CN104962553A - 微量核酸释放剂提取病毒dna的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微量核酸释放剂提取生物样本中病毒DNA的方法，属于分子生物学技术领域，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取病毒核酸（DNA）的试剂及其使用方法；微量核酸释放剂裂解生物样本（血清或血浆）中病毒DNA同时，佐以促释放剂能更有效地保证裂解、释放效率；微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；样本提取简便、灵敏、快速、准确，避免反复离心、洗脱开盖所引起的污染和核酸丢失，实现PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取病毒核酸（DNA）的试剂及其使用方法。
背景技术
核酸提取是下游核酸检测、研究或产品开发的起点，所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果，因此核酸抽提是分子生物学最关键的方法之一，通常成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除，理想的提取方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖脂和其它核酸污染，目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提DNA或者总核酸。
目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点，例如：酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其主要成分对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染；碱裂解法：该法提取的核酸不容易保存；硅胶膜吸附柱法提取的核酸DNA浓度纯度低操作复杂；磁珠法因提取成本较高，从而限制了广泛应用；本试剂用于生物样本病毒DNA提取，样本需求量少、操作简便、无需繁琐的离心、洗脱等步骤，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免反复离心、洗脱开盖所引起的污染和核酸丢失；实现PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。
发明内容
本发明是提供一种微量核酸释放剂，它采用一步法操作完成血清、血浆中 DNA 的快速释放，获得的核酸适用于荧光定量 PCR 等下游检测，具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。
根据本发明的一个优选实施方案，试剂组分如下：微量核酸释放剂、促释放剂、封闭剂；微量核酸释放剂含有 5～500mM的 KCl、0. 5～20％ Triton X-100 、1～100mg/ml的蛋白酶K、1～20mM的NaOH；促释放剂含有pH值5～8的DMSO、终浓度0.5～10%的BSA。
在优选的情况下，微量核酸释放剂配制方法为：在灭菌去离子水中加入KCl终浓度为5～500mM，终浓度0. 5～20％ Triton X-100 、终浓度1～100mg/ml的蛋白酶K、终浓度1～20mM的NaOH；促释放剂：在灭菌去离子水中加入终浓度10%，pH值5～8的DMSO、终浓度0.5～10%的BSA；质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准；配制的试剂长期保存需-20℃冻存。
具体的，在一个优选的实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤：
1）取微量核酸释放剂5μl加入等体积的血清或血浆样本，用移液器吹打混匀10次；
2）每管加入30μl的封闭剂；
3）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；
4）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次。
本发明的微量核酸释放剂采用蛋白变性剂，能快速破坏病毒颗粒外壳蛋白结构释放 DNA，与传统的热裂解方式结合同步进行，更有效的保证样本中核酸裂解效率，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；且微量核酸释放剂中含有抑制核酸酶的组分，对 PCR后续实验不会产生影响。
附图说明
图1为采用本发明的试剂提取的HBV血浆梯度稀释扩增结果。
图2为采用本发明的试剂提取的HBV血浆精密度扩增结果。
具体实施方式
参照一下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：用本发明方法对乙肝病毒核酸血浆样本（HBV-DNA）梯度稀释进行提取；1）取已知浓度（2×107IU/ml）HBV阳性样本，用基质血清依次十倍稀释至200IU/ml备用；2）准备相应数量200μl无核酸酶PCR反应管，每管加入5μl微量核酸释放剂，加入5μl待检HBV样本（2×107IU/ml～200IU/ml六个浓度），用移液器反复吹打10次；
3）加入30μl封闭剂；
4）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；
5）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；
6）加入HBV反应液，设置HBV程序扩增。
实施例2：用本发明方法对乙肝病毒核酸血浆样本（HBV-DNA）精密度进行提取；
1）取已知浓度（2×107IU/ml）HBV阳性样本，用基质血清依次十倍稀释至2×103IU/ml备用；
2）准备相应数量200μl无核酸酶PCR反应管，每管加入5μl微量核酸释放剂，加入5μl待检HBV样本（2×105IU/ml和2×103IU/ml两个浓度，每个浓度样本8个复孔），用移液器反复吹打10次；
3）加入30μl封闭剂；
4）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；
5）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；
6）加入HBV反应液，设置HBV程序扩增。
Claims (3)
1.一种利用微量核酸释放剂提取血清或血浆样本中病毒核酸（DNA）的方法。
2.该试剂含有核酸释放剂、促释放剂、封闭剂；核酸释放剂含有 KCl、Triton X-100 、蛋白酶K、NaOH；促释放剂含有DMSO、BSA；封闭剂中含有等体积的石蜡油和矿物油。
3.该技术采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中进行DNA核酸提取；取5μl的微量核酸释放剂加入等体积血清或血浆样本，反复吹打混匀10次，加入30μl封闭剂，置于PCR仪94℃裂解10分钟，然后迅速降至4℃，小心打开管盖加入2.5μl促释放剂并混匀，所得的混合液可直接加PCR扩增试剂进行荧光定量检测。
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