CN111607591B - 一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒。本发明提供一种病毒核酸的提取方法，包括：将待测样品置于裂解体系中进行孵育、裂解，所述裂解体系包括BSA、Carrier RNA和蛋白酶K。本发明所提供的病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒，相对于现有的核酸提取方法来说，操作步骤更加简单、便捷，整个提取过程可以在很短的时间内完成，且仅有加样混匀、高温处理这几个步骤，无需反复敞开裂解体系，减少气溶胶扩散感染的风险，且无需配备高速离心机、核酸提取离心柱和磁性粒子等其他昂贵设备。

Description

一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒。

背景技术

核酸提取是整个核酸检测技术流程的第一步，也是分子生物学中关键的方法之一。他是下游核酸检测和科学研究的基础，抽提的核酸的质量和其完整性会直接影响临床研究或诊断结果。核酸的提取一般包括两步：病毒的裂解和核酸的纯化。现阶段实验室检测指南并未明确提及或推荐新冠病毒标本的核酸提取方法，目前商品化的核酸提取方法主要是固相吸附法，其基本原理是利用核酸独特的物理性质，在特定条件下(如盐浓度，pH等)让核酸吸附在某种固相表面，然后进行清洗和洗脱得到纯化的核酸。此类方法首先利用离液剂(chaotropic agent，如盐酸胍，guanidinium chloride等)来破坏细胞、细菌和病毒的结构，抑制蛋白质和核酸酶对核酸的结合和裂解，从而释放得到游离的核酸。这样得到的核酸目前广泛使用两类方法进行固相吸附和纯化：1)离心柱法：用基于硅的材料或其它吸附核酸的固体填充在离心柱中。第一步生物体裂解得到的核酸通过离心柱时会吸附在填充介质上，再利用高盐乙醇溶液洗去杂质，最后利用低盐溶液，例如纯水，将核酸洗脱下来得到纯化的产品。该方法简单便捷，提取效率高，纯度好。缺点是需要商业提取试剂盒，相对高速的离心机，难以做到高通量和自动化，处理大量样品时工作量大，耗时长。2)磁珠法：使用微米或纳米级别大小的磁性粒子作为固相载体。磁性粒子表面包裹含硅材料或其它吸附核酸的材料。混入裂解得到的游离核酸中以后，利用外加磁场将吸附有核酸的磁性粒子分离出来并进行清洗和洗脱得到纯化的核酸。该方法操作较简单，可实现高通量和自动化操作，缺点是需购买商业试剂，成本较高，不同厂家、批次磁性粒子效果波动较大，同时提取步骤和时间还是较长。

这些方法在实际运用时都面临着一系列问题：1)操作繁琐，对测试员要求高；2)有多次重复开盖的操作，这样的操作增加了形成病毒气溶胶的机率，加大了测试员被感染的风险。此类临床样本的核酸提取需要在特定防护级别的专用实验室中进行，并要求操作者佩戴全套符合标准的防护装备，从而大大增加了核酸提取和分析的复杂性、成本和时间，也意味着此类操作不适合在小医院、诊所、社区及家庭环境下进行，不能用于快速、大规模的疾病筛查。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种病毒核酸的提取方法，包括：将待测样品置于裂解体系中进行孵育、裂解，所述裂解体系包括BSA、Carrier RNA和蛋白酶K。

在本发明一些实施方式中，所述待测样品选自咽部分泌物，优选选自咽拭子样品。

在本发明一些实施方式中，所述裂解体系中，BSA的浓度为0.3～0.7mg/mL。

在本发明一些实施方式中，所述裂解体系中，Carrier RNA的浓度为13.26～15.26μg/mL。

在本发明一些实施方式中，所述Carrier RNA的多核苷酸序列包括polyA序列，所述polyA序列的长度为300～2000bp。

在本发明一些实施方式中，所述裂解体系中，蛋白酶K的浓度为0.05～0.2mg/mL。

在本发明一些实施方式中，所述裂解体系为水溶液，优选为无酶水水溶液、DEPC水水溶液中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，孵育温度为20℃～27℃，孵育时间为2min～5min。

在本发明一些实施方式中，裂解温度为94℃～96℃，裂解时间为9min～11min。

在本发明一些实施方式中，将待测样品裂解前，将待测样品置于包括BSA的保护液中，优选的，所述保护液选自BSA水溶液，所述BSA水溶液中，BSA的浓度为0.3～1.2mg/mL。

本发明另一方面提供一种病毒核酸提取试剂盒，包括适用于上述的病毒核酸的提取方法的裂解体系。

在本发明一些实施方式中，所述病毒核酸提取试剂盒包括BSA、Carrier RNA和蛋白酶K。

附图说明

图1(A)显示为本发明实施例1中采样拭子材料对于快提效率的影响示意图。

图1(B)显示为本发明实施例1中咽拭子对于快提效率的影响示意图。

图2显示为本发明实施例2中不同Carrier RNA浓度对快提效率的影响示意图。

图3(A)显示为本发明实施例3中不同浓度BSA快提裂解液的影响示意图。

图3(B)显示为本发明实施例3中含0.5mg/mL BSA快提裂解有的快提效率示意图。

图4显示为本发明实施例4中不同蛋白酶K浓度浓度对快提效率的影响示意图。

图5(A)显示为本发明实施例5中25℃孵育条件下的时间影响示意图。

图5(B)显示为本发明实施例5中37℃孵育条件下的时间影响示意图。

图5(C)显示为本发明实施例5中95℃裂解的时间影响示意图。

图5(D)显示为本发明实施例5中样本的保存方式和保存时间的考察示意图。

图6(A)显示为本发明实施例6中快提裂解液对于O基因的适用性示意图。

图6(B)显示为本发明实施例7中快提裂解液对于RT-PCR方法的适用性示意图。

图6(C)显示为本发明实施例7中快提裂解液对于O基因假病毒的检测效率对比示意图。

图6(D)显示为本发明实施例7中快提裂解液对于N基因假病毒的检测效率对比示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明发明人经过大量实践研究，意外发现了一种快速、高效、安全的病毒核酸的提取方法，所述病毒核酸的提取方法以BSA、Carrier RNA和蛋白酶K构成裂解体系，具有提取效率高、操作步骤简单、成本低廉等特点，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种病毒核酸的提取方法，包括：将待测样品置于裂解体系中进行孵育、裂解，所述裂解体系包括BSA、Carrier RNA和蛋白酶K。所述裂解体系中，BSA主要起到保护RNA样本的功能，Carrier RNA主要可以通过自身被降解从而保护目标RNA的完整，蛋白酶K则是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，Carrier RNA和蛋白酶K的存在可以抑制核酸裂解反应并释放出游离的核酸。通过三个主要组分的配合，即可快速、高效、安全的对病毒核酸进行提取。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，所述待测样品可以是各种包含病毒核酸的样品，例如，所述待测样品可以是咽部分泌物等。合适的获取待测样品的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，对于咽部分泌物来说，所述待测样品可以是咽拭子样品等。所述提取方法也可以适用于各种病毒种类，例如，所述待测样品可以包括nCOV-19病毒等。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，在裂解体系中，BSA(牛血清白蛋白，CASNo.9048-46-8)主要起到保护样本RNA的功能，例如，可以保证在保存过程中RNA不被降解。所述裂解体系中，BSA通常需要具有合适的浓度范围，从而可以获得更加优化的病毒裂解效率。例如，在裂解体系中，BSA的浓度可以为0.3～0.7mg/mL、0.3～0.4mg/mL、0.4～0.45mg/mL、0.45～0.5mg/mL、0.5～0.55mg/mL、0.55～0.6mg/mL、或0.6～0.7mg/mL。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，Carrier RNA是一种多聚腺嘌呤核糖核苷酸(Poly A，AAAAAAA…AAAA)，其长度通常可以为300～2000bp、300～400bp、400～500bp、500～600bp、600～700bp、700～800bp、800～900bp、900～1000bp、1000～1100bp、1100～1200bp、1200～1300bp、1300～1400bp、1400～1450bp、1450～1500bp、1500～1550bp、1550～1600bp、1600～1700bp、1700～1800bp、1800～1900bp、或1900～2000bp，具体可以为约1500bp左右，例如，所述Carrier RNA的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。在裂解体系中，Carrier RNA主要可以通过自身被降解从而保护目标RNA的完整，从而可以提高RNA提取的效率，尤其在微量样本提取核酸时。所述裂解体系中，Carrier RNA通常需要具有合适的浓度范围，从而可以获得更加优化的病毒提取效率。例如，在裂解体系中，Carrier RNA的浓度为13.26～15.26μg/mL、13.26～13.46μg/mL、13.46～13.66μg/mL、13.66～13.86μg/mL、13.86～14.06μg/mL、14.06～14.16μg/mL、14.16～14.26μg/mL、14.26～14.36μg/mL、14.36～14.46μg/mL、14.46～14.66μg/mL、14.66～14.86μg/mL、14.86～15.06μg/mL、或15.06～15.26μg/mL。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，蛋白酶K(PDB ID:6K2P)是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可以切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，因此具有降解天然蛋白质的能力。在裂解体系中，蛋白酶K的存在主要可以进一步优化裂解体系的裂解效率。所述裂解体系中，蛋白酶K通常需要具有合适的浓度范围，从而可以获得更加优化的病毒裂解效率。例如，在裂解体系中，蛋白酶K的浓度为0.05～0.2mg/mL、0.05～0.1mg/mL、0.1～0.15mg/mL、或0.15～0.2mg/mL。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，所述裂解体系通常为水溶液体系。合适的构成水溶液体系作为裂解体系的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以采用无酶水、DEPC水等作为溶剂以构建水溶液体系，从而获得无酶水水溶液、DEPC水水溶液等。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，裂解体系中的各组分通常需要充分混合，从而保证提取效率，例如，在提供裂解体系时，通常可以使混合体系充分震荡。此外，合适的孵育和/或裂解条件通常可以进一步提升病毒核酸的提取中的裂解效率，例如，孵育过程中，孵育温度可以为20℃～27℃、20℃～21℃、21℃～22℃、22℃～23℃、23℃～24℃、24℃～25℃、25℃～26℃、或26℃～27℃，孵育时间可以为2min～5min、2min～2.5min、2.5min～3min、3min～3.5min、3.5min～4min、4min～4.5min、或4.5min～5min；再例如，裂解过程中，裂解温度可以为94℃～96℃、94℃～94.5℃、94.5℃～95℃、95℃～95.5℃、或95.5℃～96℃，裂解时间可以为9min～11min、9min～9.5min、9.5min～10min、10min～10.5min、或10.5min～11min。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，本领域技术人员可以选择合适的方法，对待测样品进行前处理，以尽量避免样品中RNA的降解。例如，在获取待测样品以后、且在将待测样品裂解前，可以将待测样品置于包括BSA的保护液中，如果需要将样品保留较长时间(例如，半小时以上、或一小时以上)，则通常需要在低温条件下(例如，4℃以下、或-20℃以下的温度)保存样品。而在需要进行裂解时，可以在保护液中引入对应浓度的Carrier RNA和蛋白酶K，以构成裂解体系并对待测样品进行裂解。所述保护液通常可以是BSA水溶液，溶液中BSA的浓度通常与裂解体系是相对应的，例如，所述BSA水溶液中，BSA的浓度可以为0.3～1.2mg/mL、0.3～0.4mg/mL、0.4～0.5mg/mL、0.5～0.6mg/mL、0.6～0.7mg/mL、0.7～0.8mg/mL、0.8～0.9mg/mL、0.9～1.0mg/mL、1.0～1.1mg/mL、或1.1～1.2mg/mL。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法中，病毒核酸的提取方法可以与各种检测方法相配合，例如，其对应的检测方法可以是即时聚合酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等方法。上述病毒核酸的提取获得的样品通常可以具有优良的检测下限，例如，上述病毒核酸的提取方法与RT-PCR方法、LAMP方法等相配合时，其检测下限可以可达到≤10000copies/mL、≤8000copies/mL、≤6000copies/mL、≤4000copies/mL、≤2000copies/mL。

本发明第二方面提供一种病毒核酸提取试剂盒，包括适用于本发明第一方面所提供的病毒核酸的提取方法的裂解体系。通常来说，所述病毒核酸提取试剂盒可以包括BSA、Carrier RNA、蛋白酶K和无酶水等，从而可以用于形成本发明第一方面所提供的病毒核酸的提取方法的裂解体系。例如，上述病毒核酸提取试剂盒可以包括保护液和裂解液，所述保护液可以包括牛血清白蛋白(BSA)溶液，所述裂解液可以包括Carrier RNA、蛋白酶K等。其中，保护液主要起到保护样本RNA的功能，保证在保存过程中RNA不被降解；裂解液主要的作用是使样品中细胞膜、细胞核、细胞壁、或病毒衣壳等破裂，从而抑制核酸裂解反应并释放出游离的核酸。

本发明所提供的病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒，相对于现有的核酸提取方法来说，操作步骤更加简单、便捷，整个提取过程可以在很短的时间内完成，且仅有加样混匀、高温处理这几个步骤，无需反复敞开裂解体系，减少气溶胶扩散感染的风险，且无需配备高速离心机、核酸提取离心柱和磁性粒子等其他昂贵设备。更重要的是，本发明所提供的病毒核酸的提取方法能够有效抑制复杂样品中的核酸酶和蛋白酶，所得核酸提取液可直接用于核酸扩增与分析，具有优良的检测下限和普适性，具有良好的产业化前景。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

以咽拭子取样对快提液的裂解效果进行考察。首先，为了排除采样拭子的生产材料对快提体系的影响，将采样拭子与不同浓度的模拟nCOV-19中N基因(GenBank:MN908947.3)的假病毒(2000copies/mL、5000copies/mL、10000copies/mL，购于厦门致善生物科技股份有限公司)共同加入到含有300uL快提裂解液(含1mg/mL BSA的无酶水)的无酶1.5mL EP管中，震荡(2000rpm/min，15s)后，25℃静置2min，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行环介导等温扩增反应(孵育温度60-65℃，目标N基因序列为：CACATTGGVCACCCGCAATCACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCACAAGCCTCTTCTCGTTCCTC，SEQ ID NO.1)，针对新冠靶标基因的6个区域设计了4种特异引物和2个茎环结构，详见表1：

表1

引物设计方法可以参见“LAMP引物设计指南”(https://primerexplorer.jp/e/ v4_manual/)，扩增结果如图1(A)所示。由图可知，在采样拭子存在的情况下，含10000copies/mL、5000copies/mL、2000copies/mL假病毒的快提裂解液均可发生等温扩增反应。由此可见，采样拭子的材料以及对其的后续处理对等温扩增是没有影响的。

在拭子采取咽拭子后，由于咽拭子中含有多种酶，所以进一步考察了咽拭子中的成分对于快提裂解液的影响。将采取的咽拭子与模拟nCOV-19中N基因的假病毒(10000copies/mL)共同加入到快提裂解液(含1mg/mL BSA的无酶水)中(对照组分别为仅加入假病毒、以及空白的快提裂解液)，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行等温扩增反应，结果如图1(B)所示。在10000copies/mL假病毒存在的条件下，未加咽拭子的组呈现“S”型，表明该组成功发生等温扩增；而加入了咽拭子的组并没有发生等温扩增。加入咽拭子后未发生等温扩增的原因应该是咽拭子中的酶降解了假病毒中的RNA。

实施例2

Carrier RNA是一条长约1500bp的多聚腺嘌呤核糖核苷酸(Poly A)(CarrierRNA,Mat.No.1068337,QIAGEN)，在针对微量样本提取核酸时，可以通过自身被降解从而保护目标RNA的完整，从而提高RNA提取的效率。因此，将采取的咽拭子、不同浓度Carrier RNA与模拟nCOV-19中N基因的假病毒(10000copies/mL)共同加入到快提裂解液(含1mg/mL BSA的无酶水)中(对照组分别为仅加入假病毒、以及空白的快提裂解液)，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行等温扩增反应，考察了Carrier RNA对于快提效率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在加入14.26μg/mL的Carrier RNA后，按前述方式裂解样本后，等温扩增反应顺利发生，且Ct值相对无咽拭子的样本延迟不大。而在加入7.13μg/mL CarrierRNA的样本中，虽然反应也能发生，但相比于无咽拭子样本来说，起峰时间延迟较大，Ct值差距较大。所以，含有1mg/mL BSA，14.26μg/mL Carrier RNA的无酶水溶液应该是相对较优的快提裂解液配方。

实施例3

对于含有1mg/mL BSA及14.26μg/mL Carrier RNA的快提裂解液配方，考察1mg/mL和0.5mg/mL两种BSA浓度。将采取的咽拭子、Carrier RNA(14.26μg/mL)与模拟nCOV-19中N基因的假病毒(10000copies/mL)共同加入到不同浓度的快提裂解液(含0.5mg/mL、或1mg/mL BSA的无酶水)中(对照组分别为空白的快提裂解液、仅加入假病毒、以及仅加入咽拭子和假病毒)，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行等温扩增反应，考察了BSA浓度对于快提效率的影响，结果如图3(A)和图3(B)所示。由图3(A)可知，以在无病毒存在的情况下，不发生等温扩增反应为前提，并可以再次确认在含Carrier RNA的不同浓度的BSA快提裂解液中，裂解效果均优于对应浓度BSA但不含Carrier RNA的快提裂解液。此外，含有0.5mg/mL BSA的快提裂解液裂解病毒后发生等温扩增的效率明显比含有1mg/mL BSA的快提裂解液要好。因此，含有0.5mg/mL BSA及14.26μg/mL Carrier RNA的无酶水溶液应该是相对较优的快提裂解液配方。进一步考察裂解液裂解病毒后发生等温扩增的效率。由图3(B)可知，优化后的配方裂解病毒后发生等温扩增的Ct值(15.98)已非常接近无咽拭子的纯病毒裂解样本(14.29)，表明优化后的配方可以很好的屏蔽咽拭子中酶的活性，从而保留病毒中的RNA，提高了RNA在快提裂解液中浓度，从而提高了反应效率。

实施例4

将采取的咽拭子、不同浓度的蛋白酶K(0.5mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL)与模拟nCOV-19中N基因的假病毒(10000copies/mL)共同加入到快提裂解液(含有0.5mg/mL BSA及14.26μg/mL Carrier RNA的无酶水溶液)中。在20℃放置10分钟，使蛋白酶K充分与咽拭子中的蛋白反应，将其降解，使RNA得到最大程度释放。之后，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行等温扩增反应，考察了蛋白酶K对于快提效率的影响，结果如图4所示。由图4可知，从Ct值判断，含0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液的裂解效果(18.68)略好于含0.5mg/mL的蛋白酶K裂解液(19.05)，明显好于含0.05mg/mL的蛋白酶K裂解液(24.05)。所以，含有0.5mg/mL BSA、14.26μg/mL Carrier RNA以及0.1mg/mL的蛋白酶K的无酶水溶液应该是相对较优的快提裂解液配方。

实施例5

将采取的咽拭子与模拟nCOV-19中N基因的假病毒(10000copies/mL)共同加入到快提裂解液(含有0.5mg/mL BSA、14.26μg/mL Carrier RNA及0.1mg/mL蛋白酶K的无酶水溶液)中。分别在25℃和37℃孵育不同时间。之后，95℃裂解10分钟后，加入N基因对应的试剂盒进行等温扩增反应，考察不同孵育条件对于快提效率的影响，结果如图5(A)～图5(D)所示。

由图5(A)可知，在25℃的孵育条件下，孵育2分钟的样本在等温扩增反应中的表现(20.04)要优于孵育5分钟的样本(24.97)。类似地，由图5(B)可知，在37℃的孵育温度下，孵育2分钟的样本在等温扩增反应中的表现依旧优秀，呈现“S”型曲线，Ct值为(19.88)。孵育1分钟的样本也顺利发生等温扩增反应，但由于反应时间过短，蛋白酶K没有充分发挥降解蛋白的作用，导致反应效率比孵育2分钟的样本略低(21.14)。而孵育5分钟和10分钟的样本仍然没有发生等温扩增反应。其原因应该是，长时间的孵育使还未被蛋白酶K降解的咽拭子中的酶有时间和机会开始降解RNA，导致裂解液中RNA浓度变低，从而使得等温扩增反应效率低。

之后，以25℃孵育温度、2分钟孵育时间为例的孵育样本，继续考察了不同的高温灭活的时间，结果如图5(C)所示。图五(C)中两个时间梯度分别为2分钟和10分钟，裂解时间为10分钟的样本顺利发生等温扩增反应，且效果相对无咽拭子样本，并未延后太多，表明10分钟的裂解时间比较合适。而裂解时间为2分钟的样本并没有顺利发生反应，表明裂解时间过短不足以灭活蛋白酶K和咽拭子中的酶，未失活的酶对后面扩增反应中所需的DNA聚合酶等起到抑制作用，从而抑制了等温扩增反应的发生。

进一步考察样本本身的保存方式和保存时间对于后续等温扩增反应的影响，结果如图5(D)所示。我们设置了3组不同的保存方法与上述实施例中所述的提取方式(对应图5D快速响应曲线)进行比较，目的是为了模拟实际应用过程中提取核酸到检测中有间隔是否会影响快提液中目标核酸的活性。3组不同的保存方法分别为：1)咽拭子与N基因假病毒(10000copies/mL)加入到只含有0.5mg/mL BSA无酶水溶液中，随后保存在4℃环境下1小时，一小时后再加入14.26μg/mL Carrier RNA与0.1mg/mL蛋白酶K无酶水溶液，25℃下孵育2min，95℃金属浴中灭活10min，所得溶液用于后续核酸检测；2)咽拭子与N基因假病毒(10000copies/mL)加入到含有0.5mg/mL BSA，14.26μg/mL Carrier RNA和0.1mg/mL蛋白酶K无酶水溶液中，4℃保存1小时后，恢复至室温，25℃下孵育2min，95℃金属浴中灭活10min，所得溶液用于后续核酸检测；3)咽拭子与N基因假病毒(10000copies/mL)加入到含有0.5mg/mL BSA，14.26μg/mL cRNA和0.1mg/mL蛋白酶K无酶水溶液中，-20℃保存1小时后，恢复至室温，25℃下孵育2min，95℃金属浴中灭活10min，所得溶液用于后续核酸检测。对比四条曲线，结果表明将快提液保存在低于4℃的环境中1h后，仍然能检测出目标核酸的信号。表明在低于4℃条件下，Carrier RNA和蛋白酶K与样本反应程度较低，一小时的放置也不会影响后续核酸扩增反应的发生。

同时我们还对比了商业化核酸提取试剂盒在提取完后，提取液中RNA的活性在4℃保存对后续核酸检测有无影响(对应图5D 4℃1h后凯杰提取)。将上述样本通过市售的凯杰提取试剂盒(Cat.No.74106)按照其说明书提取RNA，证实提取获得的样品可以直接发生扩增反应(凯杰快速提取组)，实验具体操作如下：将咽拭子与N病毒(10000copies/mL)直接加入到凯杰试剂盒提供的RLT Buffer(300uL)，加入等体积的70％乙醇，混匀后加至试剂盒提供的提取柱上，离心8000g，15s，除去滤液，再加入700uL Buffer RW1，离心8000g，15s，除去滤液；再加入500uL Buffer RPE，离心8000g，2min，除去滤液，此过程重复两次；最后加入30uL无酶水，离心8000g，1min，所得滤液即为含有目标核酸的提取液，商业化的提取液在4℃放置1小时后核酸已失活，无法检测出阳性。所有实验均基于阴性样本(无酶水)为样本参与快提及扩增反应，无阳性信号的基础上实施。

实施例6

将采取的咽拭子、蛋白酶K(0.5mg/mL)与模拟nCOV-19中O基因(Gene ID:43740578)的假病毒(10000copies/mL，购于厦门致善生物科技股份有限公司)共同加入到快提裂解液(0.5mg/mL BSA，14.26μg/mL Carrier RNA和0.1mg/mL蛋白酶K无酶水溶液)中(对照组分别为空白的快提裂解液、仅加入假病毒和蛋白酶K、以及仅加入咽拭子和蛋白酶K)。在25℃温度条件下孵育2min。之后，95℃裂解10分钟后，加入O基因对应的试剂盒进行等温扩增反应(靶标序列Gene ID:43740578，具体设计方法参考前面N基因设计方法原理图和引物序列)，考察快提裂解液对于各靶标的适用性，结果如图6(A)所示。由图6(A)可知，用前述方法裂解得到的病毒样本，同样可以通过等温扩增很好地检测到O基因的存在，表明本发明提供的快提技术可以适配各种nCOV-19常见基因的检测。

实施例7

以华大基因生产的RT-PCR试剂盒(国械注准20203400060)为例，通过华大基因生产的试剂盒可以检测出N基因和O基因的信号，并且检测下限达到了100copies/mL，结果如图6(B)所示。图6(B)中，分别将N基因和O基因假病毒按1:1混合，稀释成终浓度分别为10000copies/mL、2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、100copies/mL，分别加入咽拭子作为测试样本。参照实验样本为用凯杰提取试剂盒提取的10000copies/mL的样本(凯杰N+O 10000copies/ml，出峰)，以无酶水作为阴性样品，提取方法参照实施例4(其中，快提裂解液配方中各物质浓度为0.5mg/mL BSA、14.26μg/mL Carrier RNA以及0.1mg/mL的蛋白酶K)，快提液：本实验所用快提液，无任何外加试剂为阴性结果，不出峰为前提。

除华大基因生产的RT-PCR外，还测试了快提裂解液与硕世生物科技股份有限公司的新型冠状病毒(2019)核酸检测试剂盒(JC10223-1N)的适配性。将N基因(图6(C))和O基因(图6(D))假病毒稀释成终浓度分别为10000copies/mL、2000copies/mL、1000copies/mL，分别加入咽拭子，分别用凯杰提取试剂盒(未做1000copies/mL)和本发明的快提液提取方式作为测试样本(提取方法参照实施例4，快提裂解液配方中各物质浓度为0.5mg/mL BSA、14.26μg/mL Carrier RNA以及0.1mg/mL的蛋白酶K)，阳性样本为质粒，无需提取步骤，结果如图6(C)和图6(D)所示。由图6(C)可知，本发明所提供的快提裂解液可以检测到含2000copies/mL的O基因假病毒，效果可以与市面上常见的凯杰提取试剂盒(Cat.No.74106)基本无差距。由图6(D)可知，本发明所提供的快提裂解液对于N基因的检测同样可以达到2000copies/mL的检测下限，并且效果与凯杰提取试剂盒相当。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacattggvc acccgcaatc acttcctcaa ggaacaacat tgccacaagc ctcttctcgt 60

tcctc 65

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccagatgag gatgaagaag a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtctgaaca actggtgtaa g 21

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagcagcag aagtggcaca ggtgattgtg aagaagaaga g 41

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaacctgaa gaagagcaag aactgattgt cctcactgcc 40

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcatattga gttgatggct ca 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acaaactgtt ggtcaacaag ac 22

Claims (9)

1.一种病毒核酸的提取方法，包括：将待测样品置于裂解体系中进行孵育、裂解，所述裂解体系包括BSA、Carrier RNA和蛋白酶K；

所述裂解体系中，BSA的浓度为0.3~0.5 mg/mL；

所述裂解体系中，Carrier RNA的浓度为13.26~15.26μg/mL；

所述孵育的温度为20℃~27℃，孵育时间为2 min~5 min；

所述裂解体系中，蛋白酶K的浓度为0.05~0.1 mg/mL；所述裂解的温度为94℃~96℃，裂解时间为9 min~11 min。

2.权利要求1所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述待测样品选自咽部分泌物。

3.权利要求2所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述咽部分泌物为咽拭子样品。

4.权利要求1所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述裂解体系中，所述CarrierRNA的多核苷酸序列包括polyA 序列，所述polyA 序列的长度为300~2000 bp。

5.权利要求1所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述裂解体系为水溶液。

6.权利要求5所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述裂解体系为酶水水溶液、DEPC水水溶液中的一种或多种的组合。

7.权利要求1所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，将待测样品裂解前，将待测样品置于包括BSA的保护液中。

8.权利要求7所述的病毒核酸的提取方法，其特征在于，所述保护液选自BSA水溶液，所述BSA水溶液中，BSA的浓度为0.3~1.2mg/mL。

9.一种病毒核酸提取试剂盒，包括适用于权利要求1~8任一权利要求所述的病毒核酸的提取方法的裂解体系。