CN101158634A - 乙型肝炎病毒(hbv)荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR检测方法以及试剂盒组成。本方法采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后取部分微量裂解液直接加入PCR反应液中进行扩增；反应液中含有一对特异性引物和一条用荧光染料标记的探针，采用PCR法扩增目的基因，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值并计算出样品病毒含量。本发明的试剂盒在保证灵敏度、准确度的情况下，操作简单、快速，降低了临床检测的劳动强度，同时降低了临床PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能。此方法适用于HBV定量检测，可用作临床实验室对HBV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，对实验操作者要求相对较低，具有实际的临床应用价值。

Description

乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

乙型肝炎是严重危害广大人民群众的一种常见病，至今仍是世界性的医学难题，它是嗜肝HBV病毒引起的一种高发病率、高死亡率的传染病。据统计，2003年全世界有乙肝患者350,000,000，到2004上升[2]到400,000,000″在美国，慢性乙肝感染导致每年大约5000人死于肝硬化和肝癌。根据卫生部的调查1992年至1995年，我国人群乙肝感染率为57.6％；据此推算，我国约有6.9亿人已感染或正在感染乙肝病毒，1.2亿人携带乙肝病毒。因此，乙型肝炎已成为一个十分严重的公共卫生问题，应引起社会各界的高度重视，必须加强预防，减少发病，控制流行。

乙肝病毒传统的检测方法一般为细胞培养法和酶联免疫法(ELISA)，但这两种方法工作量大、耗时长，给乙肝病毒的检测带来诸多不便。随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验，包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测以及多种病毒、细菌耐药性的检测等。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在一适当波长下实时在线监控反应过程，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，再结合相应的软件可对结果进行分析，计算出待测样品的初始模板量。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。

本发明即利用荧光定量PCR技术对乙肝病毒进行检测，具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高等特点，可进行快速定性定量检测。此外，该乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法，采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后直接取裂解液加入PCR反应液中进行扩增，在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间，降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，从而实现对乙肝病毒的定性定量检测。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种精确简便的用于定量乙肝病毒血清DNA的方法；本发明的另一目的在于提供一种用于该方法的的试剂盒。

本发明的技术特征在于在对现有各个亚型HBV DNA序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性双荧光探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因。同时，该方法采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后直接取裂解液加入PCR反应液中进行扩增，在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间，降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，从而实现对乙肝病毒的定性定量检测。

本发明的技术特征在于，在按下述方法设计的探针和相应引物存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增，实现乙型肝炎病毒基因分型检测：

1、所述的探针和特异性引物设计方法如下：

1)同源性比对：从GeneBank数据库中调出乙肝病毒各亚型基因序列。

2)通过比对选取高度保守序列。

3)以保守序列为基准设计一对特异性引物及一条荧光探针。

2.引物和荧光探针设计原则：

1)特异性引物和荧光探针的长度：每条引物长度为18～25个碱基，荧光探针长度为20～30个碱基。

2)特异性引物和荧光探针中GC％要求在40～60％，理论Tm＞50℃。

3)特异性引物和荧光探针自身、引物和探针之间的3’端尽可能避免碱基配对。

4)引物和荧光探针自身、引物和探针之间尽可能避免6对以上的连续碱基配对。

5)选用的引物和荧光探针要求设计在人乙型肝炎病毒(HBV)基因中的保守区，只对人乙肝病毒特异，和其他物种无交叉反应。荧光探针位于一对引物之间的区域。扩增目的基因长度最好介于80～150bp。

3.乙肝病毒特异性扩增基因序列为：

1    GGCGTTTTAT  CATATTCCTC TTCATCCTGC  TGCTATGCCT

41    CATCTTCTTG  TTGGTTCTTC  TGGACTACCA  AGGTATGTTG

81    CCCGTTTGTC  CTCT

针对乙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

PHBV1上游引物：5‘ GGCGTTTTAT CATATTCCTC TTCAT 3’  25bp

PHBV2下游引物：5‘ AGAGGACAAA CGGGCAACAT A 3’      21bp

FPHBV荧光探针：5‘FAM-CCTCATCTTC TTGTTGGTTC TTCTGG-TAMARA

                    3’ 26bp

4.试剂盒组成：

一对特异性引物PHBV，一条特异性荧光探针FPHBV，Taq酶，UNG酶，乙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血血清，HBV阳性定量标准品、核酸裂解液，PCR缓冲液(mix)。

5.乙肝病毒核酸裂解体系：

NaOH                100mmol/L

Tris-HCl(pH 8.0)    26mmol/L

EDTA                4mmol/L

TritonX-100         1.4％

NP-40               1.4％

6.实时荧光PCR反应液：

Tris-HCl(pH8.0)     50mmol/L

MgCl₂               3mmol/L

KCl                 50mmol/L

甲酰胺              3％

dATP                200uM

dGTP                200uM

dCTP                200uM

dUTP                200uM

dTTP                100uM

叠氮钠              0.25‰

引物PHBV1           0.25μmol/L

PHBV2               0.25μmol/L

荧光探针FPHBV       0.15μmol/L

配制成PCR反应液，于-20℃保存，每人份43.1ul。

7.实时荧光PCR反应体系：

PCR反应液           43.1ul

Taq酶(2.5U/μl)     0.8μl

UNG酶(1U/μl)       0.1μl

模板                6μl

                                  

总反应体积：        50μl

8.PCR程序

1  37℃                5min

2  93℃                2min

3  93℃                45s

4  55℃                1min

5  Go to 2，10 cycles

6  93℃                30s

7  55℃                45s

8  Go to 5  30 cycles，

在第七步采集荧光。

9  end

9.检测：

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光PCR仪进行检测。

10.结果判断：

1)阴性结果判定：如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值＝30，试验结果判断为阴性。

2)阳性结果判定：如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜30，则实验结果判为阳性；样品的病毒含量计算为：

若样品Qty＜5×102IU/ml则判样品的HBV-DNA含量＜5×102IU/ml，病毒含量仅供参考。

若样品5×102IU/ml≤Qty≤1×108IU/ml则判样品的HBV-DNA病毒含量IU/ml。

若样品Qty＞1×108IU/ml则判样品的HBV-DNA病毒含量＞1×108IU/ml，也可将该血清样本按10倍梯度做相应稀释，使其落在5×102IU/ml到1×108IU/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。

具体实施方式：

实施例1----乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测方法及其试剂盒

1、乙肝病毒实时荧光PCR诊断试剂盒组成

试剂盒由乙肝病毒裂解液，PCR缓冲液(mix)，一对特异性引物PHBV，一条特异性探针FHBV，Taq酶，UNG酶组成，乙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血血清，HBV定量标准品组成。

2.乙肝病毒特异性扩增基因序列为：

通过基因序列分析，我们选择其中的保守序列设计出一条特异性引物和一条特异性荧光探针。一对引物设计的Tm值接近，相差不到2℃。

1     GGCGTTTTAT  CATATTCCTC  TTCATCCTGC  TGCTATGCCT

41    CATCTTCTTG  TTGGTTCTTC  TGGACTACCA  AGGTATGTTG

81    CCCGTTTGTC  CTCT

针对乙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

PHBV1上游引物：5‘  GGCGTTTTAT  CATATTCCTC  TTCAT  3’  25bp

PHBV2下游引物：5‘  AGAGGACAAA  CGGGCAACAT  A  3’      21bp

FPHBV荧光探针：5‘FAM-CCTCATCTTC  TTGTTGGTTC  TTCTGG -TAMARA

                    3’26bp

乙肝病毒荧光检测试剂盒扩增序列为一段编码序列，全长94bp，在基因组中是单拷贝序列。

3.样品处理和模板DNA的提取

a)乙肝病毒核酸裂解液的配制：

NaOH                100mmol/L

Tris-HCl(pH 8.0)    26mmol/L

EDTA                4mmol/L

TritonX-100         1.4％

NP-40               1.4％

b)在0.25ml的PCR离心管中，加入4μl DNA裂解提取液，取待测血清样本以及试剂盒中的质控品(阴性质控品、强阳性质控品及临界阳性质控品、4个阳性标准品)各4μl加入，盖好管盖。

c)在99.9℃保温10分钟，4℃5分钟，用8联离心管离心机，3000-5000rpm离心1-2分钟。

4.荧光定量PCR扩增

a)实时荧光PCR反应液的配制：

Tris-HCl(pH8.0)  50mmol/L

MgCl₂            3mmol/L

KCl              50mmol/L

甲酰胺           3％

dATP             200uM

dGTP             200uM

dCTP             200uM

dUTP             200uM

dTTP             100uM

叠氮钠           0.25‰

引物PHBV1        0.25μmol/L

PHBV2            0.25μmol/L

荧光探针FPHBV    0.15μmol/L

配制成PCR反应液，于-20℃保存，每人份43.1ul。

b)实时荧光PCR反应体系：

从0.25ml的PCR离心管中取6μl上清液加入8排PCR离心管中用于PCR扩增。

PCR反应液         43.1ul

Taq酶(2.5U/μl)   0.8μl

UNG酶(1U/μl)     0.1μl

模板              6μl

                                

总反应体积：      50μl

c)PCR程序

1  37℃                5min

2  93℃                2min

3  93℃                45s

4  55℃                lmin

5  Go to 2，10 cycles

6  93℃                30s

7  55℃                45s

8  Go to 5  30 cycles，

在第七步采集荧光。

9    end

d)检测：

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光PCR仪进行检测。

e)结果判断：

1)阴性结果判定：如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值＝30，试验结果判断为阴性。

2)阳性结果判定：如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜30，则实验结果判为阳性；样品的病毒含量计算为：

若样品Qty＜5×102IU/ml则判样品的HBV-DNA含量＜5×102IU/ml，病毒含量仅供参考。

若样品5×102IU/ml≤Qty≤1×108IU/ml 则判样品的HBV-DNA病毒含量IU/ml。

若样品Qty＞1×108IU/ml则判样品的HBV-DNA病毒含量＞1×108IU/ml，也可将该血清样本按10倍梯度做相应稀释，使其落在5×102IU/ml到1×108IU/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。

实施例2----临床检测

用上述方法对135例临床样品进行检测，其中乙肝患者63例，检出阳性率99％，准确率98.4％，并且能够对乙肝病毒进行准确定量分析，远远优于酶联免疫和细胞培养法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对乙肝病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。此外，乙肝病毒碱裂解法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。

序列表

<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司

<120>乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR检测试剂盒

<160>4

<210>1

<211>94

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)

<400>1

ggcgttttat  catattcctc  ttcatcctgc  tgctatgcct  catcttcttg  ttggttcttc    60

tggactacca  aggtatgttg  cccgtttgtc  ctct                                  94

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性引物序列；

<400>2

ggcgttttat  catattcctc  ttcat    25

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性引物序列；

<400>3

agaggacaaa  cgggcaacat  a        21

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性荧光探针序列

     5’端连有荧光基团FAM，3’端连有泯灭基团TAMARA

<400>4

cctcatcttc  ttgttggttc  ttctgg    24

Claims (7)

1.一种乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法以及试剂盒组成。本法考察了人体乙肝病毒基因组全序列，并对检索所得HBV各个亚型序列进行同源性比较，针对其保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性双荧光探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因，实时采集荧光，并通过软件计算出样品的病毒含量。

2.采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA。在裂解过程结束后直接取部分裂解液若干加入PCR反应液进行扩增，以对乙肝病毒的定性定量检测。

3.按照权利要求1所述的乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增基因序列的反应体系为：实时荧光定量PCR反应体系：

PCR反应液          43.1μl

Taq酶(2.5U/μl)    0.8μl

UNG酶(1U/μl)      0.1μl

模板               6μl

                                    

总反应体积：       50μl

4、按照权力要求3所述的PCR反应液的配制：

Tris-HCl(pH8.0)    65mmol/L

MgCl₂              3mmol/L

KCl                50mmol/L

甲酰胺             3％

dATP               200μM

dGTP               200μM

dCTP               200μM

dμTP              200μM

dTTP               100μM

叠氮钠             0.25‰

引物PHBV1          0.25μmol/L

PHBV2              0.25μmol/L

荧光探针FPHBV      0.15μmol/L

配制成PCR反应液，于-20℃保存，每人份43.1μl。

4.按照权力要求3所述模板DNA的制备方法：

a)乙肝病毒核酸裂解液的配制：

NaOH                100mmol/L

Tris-HCl(pH 8.0)    26mmol/L

EDTA                4mmol/L

TritonX-100         1.4％

NP-40               1.4％

b)在0.25ml的PCR离心管中，加入4μl DNA裂解提取液，取待测血清样本以及试剂盒中的质控品(阴性质控品、强阳性质控品及临界阳性质控品、4个阳性标准品)各4μl加入，盖好管盖。

c)在99.9℃保温10分钟，4℃5分钟，用8联离心管离心机，3000-5000rpm离心1-2分钟。

d)从0.25ml的PCR离心管中取6μl上清液加入8排PCR离心管中用于PCR扩增。

5.按照权利要求1所述的乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于试剂盒包括以下成分：一对特异性引物PHBV、一条特异性荧光探针FPHBV、Taq酶、UNG酶、乙型肝炎病毒强阳性和临界阳性质控品、阴性质控品、HBV定量标准品、HBV核酸裂解液和PCR反应液。

6.按照权利要求1所述的乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：乙肝病毒特异性扩增基因序列为：

GGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTG

GTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCT

7.按照权利要求1所述的乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：针对乙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

上游引物PHBV1：5’-GGC GTT TTA TCA TAT TCC TCT TCA T-3’ 25bp

下游引物PHBV2：5’-AGA GGA CAAACG GGC AAC ATA-3    21bp

荧光探针FPHBV：

5‘FAM-CCT CAT CTT CTT GTT GGT TCT TCT GG-TAMARA-3’    26bp

乙肝病毒荧光检测试剂盒扩增序列为一段编码序列，全长94bp，在基因组中是单拷贝序列。