CN103773894B - 用于检测hcv的双重探针测定法 - Google Patents
用于检测hcv的双重探针测定法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于扩增和检测样品中的HCV靶核酸的方法,其中实施所述样品中核酸的扩增。此扩增牵涉聚合酶、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针。通过检测上文提及的探针与扩增子的所述不同序列部分的杂交引起对所得扩增子的检测。本发明进一步提供了用于扩增和检测HCV靶核酸的用途和试剂盒,其牵涉使用至少两种对扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针。
Description
发明领域
本发明属于体外诊断学领域。在此领域内,其关注使用至少两种对扩增子的不同序列部分特异性的探针扩增和检测可能存在于样品中的靶核酸,且特别是扩增和检测包括具有序列变异和/或个别突变的亚组的靶核酸。本发明进一步提供了含有至少两种对扩增子的不同序列部分特异性的探针的用途和试剂盒。
发明背景
在分子诊断学领域中,核酸的扩增和检测具有相当大的意义。核酸扩增和检测的诊断性应用的例子是病毒诸如人乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗病毒(WNV)的检测或者针对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)等的存在的献血常规筛选。此外,所述扩增技术适用于细菌性靶物,或对肿瘤学标志物或其它靶物的分析。
在物种内,微生物或病原体经常基于核酸序列变异依照独特的组、基因型或亚型分类(即,HCV、HIV、HPV、等)。不过,在体外诊断装置中,应当检出和/或正确量化所有组、基因型或亚型以避免假阴性诊断或错误滴度测定。这对用于例如检测HIV和HCV的分子诊断测定法提出相当大的挑战。此外,此类病原体的不断突变和重组在其靶核酸内产生越来越多的多样性,其也必须由分子诊断测定法覆盖。
最主要且广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和Qβ扩增,等等。
用于基于PCR的分析的自动化系统经常利用同一反应容器中PCR过程期间产物扩增的实时检测。此类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。
生物学样品中微生物核酸的检测例如对于识别个体的感染是至关重要的。由此,例如,对于用于检测病毒性感染的测定法的一项重要要求是包容性,其限定为使得必须避免由于病毒基因组上由突变引起的变异序列区所致的假阴性结果或滴度量化不足。与低病毒载量组合,相应基因组内可能不扩增和/或检出的突变或部分突变序列增强获得假阴性或错误量化结果的可能性。
已经发表了几种选项以提高分子测定法的包容性。最近,建立了病原体基因组内的两种不同且不交叠的靶序列的共扩增(US2010/0041040)。然而,若不能在病原体的基因组内鉴定两个适度保守的靶区域或若用于扩增和检测两个独立靶区域的寡核苷酸在主混合物中彼此干扰,则此方法一般不可适用。
在此背景中,例如,现有技术已经提供了用于扩增和检测的方法,其牵涉超过一种基于同质扩增子序列的探针,目的是提高测定法灵敏度(Yip等,2005,Clin.Chem.51(10))。
发明概述
本发明的一个方面是用于扩增和检测样品中靶核酸的方法,所述靶核酸包含具有序列变异和/或个别突变的亚组,其中实施所述样品中核酸的扩增。此扩增牵涉聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针。通过检测上文提及的探针与所述扩增子的所述不同序列部分的杂交引起对所得扩增子的检测。
本发明还涉及至少两种对同一扩增子的不同序列部分特异性的非交叠可检测核酸探针的用途。
此外,提供了用于扩增和检测可能存在于样品中的靶核酸的试剂盒,所述靶核酸包括具有序列变异和/或个别突变的亚组。试剂盒包含扩增试剂,该扩增试剂包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针。
发明详述
在第一个实施方案中,本发明涉及用于扩增和检测可能存在于样品中的靶核酸的方法,所述靶核酸包括具有序列变异和/或个别突变的亚组,所述方法包括下列步骤:
a)使来自所述样品的核酸与扩增试剂接触,所述扩增试剂包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针;
b)在一定条件下将所述核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述条件和时间足以发生扩增反应;
c)通过检测所述可检测探针与所述扩增子的所述不同序列部分的杂交来检测所述扩增子的存在或缺乏,
其中所述扩增子的存在指示所述样品中包括具有序列变异和/或个别突变的亚组的所述靶核酸的存在。
在本发明的一些实施方案中,上文描述的方法的一个或多个步骤是自动化的。在别的实施方案中,所有步骤是自动化的。与手动方法相比,自动化系统提供许多优点,特别是在体外诊断学领域中。使技术人员能够在启动方法后离开系统,如此缩短动手时间,并且为在相对较短时间段中的高样品通量提供基础,同时还提高结果的可再现性。这尤其但不仅在要尽可能快速筛选大量临床样品(诸如例如在血液库中)的情况中是一项重要的特征。
在本发明的上下文中,术语“扩增”一般指自靶核酸生成多个核酸分子,其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交,以提供聚合酶延伸的启动位点。可以通过本领域中一般已知的任何方法实施扩增,诸如但不限于:标准PCR、实时PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、逆转录PCR和等温扩增。
可以有利的是,实时监测扩增反应,即在扩增自身期间检测靶核酸和/或其扩增物。
如本文中使用的,术语“检测”指以评估样品中靶核酸的存在或缺乏为目的的测试。
“靶核酸”指核苷酸的聚合化合物,如本领域熟练技术人员已知的。“靶核酸”在本文中用于指样品中应当分析的核酸,即应当测定其在样品中的存在、不存在和/或量。靶核酸可以是基因组序列,例如特定基因的部分,或RNA。在其它实施方案中,靶核酸可以是病毒的或细菌的。靶核酸可以包含在扩增子区中具有独特序列变异或独特个别突变的亚组。这对于显示由于高突变或重组率及缺乏修复机制所致的重大遗传变异的病原体(如病毒)的核酸尤其如此。
术语“扩增子”指在扩增特定靶核酸后生成的多核苷酸分子(或共同地多个分子)。用于生成扩增子的扩增方法可以是任何合适的方法,最通常,例如PCR方法。扩增子通常但不排他是DNA扩增子。扩增子可以是单链的或双链的,或者任何浓度比率的其混合物。在本发明的一个实施方案中,扩增子由引物序列间具有异质序列的亚群构成。
上文所列的方法在一些实施方案中基于供体荧光模块和接受体荧光模块之间的荧光共振能量转移(FRET)。在这些实施方案中,对扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针是FRET探针。代表性的供体荧光模块是荧光素,而代表性的相应接受体荧光模块包括LC-红640、LC-红705、CY5、和CY5.5。通常,检测包括以供体荧光模块吸收的波长激发样品,并且显现和/或测量由相应的接受体荧光模块发射的波长。在上文描述的方法中,检测在一些实施方案中继之以定量FRET。在本发明的上下文中,术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“弗斯特(Foerster)共振能量转移”可以互换使用,指至少两种生色团(即供体生色团和接受体生色团(称为淬灭剂))之间的能量转移。在通过具有合适波长的光照射激发供体时,供体通常将能量转移至接受体。接受体通常以具有不同波长的光照射形式再发射转移的能量。在接受体是“黑暗”淬灭剂时,它以与光不同的形式耗散转移的能量。特定荧光团是起供体还是接受体作用取决于FRET对的另一成员的特性。常用的供体-接受体对包括FAM-TAMRA对。常用的供体是例如荧光素、香豆素、花青和罗丹明。常用的淬灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗淬灭剂包括BlackHole淬灭剂TM(BHQ)(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)、和BlackBerryTM淬灭剂650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。
FRET技术的一种常见形式利用形成HybProbe对的两种杂交探针。可以用不同荧光模块标记每种探针。探针一般设计为在靶DNA分子(例如扩增产物)中彼此极其接近地杂交。通过例如仪的光源以470nm激发供体荧光模块,如例如荧光素。在FRET期间,荧光素将其能量转移至接受体荧光模块,诸如例如-红640(-红640)或-红705(-红705)。然后,接受体荧光模块发射较长波长的光,其通过仪的光学检测系统检测。仅在荧光模块在直接局部接近性中(通常约1至5个核苷酸的距离)时且在供体荧光模块的发射光谱与接受体荧光模块的吸收光谱交叠时可以发生有效的FRET。发射信号的强度可以与初始靶核酸分子的数目相关联。在本发明的上下文中,如本领域技术人员也领会的,HybProbe对应当理解为功能性统一体及如此单一探针,因为此类对的两个成员必须一起使用。因此,HybProbe对的独特探针没有形成“对扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针”,即使它们在结合扩增子时不交叠。然而,例如两种或更多种HybProbe对在本发明的意义中是“对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针”,因为如上文描述的,HybProbe对应当理解为单一探针。
在上文描述的方法的一个实施方案中,对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针是HybProbe对。
此实施方案赋予几项优点。例如,由于此检测形式的探针不降解,可以通过监测其杂交的温度依赖性对每个HybProbe对实施解链曲线分析。如本领域技术人员知道的,解链曲线分析适合于确认结果或者甚至可提供比监测单一温度的杂交可以产生的信息更为详细的例如关于靶核酸身份的信息。
在系统上检测扩增子形成利用单链杂交探针(又称作“5’-核酸酶探针”)。术语“5’-核酸酶探针”指包含至少一种光发射标记模块,并且在5’-核酸酶反应中使用以实现靶核酸检测的寡核苷酸。在一些实施方案中,例如,5’-核酸酶探针仅仅包含单一光发射模块(例如荧光染料,等等)。在某些实施方案中,5’-核酸酶探针包含自身互补性的区域,使得探针能够在选定的条件下形成发夹结构。为了进一步例示,在一些实施方案中,5’-核酸酶探针包含至少两种标记模块,并且在将两种标记物之一切割或以其它方式与寡核苷酸分开后发射升高强度的照射。在某些实施方案中,用两种不同荧光染料(例如5’端报告物染料和3’端淬灭剂染料或模块)标记5’-核酸酶探针。在一些实施方案中,在与末端位置不同的一个或多个位置处标记5’-核酸酶探针,或者在末端位置外还在一个或多个位置处标记5’-核酸酶探针。在探针完整时,能量转移通常在两种荧光团间发生,使得至少部分淬灭来自报告物染料的荧光发射。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间,例如,通过例如Taq聚合酶或具有5’至3’核酸酶活性的另一种聚合物(如例如Z05聚合酶)的此活性切割与模板核酸结合的5’-核酸酶探针,使得不再淬灭报告物染料的荧光发射。例示性的5’-核酸酶探针记载于例如US5,210,015。在一些实施方案中,可以用两种或更多种不同报告物染料和3’端淬灭剂染料或模块标记5’-核酸酶探针。例如,以此形式使用的典型荧光染料是FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan500和CY5.5,等等。
在上文所描述的方法的一个实施方案中,对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针是5’-核酸酶探针。
可检测探针可以与双链扩增子的相同或不同链杂交。
在上文描述的方法的一些实施方案中,至少两种可检测探针与所述扩增子的不同链杂交。
在此情况中,就选择引物和探针序列及如此相应扩增子上的结合位点而言给技术人员提供升高的灵活性。例如,在由于寡核苷酸内的特定序列所致的二级结构形成的情况中,可能重要的是能够转换成不同序列及如此所述扩增子上的不同结合位点。此外,若可检测探针结合不同链,诸如第一探针结合双链扩增子的有义链,而第二探针结合反义链,则降低那些探针在其相应结合位点处彼此干扰的风险。
在上文描述的方法的别的实施方案中,至少两种可检测探针与所述扩增子的相同链杂交。
在所述后一种实施方案中,有可能杂交对扩增子中彼此极其接近的不同序列部分特异性的多种可检测探针。这由于相应外切核酸酶需要一些空间来结合和切割5’-核酸酶探针的情况而是令人惊讶的。但是,发明人已经显示了此类探针即使在彼此间距离仅几个碱基处也能与扩增子杂交。这使技术人员能够使用超过一种对独特序列部分特异性的可检测探针,各自针对相对较短长度的扩增子。依照上文描述的方法,即使靶核酸的短区段也能充当多种探针的合适靶物,如此赋予上文描述的益处,诸如例如信号增强和升高的针对遗传变异(如例如点突变)的耐受性。
如此,在上文描述的方法的一个实施方案中,对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针以彼此不超过100个碱基的距离,在一些实施方案中,彼此1、5、10、20、30、40或50个碱基至60、70、80、90、或100个碱基的距离与扩增子杂交。在一些实施方案中,距离是40至80、或50至70、或55至60个碱基,或者它是58个碱基。在此背景中,“距离”意指扩增子中在可检测探针与相同链杂交的情况中位于与它们杂交的那些扩增子碱基间的碱基数目。若它们与不同链杂交,则相应计算距离,其中双链扩增子的一条链的每个碱基在另一条链上具有与其形成碱基对的相应碱基。
在一些实施方案中,在基于循环的扩增技术(诸如PCR)的每个循环步骤后实施检测。在一些实施方案中,实时实施检测。通过使用商品化实时PCR仪(例如或),PCR扩增和扩增产物的检测可以以缩短相当大的循环时间在单个闭合小杯中组合。由于检测与扩增同时发生,因此实时PCR方法消除对操作扩增产物的需要,并且降低扩增产物间交叉污染的风险。在上文描述的两种检测形式中,发射信号的强度可以主要与初始靶核酸分子的数目相关联。
“样品”是可以进行诊断测定法的任何材料,并且一般指可能含有靶核酸的介质。在一些实施方案中,“样品”自生物学来源衍生。例如,样品可以是临床样品。在一些实施方案中,所述样品自人衍生,并且是体液。在本发明的一些实施方案中,样品是人全血或血清、血浆、尿液、痰、汗液、生殖器或口腔或鼻拭子、可移液的粪、溶解的组织样品、或脊髓液,等等。可以将样品移液或转化成可移液形式,使得术语“样品”包含同质或均质化液体,而且还有乳状液、悬浮液,等等。例如,样品也可以是进行增溶处理以提取和纯化核酸的最初固体样品(即,组织样品)。
如本文中使用的,“聚合酶”指能够从较小元件诸如核苷酸合成核酸的酶。在一些实施方案中,聚合酶是热稳定性聚合酶。术语“热稳定性聚合酶”指对热稳定的,热抗性的,并且保持足以实现随后多核苷酸延伸反应的活性,而且在受到升高的温度处理达对于实现双链核酸变性必需的时间时不被不可逆变性(失活)的酶。对于核酸变性必需的加热条件是本领域中公知的,并且在例如美国专利No.4,683,202、4,683,195、和4,965,188中例示。如本文中使用的,热稳定性聚合酶适合于在温度循环反应(诸如聚合酶链式反应(“PCR”))中使用。出于本文中的目的的不可逆变性指酶活性的永久且完全的丧失。对于热稳定性聚合酶,酶活性指催化核苷酸的组合以正确的方式形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。出于扩增目的,所述核苷酸以单体形式存在,因此,它们在本发明的上下文中又称为“核苷酸单体”。经常,例如,聚合酶(诸如例如热稳定性DNA聚合酶)使用的此类核苷酸单体是核苷三磷酸、或核苷四磷酸,等等。来自嗜热细菌的热稳定性DNA聚合酶包括例如来自海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属物种Sps17、栖热菌属物种Z05、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)、和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。
术语“引物”在本文中如本领域熟练技术人员已知的那样使用,指能够引发由模板依赖性DNA聚合酶进行的DNA合成的寡聚化合物,主要指寡核苷酸,但也指经修饰的寡核苷酸,即引物的3’端提供游离的3’-OH基团,可以通过建立3’至5’磷酸二酯连接的模板依赖性DNA聚合酶对所述游离的3’-OH基团附着其它核苷酸,其中使用三磷酸脱氧核苷且其中释放焦磷酸。
“探针”或“可检测探针”也指天然的或经修饰的寡核苷酸。如本领域中已知的,探针满足检测分析物或扩增物的目的。在本发明的上下文中,例如,可以使用探针来检测靶核酸和/或对照核酸的扩增物。出于可检测性的目的,探针通常携带标记物。
在方法的一些实施方案中,至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针携带相同类型的标记物,并且如此不能区别源自个别探针的信号。在其它实施方案中,它们携带发射不同波长信号的不同标记物,从而可以用合适的仪器区别来自至少两种探针的信号。
“标记物”(经常称为“报告基团”)一般是使与其结合的核酸,特别是寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸,以及任何核酸与样品的剩余部分可区别的基团。例如,在本发明的背景中有用的标记物是荧光标记物,其可以是荧光染料诸如例如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料、或香豆素染料。例如,在本发明的背景中有用的荧光染料是FAM、HEX、JA270、CAL635、香豆素343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-红640、LC-红705、TAMRA、或CY5。
在本发明的上下文中,任何引物和/或探针都可以是经过化学修饰的,即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。因而,探针或引物是经修饰的寡核苷酸。
如本领域技术人员已知的,术语“特异性”在引物和探针的背景中指对独特核酸“特异性”的引物或探针在严格条件下结合所述核酸。在一些实施方案中,本发明背景中使用的探针与扩增子的不同序列部分是至少80%相同的。在另一个实施方案中,探针序列包含选自下组的序列的至少12个连续核苷酸或其相应的互补核酸序列:SEQ ID NO1至8,而引物包含SEQ ID NO9至15的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中,选择的探针和/或引物序列由12至60个核苷酸,或者20至60个核苷酸,或者选自所述SEQ ID NO的精确序列或其互补核酸序列组成。技术人员理解,在本发明的意义中,形成功能性实体的探针对(诸如例如以形式使用的Hybprobe对)不是“至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针”。认为该对中的两种Hybprobe是一个单元,并且仅可以一起检出,而在本发明的背景中的至少两种探针之每种单独可检出。
此外,在本发明的上下文中,术语“交叠”意指两种或更多种寡核苷酸(特别是上文提及的至少两种可检测探针)包含相同(在与相同链结合时)或互补(在与不同链结合时)序列区段。在一些实施方案中,上文描述的方法中使用的探针不交叠,并且如此在对扩增子上的特定位点的结合中不竞争。在结合时,所述两种或更多种探针与所述扩增子的不同序列区段杂交。与交叠探针相比,本发明的上下文中使用的可检测探针是有利的。
术语“杂交”一般指其核苷酸序列一致的不同核酸分子间的碱基配对。术语“杂交”和“退火”可互换使用。
如在上文描述的方法中实施的,将两种或更多种针对同一扩增子的不同序列部分的探针导致显著降低的在定性测定法中获得假阴性结果的风险。此外,在定量测定法中,降低对例如病毒滴度定量不足的风险。由于升高的测定法包容性和稳健性,可以容易地使用最小数目的寡核苷酸检测并量化给定生物体内的多种不同基因型、亚型和突变体。在所述方面,情况可以是某种基因型、亚型或突变体不被所有至少两种可检测探针杂交。例如,在两种探针的情况中,一种可以由于靶扩增子的特定序列变体而不结合靶扩增子,而另一种对所述扩增子的不同序列部分特异性的探针仍能够与其相应的靶序列杂交。这样,扩增子的检测仍会是有可能的。在不同探针携带不同标记物的实施方案中,也可以有可能测定哪些探针杂交而哪些探针不然。
基于上文描述的方法的测试的生命周期得到延长,因为它能够甚至处理经由选择压力(例如由于新抗逆转录病毒药物所致)由微生物(诸如例如病毒)产生的新变体。鉴于病毒基因组内的高度突变,在上文描述的方法的一个实施方案中,所述靶核酸是病毒核酸。
通过应用上文描述的方法,定性测定法的总体包容性得到显著提高,并且使定量测定法中的滴度测定变化性最小化。
如技术人员已知,包容性的测量是以与没有显著偏离共有序列的标准隔离群等同的灵敏度检测携带突变的病毒亚组和隔离群。测定法的灵敏度是LOD(检测限),指样品中最低可检出的核酸量或浓度。低“LOD”对应于高灵敏度,且反之亦然。“LOD”通常依靠单位“cp/ml”(特别是在核酸是病毒核酸时),或者以IU/ml表述。“Cp/ml”意指“每毫升的拷贝”,其中“拷贝”是相应核酸的拷贝。IU/ml代表“国际单位/ml”,指WHO标准品。WHO标准品一般自具有与共有序列接近的基因组的标准隔离群建立。
一种用于计算LOD的广泛使用的方法是“Probit(概率单位)分析”,其是一种分析刺激物(剂量)和可数性(quantal)(全有或全无)响应之间关系的方法。在典型的可数性响应实验中,对动物组给予不同剂量的药物。记录每个剂量水平的百分比濒死。然后,可以使用Probit分析来分析这些数据。Probit模型假定百分比响应与对数剂量的关系呈累积正态分布。也就是说,可以使用对数剂量作为变量来从累积法线(cumulative normal)中读出百分比濒死。使用正态分布而不是其它概率分布,影响在可能的剂量的高和低末端处的预测响应率,但是接近中间具有很少的影响。
Probit分析可以以独特的“命中率”应用。如本领域中已知的,“命中率”通常以百分比[%]表示,并且指示在特定浓度的分析物时阳性结果的百分比。如此,例如,LOD可以以95%命中率测定,这意味着对真阳性样品的95%有效结果测定呈阳性的背景计算LOD。
上文描述的方法在检测丙肝病毒(HCV)的测定法中是特别有利的。如此,在上文描述的方法的一个实施方案中,靶核酸是HCV的核酸。
表述“丙肝病毒类型”指基于其基因组构造(例如系统发生分析)将丙肝病毒分类。将HCV隔离群分类成特定类型的范畴反映其与其它HCV隔离群的基因组相关性及其与其它HCV隔离群的相对较小的相关性。本文中使用的HCV分型命名与由Simmonds等(2005)“Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature of Hepatitis CVirus Genotypes”,Hepatology42,No.4:962-973修改并提出的广泛采用的命名一致。Simmonds等(2005)的系统将已知的HCV隔离群放入六(6)种HCV基因型之一,即基因型1到6。每种基因型进一步细分成称作亚型的分组,其反映相同基因型的株间的相关性。HCV亚型以基因型后的小写罗马字母书写,例如亚型1a、亚型1c、亚型6a,等等。个别隔离群内找到的遗传变体称作准种。全世界已知涵盖所有六种基因型的约100种HCV亚型。亚型的数目不是静态的,即随着对更多的HCV隔离群研究和测序,可能的是可以识识额外的亚型(及可能基因型)。
由于HCV是RNA病毒,本领域技术人员在实际扩增前通常将病毒RNA反转录成DNA。在此类情况中,扩增试剂包含逆转录酶或具有逆转录酶活性的聚合酶。
适合于与RNA模板退火的引物也可能适合于PCR扩增。对于PCR,与逆转录的cDNA链互补的第二引物为延伸产物的合成提供启动位点。
在通过DNA聚合酶扩增RNA分子中,第一延伸反应是使用RNA模板的逆转录,并且生成DNA链。使用DNA模板的第二延伸反应生成双链DNA分子。如此,通过DNA聚合酶自RNA模板合成互补的DNA链为扩增提供起始材料。
可以在偶联的单酶逆转录/扩增反应中使用热稳定性DNA聚合酶。在此上下文中,术语“一步实时PCR”可以指在靶核酸是DNA时没有逆转录步骤的反应或在靶核酸是RNA时包含逆转录步骤的反应。“一步实时PCR”意指在逆转录(RT)步骤之后,在扩增步骤前不需要打开反应容器或以其它方式调节反应组分。在非一步实时PCR反应中,在逆转录后且在扩增前,例如,调节、添加、或稀释一种或多种反应组分诸如扩增试剂,对此,必须打开反应容器,或者至少必须操作其内容物。本发明的范围包括一步实时PCR和非一步实时PCR实施方案两者。
在本发明的一个实施方案中,防止源自早期PCR反应的扩增产物诸如扩增子和高分子量产物(聚合的扩增子)的遗留物污染。通用的且有效的防止遗留物污染的方式牵涉使用尿嘧啶-DNA糖基化酶或尿嘧啶-N-糖基化酶,缩写为“UDG”或“UNG”(EC3.2.2.3)。这些包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶识别存在于单链或双链DNA中的尿嘧啶,并且切割尿嘧啶碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键,留下无碱基位点,参见例如US6.713.294。如本文中的例子显示,在采用包含至少两种选自下组的序列或由该序列组成的探针时实现在检测HCV核酸中的特别良好的性能:SEQ ID NO1至8或其相应的互补物。因此,本发明的一个方面是用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的方法,所述方法包括下列步骤:
a)使来自所述样品的核酸与扩增试剂接触,所述扩增试剂包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针,其中所述至少两种可检测探针包含至少两种选自下组的序列:SEQ ID NO1至8或其相应的互补物;
b)在一定条件下将所述核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述条件和时间足以发生扩增反应;
c)通过检测所述可检测探针与所述扩增子的所述不同序列部分的杂交来检测所述扩增子的存在或缺乏,
其中所述扩增子的存在指示所述样品中HCV的存在。
在上文描述的方法的别的实施方案中,所述至少两种可检测探针包含SEQ ID NO6和8,在又一个实施方案中,扩增试剂不含除SEQ ID NO6和8外的别的HCV特异性探针。
在本发明的一个实施方案中,上文提及的方法中的引物包含至少一种选自下组的序列:SEQ ID NO9至15。所述引物特别可用于创建用上文提及的探针可检出的扩增子。在另一个实施方案中,上文提及的方法中的引物由SEQ ID NO9、10、和11组成。
还有,本发明的一个方面是上文描述的方法,其中所述引物包含超过一种正向和/或反向引物。在这些引物生成通过上文提及的探针可检出的变异的交叠扩增子时,此类排列可以是特别有用的。在超过一种正向和/或反向引物的情况中,在一些实施方案中,相应的正向和/或反向引物是交错的,即它们就与其杂交的模板序列而言交叠。此类交错的格局进一步促成升高的对遗传变体诸如HCV基因型和/或亚型的覆盖。
上文提及的引物和探针在上文所列方法中的组合特别可用于检测相当多的HCV基因型。在一个实施方案中,上文描述的方法是用于同时检测可能存在于样品中的HCV基因型1、2、3、4、5、和6的方法。在别的实施方案中,上文描述的方法是用完全匹配的第一探针检测基因型1、2、3、和5(子集1)及用完全匹配的第二探针检测基因型1、2、4、和6(子集2)的方法。在别的实施方案中,所述方法是用于检测亚型1a、1b、2a、2b及在一些实施方案中别的亚型的方法。在又一个实施方案中,上文描述的方法是用于同时检测可能存在于样品中的HCV的基因型1、2、3、4、5、和6及亚型1a、1b、2a、2b及在一些实施方案中别的亚型的方法。
本发明的别的方面是上文描述的方法,其进一步包括在步骤a)前的下列步骤:
i)在一定条件下将固体支持物和所述样品组合在一起一段时间,所述条件和时间足以容许包含所述靶核酸的核酸在所述固体支持物上固定化;
ii)在分离站中将所述固体支持物与样品中存在的其它材料分离;
iii)通过将样品与固体支持物分开,并用清洗缓冲液将固体支持物清洗一次或多次在分离站中纯化核酸。
在本发明的背景中,如本文中使用的,术语“固体支持物”指能够通过吸附直接且非特异性,或者间接且特异性与分析物结合的任何类型的固体支持物。间接结合可以是分析物与固体支持物上固定化的抗体的结合,或者标签与标签结合化合物的结合,例如6xHis标签与Ni螯合物的结合。在分析物是核酸时,此类间接结合可以通过结合与感兴趣核酸的靶序列同源的捕捉核酸探针进行。如此,使用固体支持物上附着的捕捉探针,可以将靶分析物或靶核酸与非靶材料或非靶核酸分开。在固体支持物上固定化此类捕捉探针。固体支持物材料可以是聚合物,或聚合物的组合物。其它类型的固体支持物材料包括磁性硅土颗粒、金属颗粒、磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维滤器、滤纸,等等,而固体支持物材料不限于这些材料。
“固定化”在本发明的上下文中意指以可逆或不可逆的方式捕捉对象诸如核酸。具体地,“在固体支持材料上固定化”意指出于将其与任何周围介质分开的目的,使一种或多种对象与固体支持材料结合,并且可以例如通过在后来的点时与固体支持材料分开来回收。在此上下文中,“固定化”可以例如包括将核酸吸附至玻璃或固体材料的其它合适的表面,如上文所描述的。此外,可以通过结合捕捉探针来特异性“固定化”核酸,其中核酸通过碱基配对而结合附着于固体支持物的、基本上互补的核酸。在后一种情况中,这类特异性固定化导致靶核酸的优势结合。
“分离站”是分析系统中允许固体支持物自样品中存在的其它材料分离的一种装置或组件。这类分离站可以例如包括但它不限于这些组件,离心机、过滤管架、磁体、或其它合适的组件。在一些实施方案中,分离站包含一个或多个磁体。在某些实施方案中,使用一个或多个磁体来分离作为固体支持物的磁性颗粒,诸如例如磁性玻璃颗粒。如果例如样品和固体支持材料在多孔板的孔中组合在一起,那么分离站包含的一个或多个磁体可以例如通过将磁体引入孔中来与样品自身接触,或者可以使所述一个或多个磁体靠近孔的外壁以吸引磁性颗粒,随后将它们与周围液体分开。
在本发明的意义中,核酸的“纯化”、“分离”或“提取”指如下的情况:可以在诊断测定法中例如通过扩增分析核酸前,通常必须从含有不同组分的复杂混合物的生物学样品中将它们纯化、分离或提取。对于第一步,可以使用允许核酸富集的方法。
“清洗缓冲液”是设计为除去不期望的组分(尤其在纯化规程中)的流体。这类缓冲液是本领域中公知的。在核酸纯化背景中,清洗缓冲液适于清洗固体支持材料以将固定化的核酸与任何不想要的组分分开。清洗缓冲液可以例如在如上文所描述的具有酸性pH且没有乙醇和/或离液剂的一种或多种缓冲溶液中含有乙醇和/或离液剂。清洗溶液或其它溶液经常以储备溶液提供,所述储备溶液在使用前必须稀释。
总之,通过应用上文描述方法的步骤i)至iii),分开可能存在于样品中的包含靶核酸的核酸与样品的剩余部分,使得降低所述样品中任何潜在的干扰性物质抑制随后步骤的风险。
对于下游分析,随后,可以例如依靠合适的洗脱缓冲液自固体支持物洗脱核酸。此类洗脱缓冲液可以例如是蒸馏或去离子水或水性盐溶液,诸如例如Tris缓冲液,如TrisHCl、或HEPES、或熟练技术人员已知的其它合适的缓冲液。
在一些实施方案中,固体支持物在扩增和在一些实施方案中还有检测期间存在于扩增反应混合物中。
在上文描述的方法的一些实施方案中,将对照核酸添加至样品和/或纯化的核酸。
所述对照核酸在一些实施方案中是定性对照核酸,而在其它实施方案中是定量对照核酸,或这两者。
样品中核酸的定性检测对于例如识别个体感染是至关重要的。由此,用于检测例如病毒性感染的测定法的一个重要的要求是避免假阴性或假阳性结果,因为这类结果几乎会不可避免地导致就相应患者的治疗而言的严重后果。因此,特别是在基于PCR的方法中,向检测混合物添加定性内部对照核酸。所述对照对于确定测试结果的有效性是特别重要的:至少在就相应的靶核酸而言阴性结果的情况中,定性内部对照反应在特定背景内必须表现为反应性的,即必须检测出定性内部对照,否则认为该测试自身是无效的。然而,在定性设置中,在阳性结果的情况中没有必要必须检出所述定性内部对照。对于定性测试,特别重要的是,保证反应的灵敏度,并且因此对其严格控制。因此,定性内部对照的浓度必须相对较低,从而即使在例如略微抑制的情况中,没有检测出定性内部对照,并且因此该测试是无效的。
如此,在上文描述的方法的一个实施方案中,即使在缺乏所述靶核酸的扩增产物的情况中,所述对照核酸的扩增产物的存在指示在反应混合物中发生扩增。
另一方面且在仅检测样品中核酸的存在或缺乏外,经常重要的是测定所述核酸的数量。举例而言,可以基于病毒载量评估病毒性疾病的阶段和严重性。此外,监测任何疗法需要关于个体中存在的病原体数量的信息以评估疗法的成功与否。
因此,本发明的一个方面是上文描述的方法,其进一步包括如下步骤,即在步骤c)后和/或期间测定包含具有序列变异和/或个别突变的亚组的靶核酸的数量。
例如,使用HCV RNA病毒载量测试作为管理慢性丙肝患者中的辅助,其通过评估治疗响应并做出临床决定(例如关于治疗持续时间)进行。针对慢性丙肝的疗法的主要目的是通过实现持续的病毒学响应根除HCV,例如在单独或与别的药物诸如利巴韦林(ribavirin)和/或博赛泼维(boceprevir)或特拉普韦(telaprevir)组合用药物如PEG干扰素α-2治疗的情况中。上文描述的方法提供了病毒载量测定法,其可靠检测并量化HCV RNA,导致改善的治疗上(on-treatment)监测。
对于定量测定法,有必要引入定量标准核酸,其充当用于测定靶核酸的绝对数量的参照物。如此,将定量内部对照核酸添加至检测混合物。所述对照对于量化测试结果,而且对于确认测试结果的有效性是特别重要的:就相应的靶核酸而言在阴性和阳性结果的情况中必须检出定量内部核酸。定量内部对照反应在给定背景中必须表现为反应性的或者否则认为测试自身是不起作用的。可以通过参照外部校准或者通过执行内部定量标准品实现定量。
下文中描述了如何基于充当定量标准品核酸的内部对照核酸实施在系统上生成的信号的定量结果计算的例子:从来自整个PCR运行的、经仪器校正的荧光值的输入数据计算滴度。含有靶核酸和充当定量标准核酸的内部对照核酸的一组样品在热循环仪上使用规定温度概况经历PCR。在PCR概况期间选定的温度和时间,通过过滤光照明样品,并且对每份样品针对靶核酸和内部对照核酸收集过滤荧光数据。在完成PCR运行后,处理荧光读数以产生内部对照核酸的一组染料浓度数据和靶核酸的一组染料浓度数据。以相同方式处理每组染料浓度数据。在数次似真性检查后,对内部对照核酸和靶核酸计算肘值(elbow value)(CT)。肘值定义为靶核酸或内部对照核酸的荧光与预定阈值(荧光浓度)相交的点。滴度测定基于如下的假定,即靶核酸和内部对照核酸以相同的效率扩增,且在计算的肘值,扩增并检测相等量的靶核酸和内部对照核酸扩增子拷贝。因此,(ctQS–ct靶物)对对数(靶物浓度/QS浓度)呈线性。在此上下文中,QS表示充当定量标准核酸的内部对照核酸。然后,可以例如通过使用如下述等式中的多项式校正式计算滴度T:
浓度靶物=浓度QS·10(a·(ctQS–ct靶物)2+b·(ctQS–ct靶物)+c)
已知多项式常数和定量标准核酸的浓度,因此该等式中唯一的变量是差(ctQS–ct靶物)。
如本领域技术人员已知的,用于表征良好定量测定法的重要数值是例如测定法的线性或线性范围(通过定量靶材料的稀释系列及随后所得曲线的线性回归确定)、准确度(名义和实验测定/分配数值之间的关联)、包容性(基因型/亚型/突变体/隔离群的等同且精确量化)和精确性(使用自线性研究产生的数据通过方差分量分析确定的log10转化浓度结果的标准偏差)。
对于定量和定性测试两者,如分析灵敏度(上文在LOD的背景中描述)或特异性(避免由于非特异性检测所致的假阳性结果)等特性也是重要的参数。在本文中的例子中显示了上文描述的方法就包容性而言展现改善的特性,如上文讨论的。
与如上文讨论的方法的优点一致,本发明的另一个方面是至少两种可检测核酸探针用于扩增和检测可能存在于样品中的靶核酸的用途,所述靶核酸包含具有序列变异和/或个别突变的亚组,其中所述可检测核酸探针对同一扩增子的不同序列部分是特异性的。
在上文描述的用途的一些实施方案中,所述可检测探针不交叠。
在别的实施方案中,上文描述的用途是至少两种可检测核酸探针用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的用途,其中所述可检测核酸探针对同一扩增子的不同序列部分是特异性的,且其中所述可检测探针包含至少两种选自下组的序列:SEQ ID NO1至8或其相应的互补物。
在上文描述的用途的别的实施方案中,所述至少两种可检测探针包含SEQ ID NO6和8,在又一个实施方案中,试剂盒不含除SEQ ID NO6和8外的别的HCV特异性探针。
本发明进一步提供了用于扩增和检测可能存在于样品中的靶核酸的试剂盒,所述靶核酸包含具有序列变异和/或个别突变的亚组,所述试剂盒包含扩增试剂,其包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针。
在上文描述的试剂盒的一些实施方案中,所述可检测探针不交叠。
在一个实施方案中,上文提及的试剂盒是用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的试剂盒,所述试剂盒包含扩增试剂,其包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针,其中所述可检测探针包含至少两种选自下组的序列:SEQ ID NO1至8或其相应的互补物。
在上文描述的试剂盒的别的实施方案中,所述至少两种可检测探针包含SEQ IDNO6和8,在又一个实施方案中,试剂盒不含除SEQ ID NO6和8外的别的HCV特异性探针。
上文描述的试剂盒的可检测探针可以与双链扩增子的相同或不同链杂交。
在上文描述的方法的一些实施方案中,至少两种可检测探针与所述扩增子的不同链杂交。在别的实施方案中,至少两种可检测探针与所述扩增子的相同链杂交。
在上文描述的试剂盒的另一个实施方案中,对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针以彼此不超过100个碱基的距离,在一些实施方案中,彼此1、5、10、20、30、40或50个碱基至60、70、80、90、或100个碱基的距离与扩增子杂交。在一些实施方案中,距离是40至80、或50至70、或55至60个碱基,或者它是58个碱基。在此背景中,“距离”意指扩增子中在可检测探针与相同链杂交的情况中位于与它们杂交的那些扩增子碱基间的碱基数目。若它们与不同链杂交,则相应计算距离,其中双链扩增子的一条链的每个碱基在另一条链上具有与其形成碱基对的相应碱基。
在本发明的一个实施方案中,上文描述的试剂盒的引物包含超过一种正向和/或反向引物。
在本发明的一个实施方案中,上文提及的试剂盒中的引物包含至少一种选自下组的元件:SEQ ID NO9至15。所述引物特别可用于创建用上文提及的探针可检出的扩增子。在另一个实施方案中,上文提及的试剂盒中的引物由SEQ ID NO9、10、和11组成。
所述用途和所述试剂盒的优点类似于上文在依照本发明的方法的背景中进一步描述的。
附图简述
图1:测试的探针的概述
图2:使用HCV基因型1a和天然存在的突变体隔离群(Lindauer)的HCV RNA转录物评估探针SEQ ID NO1至5
图3:使用HCV基因型1a和4a血浆样品评估非交叠探针SEQ ID NO3、4、7和8
图4:使用HCV基因型1a(共有)和两种天然存在的突变体隔离群(Jody,Lindauer)的转录物RNA评估非交叠探针SEQ ID NO3、4、7和8
图5:使用HCV基因型1a和7种不同天然存在的突变体隔离群的HCV RNA转录物相对于没有第二探针的主混合物(RL1.1)最终评估探针SEQ ID NO8。
图6:使用一份患者HCV GT1a和三份GT4a样品相对于参照主混合物RL1.1对探针SEQ ID NO8(35%、50%和65%添加)的浓度优化。
附图详述
图1:为补充初始探针SEQ ID NO6而测试的探针的示意性概述。具有SEQ ID NO6、9、10和11的引物和探针属于参照主混合物RL1.1,并且存在于所有实验中。
图2:用含有10%额外的或50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ IDNO6的浓度)的主混合物对两种HCV RNA转录物(即HCV基因型1a的对照转录物和在扩增子的探针结合区中具有两处天然存在的突变的转录物(Lindauer))评估滴度(cp/mL)。对于参照主混合物RL1.1,条形1和2及条形3和4代表相同的实验,只是主混合物中不含额外的探针。第二参照物是具有增加浓度的标准探针SEQ ID NO6(10%和50%),但没有第二探针的RL1.1。SEQ ID NO2、3、4、和5的添加提高对错配转录物测定的浓度。注意SEQ ID NO1和1*、2和2*、3和3*及5和5*分别序列相同的,但是含有不同标记物(还可见图1)。
图3a:用含有50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ ID NO6的浓度)的主混合物评估HCV GT1a和HCV GT4a血浆样品的靶物ct值。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQ ID NO6。第二参照物是具有50%增加浓度的标准探针SEQ ID NO6,但没有第二探针的RL1.1。低靶物ct指示早期样品识别;ΔCt值3.3指示10倍滴度差异。探针SEQ ID NO3、4、和7的添加略微降低在GT1a和/或GT4a中的性能,因为ct值增加。对SEQ ID NO8观察到最佳的性能。
图3b:用含有50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ ID NO6的浓度)的主混合物对HCV GT1a和HCV GT4a血浆样品评估最后一次PCR循环时的荧光信号。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQ ID NO6。第二参照物是具有50%增加浓度的标准探针SEQ IDNO6,但没有第二探针的RL1.1。高相对荧光指数(RFI)指示有效的扩增和信号产生。SEQ IDNO4和7的添加降低在GT1a和GT4a中的性能,因为RFI降低。对SEQ ID NO8观察到最佳的性能。
图4a:用含有50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ ID NO6的浓度)的主混合物对三种HCV RNA转录物,即HCV基因型1a的对照转录物和2种在扩增子的探针结合区中具有天然存在的突变的转录物评估靶物ct值。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQID NO6。第二参照物是具有50%增加浓度的标准探针SEQ ID NO6,但没有第二探针的RL1.1。低靶物ct指示样品的早期识别;Ct值的差异3.3指示10倍滴度差异。SEQ ID NO3、4和7的添加显示针对突变体转录物的性能略微升高,因为ct值降低。对SEQ ID NO8观察到最佳的性能。
图4b:用含有50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ ID NO6的浓度)的主混合物对三种HCV RNA转录物(即HCV基因型1a的对照转录物和2种在扩增子的探针结合区中具有天然存在的突变的转录物)评估最后一次PCR循环时的荧光信号。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQ ID NO6。第二参照物是具有50%增加浓度的标准探针SEQ IDNO6,但没有第二探针的RL1.1。高相对荧光指数(RFI)指示有效的扩增和信号产生。SEQ IDNO3、4和7的添加没有显示关于突变体转录物中RFI的改善。对SEQ ID NO8观察到明显的改善。
图5:用含有50%额外的第二探针(相对于RL1.1中标准探针SEQ ID NO6的浓度)的主混合物对9种HCV RNA转录物(即HCV基因型1a的对照转录物和在扩增子的探针结合区中具有天然存在的突变的转录物)评估滴度(cp/mL)。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQID NO6。与参照物RL1.1相比,SEQ ID NO8的添加将所有错配转录物的浓度(具有标准探针下的错配)提高多至大于100倍。
图6a:用含有35%、50%和65%额外探针SEQ ID NO8(相对于RL1.1中标准探针SEQ IDNO6的浓度)的主混合物对1份HCV GT1a和3份HCV GT4a血浆样品评估靶物ct值。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQ ID NO6。低靶物ct指示早期样品识别;ΔCt值3.3指示10倍滴度差异。SEQ ID NO8的所有三种浓度类似运行。
图6b:用含有35%、50%和65%额外探针SEQ ID NO8(相对于RL1.1中标准探针SEQ IDNO6的浓度)的主混合物对1份HCV GT1a和3份HCV GT4a血浆样品评估最后一次PCR循环时的荧光信号。参照主混合物RL1.1仅含有一种探针SEQ ID NO6。高相对荧光指数(RFI)指示有效的扩增和信号产生。对添加50%第二探针SEQ ID NO8获得最好的结果。
实施例
通用实验设计
在等同的实验条件下实施所有实验。包含标准探针SEQ ID NO6的基本主混合物组合物在所有实验中是相同的,并且称作主混合物RL1.1。给RL1.1补充额外的50%初始探针SEQ ID NO6或额外探针之一(SEQ ID NO1-5、7、或8),依照本发明,一次评估一种。以相同浓度(初始探针SEQ ID NO6的10%或50%)个别添加并评估每种探针。不同第二探针与标准探针SEQ ID NO6部分交叠或者不交叠。一些探针与标准探针SEQ ID NO6在同一条链上定位,一些在相反链上定位。
在所有实验中,测试没有第二探针的主混合物RL1.1作为参照物(对照1)及具有10%或50%增加浓度的初始探针SEQ ID NO6的主混合物(对照2)。使用相同样品制备概况、热循环概况和结果解读参数来评估不同主混合物。作为样品,在各10个重复中使用并测试天然的HCV GT1a和GT4a样品,或者在4至6倍重复中测试HCV5’非翻译区的转录物。图中呈现了重复间的均值和标准偏差。
在初始实验中,使用代表标准GT1a的HCV转录物和代表探针区中错配隔离群的转录物评估探针SEQ ID NO1-5。SEQ ID NO2、3、4、和5显示最好的初始性能。与另外设计的探针SEQ ID NO7和8一起进一步评估SEQ ID NO3和4。SEQ ID NO8在所有实验中显示最好的性能。使用9种不同转录物的最终评估表明第二探针的添加对携带错配的转录物将观察到的滴度显著提高多至大于100倍,所述9种不同转录物代表HCV基因型1a的对照转录物和在扩增子的探针结合区中具有天然存在的突变的转录物。
实施例1:
样品材料:
测试HCV亚型1a(其代表标准HCV样品)和HCV亚型4a(其代表在标准探针结合区中具有可能的序列变异的HCV样品)的HCV患者样品以检查将第二探针添加至主混合物的效果。使用代表HCV GT1a共有序列的HCV RNA转录物和扩增子区中天然存在的HCV隔离群的5’非翻译区的转录物来评估不同的第二探针。
核酸提取:
使用每个反应1ml患者血浆样品材料进行核酸提取。若使用转录物,则将约500cp/ml(对于图2、3a和3b中显示的实验)或约50000cp/ml(对于图4a、4b和5中显示的实验)添加至含有硫氰酸胍的缓冲液以使RNA酶失活,然后以与正常样品相同的方式加工1ml。在每个实验中测试患者样品的5至10个重复和转录物样品的4至6个重复。
核酸提取方法是现有技术,并且是熟练技术人员已知的(参见例如Sambrook等,第2版1989,部分1-3,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984))。或者,可以使用商品化核酸提取试剂盒,即高纯病毒核酸试剂盒(RocheDiagnostics)或AmpliPrep总核酸分离试剂盒(TNAI)(Roche Diagnostics)。
在本文描述的实验中,核酸提取基于AmpliPrep总核酸分离试剂盒(TNAI)(Roche Diagnostics)。标本制备试剂由磁性玻璃颗粒悬浮液、裂解试剂、蛋白酶试剂、洗脱缓冲液和清洗试剂组成。在核酸提取前将定量标准品RNA添加至标本。通过与蛋白酶和离液序列高的(chaotropic)裂解/结合缓冲液一起温育裂解装甲的HCV颗粒和定量标准品RNA装甲颗粒,这释放核酸,并且保护释放的HCV RNA免于血清或血浆中的RNA酶。随后,将HCV RNA和定量标准品RNA结合至磁性玻璃颗粒。通过清洗磁性颗粒除去未结合的物质诸如盐、蛋白质和其它细胞杂质。于升高的温度用水性缓冲液洗脱吸附的核酸。
PCR反应混合物:
评估的主混合物由补充有不同探针的参照主混合物RL1.1组成。大批准备参照主混合物RL1.1。对于每个实验,此主混合物补充有额外的10%或50%的标准探针SEQ ID NO6或额外的10%或50%的要评估的个别第二探针,如图2-6中规定的。
主混合物组合物RL1.1:
化学品 | 浓度 |
Tricine | 157mM |
乙酸钾 | 314mM |
DMSO | 15,8% |
叠氮化纳 | 0.09% |
甘油 | 14,4% |
氢氧化钾 | 36.9mM |
dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP) | 各1.29mM |
正向引物SEQ ID NO9 | 2.14μM |
反向引物SEQ ID NO10 | 1.07μM |
反向引物SEQ ID NO11 | 1.07μM |
靶探针SEQ ID NO6 | 428nM |
第二探针SEQ ID NO1-5、7或8* | 43nM(10%)或214nM(50%) |
QS探针SEQ ID NO16 | 428nM |
ZO5聚合酶 | 2280KU/L |
UNG | 114KU/L |
适体§ | 860nM |
pH | 7.8 |
*每个实验中的不同第二探针;实验中的不同浓度来获得图6的数据。
§适体是短的、单链DNA或RNA寡核苷酸(25-70个碱基),其经由其3D结构结合特定分子(即,蛋白质ZO5)(参见例如C.Tuerk and L.Gold:Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase,Science,卷249,1990,第505页-第510页)。
将50μL含有核酸的洗脱液添加至PCR管中的35μL主混合物和15μL18mM乙酸锰,并加载到48分析仪上。
PCR反应:
应用以下热循环步骤:
持续时间 | 温度 | 重复 |
5分钟 | 50℃ | 1 |
30分钟 | 66℃ | 1 |
15秒 | 95℃ | 52 |
25秒 | 58℃ | 52 |
2分钟 | 40℃ | 1 |
数据分析:
将作为来自的结果获得的样品重复间的滴度、ct值或相对荧光指数(RFI)取平均值,并将均值及标准偏差以柱形图绘图,如图2-5中显示的。通过i)相对于参照主混合物的滴度增加,或者ii)相对于参照主混合物的ct值降低以及RFI升高评估探针的正效应。
实施例2:
也可以如下实施本文呈现的实验:使用商品化AmpliPrep/HCV测试(由Roche制造)来从患者和转录物样品提取HCVRNA。使用AmpliPrep仪器使标本制备自动化,并使用 分析仪或48分析仪使扩增/检测自动化。该测试基于三个主要过程:(1)在AmpliPrep仪上制备标本以从二级管中提供的人EDTA血浆或血清和对照分离RNA;(2)逆转录靶RNA和定量标准品/内部对照RNA以生成互补DNA(cDNA)及(3)在分析仪上PCR扩增靶cDNA和定量标准品/内部对照cDNA及通过切割对靶物及对定量标准品/内部对照特异性的双重标记检测探针来同时检测生成的扩增子。
标本制备试剂由磁性玻璃颗粒悬浮液、裂解试剂、蛋白酶试剂、洗脱缓冲液和清洗试剂组成。通过与蛋白酶和离液序列高的裂解/结合缓冲液一起温育裂解HCV颗粒及定量标准品/内部对照颗粒,这释放核酸,并且保护释放的HCV RNA免于血清或血浆中的RNA酶。随后,将HCV RNA和定量标准品RNA结合至磁性玻璃颗粒。通过清洗磁性颗粒除去未结合的物质诸如盐、蛋白质和其它细胞杂质。于升高的温度用水性缓冲液洗脱吸附的核酸。将标本或对照洗脱液添加至主混合物,并转移至分析仪或 48分析仪,用于扩增和检测。
对于本文呈现的实验,通过依照下文显示的表的主混合物且另外通过依照下文给予的信息添加不同第二探针替换AmpliPrep/ HCV测试主混合物。在AmpliPrep仪上使用具有修改的主混合物的试剂盒。主混合物含有对HCVRNA和定量标准品/内部对照RNA两者特异性的引物和探针对。HCV靶物和定量标准品/内部对照共享引物结合位点。引物和靶探针在HCV基因组的5’非翻译区的高度保守部分中定位。使用靶物特异性和定量标准品特异性双重标记寡核苷酸探针实施对HCV靶物和定量标准品的检测,所述探针容许独立鉴定HCV靶物扩增子和HCV定量标准品扩增子。HCV定量标准品由AmpliPrep以已知的拷贝数自动添加至每份标本,并与HCV靶物一起在整个标本制备、逆转录、扩增和检测步骤中维持。定量标准品必须在HCV靶物阴性和阳性标本中给出阳性信号以实现滴度测定。在部分阻抑或抑制的反应中,定量标准品与靶物类似地受到影响,并且如此容许校正滴度测定。最后,定量标准品对HCV靶物阴性反应监测抑制效应,但是由于其相当高的浓度,监测不是严格的。
主混合物组合物RL1.1:
化学品 | 浓度 |
Tricine | 157mM |
乙酸钾 | 314mM |
DMSO | 15,8% |
叠氮化纳 | 0.09% |
甘油 | 14,4% |
氢氧化钾 | 36.9mM |
dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP) | 各1.29mM |
正向引物SEQ ID NO9 | 2.14μM |
反向引物SEQ ID NO10 | 1.07μM |
反向引物SEQ ID NO11 | 1.07μM |
靶探针SEQ ID NO6 | 428nM |
第二探针SEQ ID NO1-5,7或8* | 43nM(10%)或214nM(50%) |
QS探针SEQ ID NO16 | 428nM |
ZO5聚合酶 | 2280KU/L |
UNG | 114KU/L |
适体 | 860nM |
pH | 7.8 |
*每个实验中的不同第二探针;实验中的不同浓度来获得图6的数据。
§适体是短的、单链DNA或RNA寡核苷酸(25-70个碱基),其经由其3D结构结合特定分子(即,蛋白质ZO5)(参见例如C.Tuerk and L.Gold:Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase,Science,卷249,1990,第505页-第510页)。
大批制备没有第二探针的参照主混合物RL1.1。对于每个实验,此参照主混合物补充有额外的探针,如图中显示的。将这些补充的主混合物变化填入试剂盒,并加载至AmpliPrep上。
数据分析:
将作为来自的结果获得的样品重复间的滴度、ct值或相对荧光指数(RFI)取平均值,并将均值及标准偏差以柱形图绘图,如图2-5中显示的。通过i)相对于参照主混合物的滴度增加,或者ii)相对于参照主混合物的ct值降低以及RFI升高评估探针的正效应。
结果:
1.SEQ ID NO8在总体上实现最好的结果。在使用9种不同转录物(即1种GT1a参照转录物和8种在SEQ ID NO6的探针结合区中具有突变的转录物)的评估中,对每种突变体转录物观察到多至100倍的滴度升高。探针SEQ ID NO8与标准探针SEQ ID NO6不交叠,并且在相反链上定位。
2.关于添加SEQ ID NO8的浓度优化实验显示相对于RL1.1中的标准探针SEQ IDNO6的浓度添加50%第二探针时就低ct值和高RFI值而言的最佳结果。
3.SEQ ID NO2、3、4、和5显示了初始的有希望的结果。因此,可以通过添加第二探针获得突变体转录物的滴度升高,所述第二探针是非常接近相同链或相反链上的标准探针的部分交叠的探针或相同或相反链上的非交叠探针:
-SEQ ID NO2与标准探针SEQ ID NO6交叠,并且在相反链上定位。
-SEQ ID NO3就标准探针SEQ ID NO6而言以一个碱基的间隔与SEQ ID NO6在相同链上定位。
-SEQ ID NO4、7和8与标准探针SEQ ID NO6不交叠,并且在相反链上定位。
-SEQ ID NO5与标准探针SEQ ID NO6类似,但是携带SEQ ID NO6不覆盖的突变。
Claims (12)
1.至少两种可检测核酸探针和引物制备供一种用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的方法使用的试剂盒的用途,其中所述方法包括下列步骤:
a)使来自所述样品的核酸与扩增试剂接触,所述扩增试剂包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针,其中所述可检测探针至少包含SEQ ID NO 6和8或其相应的互补序列,且其中所述引物是SEQ IDNO 9、10和11;
b)在一定条件下将所述核酸与所述扩增试剂一起温育一段时间,所述条件和时间足以发生扩增反应;
c)通过检测所述可检测探针与所述扩增子的所述不同序列部分的杂交来检测所述扩增子的存在或缺乏,
其中所述扩增子的存在指示所述样品中HCV的存在。
2.权利要求1的用途,其中所述可检测探针不交叠。
3.前述权利要求中任一项的用途,其中所述引物包含超过一种正向和/或反向引物。
4.前述权利要求中任一项的用途,其中在任何步骤将对照核酸添加至样品和/或纯化的核酸。
5.前述权利要求中任一项的用途,其中所述方法进一步包括在步骤c)之后和/或期间测定HCV靶核酸的数量的步骤。
6.前述权利要求中任一项的用途,其中所述对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针是5’-核酸酶探针或HybProbe对。
7.前述权利要求中任一项的用途,其中所述对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针以彼此不超过100个碱基的距离与所述扩增子杂交。
8.前述权利要求中任一项的用途,其中所述对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针携带相同标记物或不同标记物。
9.至少两种可检测核酸探针和引物制备用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的试剂盒的用途,其中所述可检测核酸探针对同一扩增子的不同序列部分是特异性的,且其中所述可检测探针至少包含SEQ ID NO 6和8或其相应的互补序列,且其中所述引物是SEQ ID NO 9、10和11。
10.一种用于扩增和检测可能存在于样品中的HCV靶核酸的试剂盒,所述试剂盒包含扩增试剂,该扩增试剂包含聚合酶、核苷酸单体、用于生成扩增子的引物和至少两种对所述扩增子的不同序列部分特异性的可检测探针,其中所述可检测探针至少包含SEQ ID NO 6和8或其相应的互补序列,且其中所述引物是SEQ ID NO 9、10和11。
11.权利要求10的试剂盒,其中所述可检测探针不交叠。
12.权利要求10至11中任一项的试剂盒,其中所述引物包含超过一种正向和/或反向引物。
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