最佳反应条件的确立
为了确定引物的最佳反应体系，对引物和探针的浓度进行了相应的优化。反应程序为：42℃，5min(一个循环)；95℃，10sec；95℃，5sec；60℃，30sec，反应进行40个循环，于60℃进行荧光信号采集。反应25μL体系如表1所示：
表1：最佳反应体系表
(2)特异性试验
将PCV2、PRV、TGEV、PRRSV、BVDV、CSFV提取病毒的核酸进行荧光定量RT-PCR反应，同时设立阴性对照，利用上述的最佳反应体系及其程序进行。检测结果如图1所示，图1表明只有BVDV具有相应的Ct值，其余病毒均为阴性。因此，结果证明建立的BVDV荧光定量RT-PCR方法的特异性较好。
(3)重复性性试验
根据已经优化好的反应条件，对同一样品提取病毒RNA模板进行荧光定量RT-PCR反应。结果如图2所示，同一模板重复进行八次荧光定量RT-PCR反应，结果表明所有的样品的Ct值介于25.94～26.54之间，最大Ct值相差0.6，表明检测样品结果的重复性较好。
(4)敏感性试验
将BVDV种毒(105.5TCID50/mL)进行10倍比例的稀释，每个稀释度提取RNA核酸进行荧光定量RT-PCR检测。结果显示其最低检测量可达到10-0.5TCID50(0.32TCID50)。
实施例3：荧光定量RT-PCR检测牛病毒性腹泻病毒
1.材料
猪瘟耐热细胞苗半成品及成品：成都天邦生物制品有限公司提供；猪瘟脾毒、BVDV种毒(C24V株)均购自中监所；组织病毒RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，货号：R6934-01；OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自宝生物(大连)有限公司，货号：DRR064A；病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP315-R。
2.方法与结果
(1)混合样RNA的提取
将猪瘟脾毒、耐热细胞苗半成品及成品与BVDV种毒按照不同比例混合，共计30个样，其详细混合数据如表2所示。将脾毒与BVDV混合的10个样利用组织提取RNA试剂盒提取相应的RNA，其余20个样利用病毒RNA提取试剂盒提取其RNA。
(2)荧光定量RT-PCR检测
表2：两种不同病毒混合样(单位：μL)
“*”中的BVDV含量是指用DMEM将BVDV进行10倍倍比稀释后，10μL中含有BVDV的量。“▲”指DMEM液。
按照实施例2建立的BVDV荧光定量RT-PCR方法和CSFV荧光定量RT-PCR法，对上述30个样进行CSFV和BVDV的荧光定量RT-PCR检测，同时设立阳性、阴性对照，结果见表3。从表中可以看出，实施例2中建立的BVDV荧光定量RT-PCR方法能够检测出混在猪瘟苗脾毒、半成品及成品中的微量BVDV。
表3：两种荧光定量RT-PCR对混合样的检测结果

Claims (7)

1.一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一对BVDV的特异性引物及一条特异性探针，其中所述引物对的上游序列（BVDV-P1）为5’- GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGTTCG-3’，下游序列（BVDV-P2）为5’- CCTATCAGGC TGT(A/G)T (C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3’，所述的特异性探针序列(BVDV-MGB)为5’-FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3’。
2.如权利要求1所述的一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述引物对和探针被包括在RT-PCR反应液中，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2× RT-PCR Buffer缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、特异性探针、Total RNA、RNase Free dH2O。
3.如权利要求2所述的一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述RT-PCR反应液的总体积为25μL，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2×One step RT-PCR Buffer Ⅲ：12.5μL；5U/μL Takara Ex Taq HS：0.5μL；PrimeScript RT enzyme MixⅡ：0.5μL；10μM上游引物BVDV-P1：1.5μL；10μM下游引物BVDV-P2：1.5μL；特异性探针：1μL；Total RNA：5μL、RNase Free dH2O：2.5μL。
4.如权利要求2或3所述的一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
5.如权利要求1-4中任一项所述的检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒使用时包括如下步骤：
S1. 提取待检样品的RNA；
S2. 一步法PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA，同时进行荧光定量PCR；
S3. 对数据进行处理、判定检测结果；
其中，所述应用不用于诊断目的。
6.用于检测BVDV的方法，其特征在于，包括应用荧光定量RT-PCR方法检测待测样本中是否存在BVDV的RNA步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和探针：序列为5’- GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGTTCG-3’的上游引物，序列为5’- CCTATCAGGC TGT(A/G)T (C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3’的下游引物，以及序列为5’-FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3’的探针，所述用于检测BVDV的方法不用于诊断目的。
7.用于检测BVDV的方法，其特征在于，包括应用权利要求1-4中任一项的荧光定量RT-PCR检测试剂盒检测待测样本中是否存在BVDV的RNA的步骤。
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