KR20130143677A

KR20130143677A - 안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20130143677A
Application number: KR1020137031861A
Authority: KR
Inventors: 로버트 잭슨 베이어; 킴 이. 파울센
Original assignee: 퀴아젠 노쓰 아메리칸 홀딩즈, 인크.
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2013-12-31
Also published as: WO2006052680A1; AU2005305012C1; CA2586532A1; AU2005305012B2; NO20072722L; US10947527B2; EP1809744B1; JP5390772B2; US20190345480A1; CN101124321A; KR20070097430A; JP2008518618A; CA2586532C; CN101124321B; US20060105372A1; EP1809744A1; AU2005305012A1

Abstract

본 발명은 샘플로부터 RNA 또는 DNA 또는 이들 둘 다를 정제하기 위한 시약, 방법 및 키트를 특징으로 한다.

Description

안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PURIFYING NUCLEIC ACIDS FROM STABILIZATION REAGENTS}

우선권의 주장

본 특허출원은 2004년 11월 5일에 출원된 미국 특허출원 제 60/625,513 호 및 2005년 9월 13일에 출원된 미국 특허출원 제 60/716,451 호를 우선권으로 주장한다. 본 출원은 본 명세서에 온전히 참고로 포함되어 있는 열거된 출원의 이점을 청구한다.

본 발명은 샘플로부터 RNA, DNA 또는 이들 둘 다를 단리하는 물질 및 방법에 관한 것이다.

데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)과 같은 핵산은 연구 및 임상분석을 위한 분자생물학의 분야에서 광범하게 사용된다. 세포의 붕괴를 수반하는 생물학적 샘플로부터 DNA 및 RNA를 단리하고, 핵산을 용액 내로 유리시키는 다수의 방법이 존재한다. RNA는 분해에 대해서 매우 민감하다. 따라서, RNA 분해효소 (예를 들어, RNases)에 의한 효소적 소화로부터 RNA를 보호하는 방법도 존재한다. 그 후, RNA를 DNA, 단백질 및 다른 오염물질로부터 단리시킬 수 있다. 이들 단리방법은 통상적으로 단계적 방식으로 수행되며, 여기에서는 RNase 활성을 억제하는 조건 하에서 세포를 용해시키고, 이어서 별도의 단계에서 더 정제한다. RNA를 더 정제하기 전에 샘플의 저장을 가능하게 하는 수집의 시점에서 RNA를 안정화시키는 방법도 또한 개발되었다.

현재의 핵산 안정화 생성물 시스템은 단지 제한된 정제 옵션을 대비한 것이다. 예를 들어, 이들 안정화 생성물 시스템 및 이들의 시약은 사용자를 수집튜브 (collection tube)의 제조자에 의해서 특별히 디자인된 정제 생성물로 제한한다. 이들 방법은, 이들이 전용 자본재를 필요로 하고, 사용하기 어려우며, 동일한 샘플로부터 RNA 및 DNA 둘 다를 단리하는 그들의 능력이 제한된다는 점에서 그들의 다목적성이 제한된다. 따라서, 사용자들은 RNA 또는 DNA를 위한 "안정화" 튜브를 선택하는 것이 필요하고, 각각에 대해서 별도의 핵산 단리키트를 구입하는 것을 필요로 한다.

요약

본 발명에 의해서 특정화되는 제제 및 방법은 동일한 샘플로부터 RNA 또는 DNA 또는 이들 둘 다의 추출 및 정제에 대비하는 것이며, 따라서 사용자에게 이점을 제공한다. 추가로, 본 발명의 특징적인 제제 및 방법은 다수의 제조자들로부터 수집튜브와 함께 사용될 수 있으며, 이에 따라 사용자들은 그들이 선택한 수집튜브와는 무관하게, 간단하고 다루기 쉬우며 비용 효과가 큰 용액을 제공할 수 있다.

생물학적 샘플 내의 핵산의 보존 및 안정화를 위한 수집튜브 및 시약의 개발과 함께, 최종 사용자가 동일한 샘플로부터 RNA 또는 DNA, 또는 이들 둘 다를 효과적으로 단리하도록 하는 옵션이 가능하도록 하는 방법이 필요하다. 현재, 사용자는 DNA 및 RNA를 위한 별도의 키트 및 별도의 수집튜브를 구입하여야 한다. 샘플의 보존 또는 안정화를 위해서 상업적으로 이용할 수 있는 몇가지 방법이 있다. 그러나, 동일한 튜브로부터 DNA 및 RNA 둘 다를 추출하도록 허용하는 이용가능한 물질 및 방법도 키트도 없다.

본 발명은 조용해물 (crude lysate)을 pH 약 7 내지 9의 완충액, 염기, 양친매성 시약을 포함하는 가용화 용액과 접촉시키고; 샘플을 약 7 초과의 pH로 완충되고 컴플렉스화 염 (complexing salt)을 포함하는 용해 용액 (Lysis Solution)과 접촉시켜 단리 샘플을 생성시키고; 단리 샘플을 고체 지지체에 접촉시켜 단리 샘플 내의 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 포함하는 핵산을 고체 지지체에 결합시키고; 고체 지지체를 하나 이상의 세척용액으로 세척하여 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 포함하는 결합된 핵산 이외의 물질을 제거하고; 실질적으로 순수하고 분해되지 않은 RNA를 수득하기 위해서 실질적으로 분해되지 않은 결합된 RNA를 고체 지지체로부터 용출시킴으로써 안정화된 샘플로부터 조용해물의 RNA-수반 제제를 함유하는 시험 샘플로부터 RNA를 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 조용해물을 pH 약 7 내지 9의 완충액, 염기, 양친매성 시약을 포함하는 가용화 용액과 접촉시키고; 샘플을 약 7 초과의 pH로 완충되고 컴플렉스화 염을 포함하는 용해 용액과 접촉시켜 단리 샘플을 생성시키고; 단리 샘플을 (i) 완충액, 리튬염, 및 양친매성 시약을 포함하는 결합 용액, 또는 (ii) 리튬염 및 알콜을 포함하는 세척용액과 접촉시켜 결합 샘플을 생성시키고; 결합 샘플을 고체 지지체에 접촉시켜 결합 샘플 내의 실질적으로 분해되지 않은 DNA를 포함하는 핵산을 고체 지지체에 결합시키고; 고체 지지체를 하나 이상의 세척용액으로 세척하여 실질적으로 분해되지 않은 DNA를 포함하는 결합된 핵산 이외의 물질을 제거하고; 실질적으로 순수하고 분해되지 않은 DNA를 수득하기 위해서 실질적으로 분해되지 않은 결합된 DNA를 고체 지지체로부터 용출시킴으로써 안정화된 샘플로부터 조용해물의 DNA-수반 제제를 함유하는 시험 샘플로부터 DNA를 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 샘플을 제 1 튜브 및 제 2 튜브에 분할하고 (또는 가용화 용액을 샘플에 첨가한 후에 샘플을 분할하고); 상술한 RNA 단리방법에 따라서 제 1 튜브 내의 샘플로부터 RNA를 단리하고; 상술한 DNA 단리방법에 따라서 제 2 튜브 내의 샘플로부터 DNA를 단리하는 것을 포함하는, 샘플로부터 DNA 및 RNA 둘 다를 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, RNA를 함유하는 시험 샘플로부터 실질적으로 순수하며 분해되지 않은 RNA를 단리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 템퍼스 (Tempus™) 안정화제 (참조예: 미국 특허 제 5,972,613 호 및 WO 99/29840)와 같은 구아니디늄 안정화제로 안정화된 시험 샘플을 알콜과 접촉시키고; 시험 샘플을 원심분리하여 조용해물 펠릿 및 상등액을 형성시키고; 상등액을 제거하고; 조용해물 펠릿을 약 7 초과의 pH로 완충되고 컴플렉스화 염을 포함하는 용해 용액과 접촉시켜 단리 샘플을 생성시키고; 단리 샘플을 고체 지지체에 접촉시켜 단리 샘플 내의 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 포함하는 핵산을 고체 지지체에 결합시키고; 고체 지지체를 하나 이상의 세척용액으로 세척하여 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 포함하는 결합된 핵산 이외의 물질을 제거하고; 실질적으로 순수하고 분해되지 않은 RNA를 수득하기 위해서 실질적으로 분해되지 않은 결합된 RNA를 고체 지지체로부터 용출시키는 단계를 포함한다. 이 방법에서 사용될 수 있는 알콜은 에탄올 또는 메탄올이거나, 메탄올과 에탄올의 배합물일 수 있다. 알콜은 약 30％ 내지 100％, 또는 70％ 내지 95％의 농도로 존재한다. 상등액을 원심분리 단계 이후에 시험 샘플로부터 제거하는 경우에, 안정화제로부터의 구아니디늄은 실질적으로 제거되어 조용해물 펠릿은 실질적으로 구아니디늄을 함유하지 않음에 주목하여야 한다. 용어 "실질적으로 함유하지 않는"은 안정화제의 원래의 출발 용적의 1％ 미만 (예를 들어, 0.5％ 또는 0.1％ 미만, 또는 0.01％ 미만)이 조용해물 내에 존재하는 것을 의미한다. 잔류할 수 있는 어떤 잔류 구아니디늄도 후속 정제과정의 화학에 영향을 미치지 않는다.

본 발명은 pH가 약 7 내지 9이며 농도가 약 10 내지 20 mM인 트리스-HCl, 농도 약 20 내지 50 mM의 트리스 염기, 농도 약 5 내지 15％의 트리톤 (Triton)-X, 및 농도 약 1 내지 20 mM의 EDTA를 함유하는 것으로서, 핵산을 함유하는 물질을 가용화시키기 위한 제제를 제공한다.

본 발명은 가용화 용액, 용해 용액, 세척 I 용액 또는 결합 용액, 세척 II 용액, 및 샘플로부터 RNA, DNA 또는 이들 둘 다를 단리하기 위한 프로토콜을 함유하는 (별도의 패키지로) 패키징 (packaging)을 포함하는, RNA, DNA 또는 이들 둘 다를 단리하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 그 밖의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명, 및 특허청구의 범위로부터 명백할 것이다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 그 밖의 다른 문헌들은 온전히 참고로 포함되는 것이다. 대립되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서는 조절할 수 있다. 기술된 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이지만, 제한하고자 하는 것은 아니다. 숙련된 전문가는 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

발명의 상세한 설명

핵산 정제 또는 단리

생물학적, 의학적 및 약물학적 과학의 발달은 연구용 유전자 (studying gene)에 대한 관심을 증가시켰으며, 다양한 샘플로부터 핵산을 수득하기 위한 정교한 방법에 대한 필요성을 증대시켰다. 예를 들어, 리보핵산은 세포의 유전적 기원 및 작용적 활성의 광범한 정보를 제공한다. 이러한 정보는 예를 들어, 임상실습, 감염의 진단, 종양유전자를 발현하는 세포의 존재 검출, 유전적 질환의 검출, 숙주 방어 메카니즘 상태의 모니터, 대사성 질병의 조사 및 진단, 환자에게서 유전자 발현에 대한 약물의 영향을 조사, 및 약물의 부작용 및 독성효과에 대한 조사를 위해서 사용될 수 있다.

두가지 일반적 카테고리, 즉 액체상 정제 및 고체상 정제에 속하는 다수의 핵산 정제방법이 존재한다. 액체상 정제방법에서, 핵산은 액체상으로 유지되는 반면에 불순물은 침전 및/또는 원심분리에 의해서 제거된다. 대신으로는, 핵산이 침전으로 석출되는 반면에 불순물이 잔류한다. 고체상 정제방법에서는 핵산이 고체 지지체에 결합되는 반면에, 불순물은 선택적으로 용출된다. 예를 들어, 액체상 정제에 의해서 단리된 RNA는 액체상에 잔류하는 반면에, 불순물은 침전 및/또는 원심분리와 같은 방법에 의해서 제거된다. 고체상 정제방법에서, RNA는 고체 지지체에 결합하는 반면에, DNA, 단백질 및 인지질과 같은 불순물은 선택적으로 용출된다. 두가지 정제 카테고리는 모두 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 수득하는데 목적이 있다. 두가지 정제 카테고리는 모두 다수의 단계, 및 종종 유해한 시약을 필요로 하는 통상적인 방법뿐만 아니라, 소수의 단계 및 통상적으로 덜 유해한 시약을 필요로 하는 더 빠른 방법을 이용한다. RNA 정제의 경우에, 출발물질 (예를 들어, 생물학적 물질)이 세포를 포함한다면, 액체 및 고체 방법 둘 다는 세포 또는 바이러스 공동-파괴 (co-rupture), 또는 용해단계를 필요로 한다. 파괴 또는 용해 단계는 DNA, 리피드, 탄수화물, 단백질 등과 같은 오염물질과 혼합된 RNA를 제공한다. 이러한 혼합물은 RNA를 분해하며, 실질적으로 분해되지 않은 RNA를 수득하는 것을 저해하지 않도록 반드시 제거되고/되거나 불활성화되어야 하는 RNases를 또한 함유한다.

전통적으로, 액체상 RNA 단리방법은 액체-액체 추출 (즉, 페놀-클로로포름) 및 알콜 침전을 사용하였다. 한가지 통상적으로 사용되는 액체-액체 RNA 추출방법은 콤크진스키 (Chomczynski)와 사키 (Sacchi)의 "산-구아니디늄-페놀" 방법이다 (Chomczynski P., Sacchi N., Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal Biochem 162: 156-9 [1987]; 미국 특허 제 5,945,515, 5,346,994 및 4,843,155 호). 이 방법은 (1) 샘플을 산성 매질, 페놀 및 클로로포름이 연속적으로 첨가된 구아니디늄 이소티오시아네이트 (GITC) 용액으로 추출하고; (2) 페놀에 의해서 변성된 단백질을 중간층에 존재하는 핵산으로부터 제거할 수 있도록 혼합물을 원심분리하여 상을 분리시키고; (3) RNA를 침전시키고, 이에 의해 농축시키기 위하여 알콜을 첨가하고; (3) 정제된 RNA를 세척 및 재-수화시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 RNA의 정제를 보장하는 것으로 입증되었지만, 이것은 클로로포름 및 페놀과 같은 유해한 시약을 이용하고, 노동 집약적이며, 정제된 샘플 내에 유기시약이 잔류오염되기 쉽다.

양이온성 세제에 의한 핵산의 침전이 액체상 기술의 또 다른 예이다 (미국 특허 제 5,985,572; 5,728,822; 및 5,010,183 호 (MacFarlane)). 예를 들어, 미국 특허 제 5,989,572 호는 선택된 4급 아민 계면활성제를 사용하여 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 방법을 기술하였다. 무해한 액체상 정제방법은 낮은 pH 용해 및 침전시약을 사용하는 것으로 헤스 (Heath; 미국 특허 제 5,973,137 호)에 의해서 기술되었다. 그러나, 액체상 방법은 이들이 장황한 침전단계를 수반하며, 따라서 자동화하기가 어렵다는 심각한 단점을 갖는다. 따라서, 고-처리량 (high-throughput) RNA 정제에 대한 필요성이 고체상 방법의 개발을 선도하였다. 일부의 구체예에서, RNA 단리는 구아니디늄 이소티오시아네이트 중에서 세포를 균질화시키고, 이어서 나트륨 아세테이트 및 페놀, 및 클로로포름/이소아밀 알콜을 순차적으로 첨가하는 단계를 수반한다. 세포를 용해시키고 RNases를 억제하기 위하여 구아니디늄의 카오트로픽 염 (chaotropic salt)을 사용하는 몇가지 방법이 공지되어 있다. 원심분리한 후에, RNA는 알콜을 첨가함으로써 상부층으로부터 침전된다. 그 밖의 다른 방법에는 세포 현탁액에 뜨거운 페놀을 첨가하고, 이어서 알콜 침전시키는 방법이 포함된다. 이들 방법은 사용자에게 유해하며, 사용된 시약의 폐기에 비용이 많이 들 수 있다.

실질적으로 분해되지 않은 DNA는 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 공지된 다양한 액체 및 고체상 방법에 의해서 단리될 수 있다. 예를 들어, DNA는 문헌 (Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 또는 Persing et al . (eds.)(1993), Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (American Society for Microbiology, Washington D.C.))에 기술된 바와 같은 일상적인 기술에 의해서 단리될 수 있다.

고체상 DNA 정제를 위해서는 막 필터 (membrane filters), 자기 비드 (magnetic beads), 금속 옥사이드, 및 라텍스 입자를 포함한 다수의 고체 지지체가 사용되었다. 아마도 가장 광범하게 사용된 고체 지지체는 실리카-기본 입자이다 (참조예: 미국 특허 제 5,234,809 호 (Boon et al.); 국제 공보 제 WO 95/01359 호 (Colpan et al .); 미국 특허 제 5,405,951 호 (Woodard); 국제 공보 제 WO 95/02049 호 (Jones); WO 92/07863 (Qiagen GmbH)). 예를 들어, 미국 특허 제 5,234,809 호 (Boom et al .)에 기술된 방법은 실리카 입자에 DNA를 결합시키기 위하여 고농도의 카오트로픽 용액을 사용하며, 전체 혈액으로부터 DNA를 정제하기 위하여 6 회의 원심분리단계 및 5 개의 시약을 필요로 한다. 이 방법의 단점은 미립자 현탁액의 사용, 다수의 원심분리단계의 사용, 및 구아니디늄 이소티오시아네이트 및 아세톤과 같은 유해한 시약의 사용이다.

또 다른 예에서 미국 특허 제 5,496,562호 (Burgoyne)에는 4 회의 페놀 세척 및 5 회의 이소프로판올 세척 중에 4 개의 시약을 사용하여, 건조된 혈액을 함유하는 셀룰로즈 여과지를 정제하는 방법이 기술되어 있다. 건조시킨 후에, 여과지의 작은 조각을 정사각형으로 절단하고, PCR 증폭을 위한 기질로 직접 사용한다. 분석을 위해서 결합된 DNA를 사용함에도 불구하고, 이들 방법은 여전히 다수의 단계 및 유해한 시약을 필요로 한다.

샘플

생물학적 샘플과 같은 샘플은 다수의 수단에 의해서 수집할 수 있다. 예를 들어, 샘플 수집용기는 샘플을 수집하고 저장하기 위해서 사용된다. 몇가지 구체예에서, 수집용기는 탄성 스토퍼 (resilient stopper)를 갖는 유리 또는 플라스틱 튜브이다. 다른 구체예에서, 배기시켜 다량의 혈액을 튜브내로 배출시키는 혈액 수집튜브가 사용된다. 몇가지 구체예에서, 수집튜브는 특정의 시험을 위한 혈액 샘플을 제조하기 위해서 그 안에 함유된 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 다양한 첨가제를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가제는 항응고제이다. 일부의 경우에, 항응고제 첨가제는 수용액 중의 완충된 시트레이트 또는 헤파린이다. 다른 경우에는, 수성 시트레이트를 명시된 양으로 혈액 샘플과 배합하여 특정의 시험을 수행하는데 필요한 항응고제의 양을 결정한다. 그러나, 첨가제는 샘플 내의 핵산을 안정화시키지 않기 때문에 이러한 처리된 수집튜브는 주로 혈청학적 시험을 위해서 사용된다.

샘플-수집용기는 다양한 샘플을 수집 및/또는 저장하기 위해서 사용된다. 특정의 구체예에서는, 샘플 수집용기를 사용하여 생물학적 유체 또는 샘플 (예를 들어, 전혈액, 골수, 혈반 (blood spt), 혈청, 혈장, 연막 (buffy coat) 제제, 타액 및 뇌척수액, 구강 스와브 (buccal swabs), 배양된 세포, 박테리아의 세포 현탁액, 심장, 간 및 뇌와 같은 고형 동물조직, 대변 및 뇨와 같은 신체 노폐물, 공기, 물, 퇴적물 또는 토양으로부터 취한 환경샘플, 식물 조직, 효모, 박테리아, 바이러스, 마이코플라즈마, 진균, 프로토조아, 리케차 및 그 밖의 다른 작은 미생물 세포)을 수집 및/또는 저장한다. 그 밖의 다른 구체예에서는, 샘플 수집용기를 사용하여 생물학적 물질의 용해물, 균질액 또는 부분적으로 정제된 샘플을 수집 및/또는 저장한다. 그 밖의 다른 경우에, 생물학적 물질은 핵산의 조혼합물 또는 부분적으로 정제된 혼합물을 포함한다.

최근에 소개된 몇가지 시판 생성물은 수집튜브 내에 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액)을 보존하며, 또한 핵산을 "안정화"시킨다. "안정화"는 분해로부터 RNA를 보호하고, 샘플을 핵산의 후정제를 위해서 저장하도록 허용하는데 특히 유용하다. 프레아날리틱스 (PreAnalytiX™; Valencia, CA)는 DNA 또는 RNA의 안정화를 위한 혈액 수집튜브를 제공한다 (미국 특허 제 6,617,170 호). 이들 튜브의 상품명은 팍스진 (Paxgene™) DNA 수집튜브, 및 팍스진 (Paxgene™) RNA 수집튜브이다. 이들 튜브는 테트라데실-트리메틸암모늄 옥살레이트 및 타트타르산의 제제를 사용한다. 팍스진 혈액 튜브는 전혈액의 수집, 및 혈액 샘플 내의 RNA의 안정화를 위해서 사용된 플라스틱 배기튜브이다. 프레아날리틱스는 추가로, 이들 수집튜브로부터 DNA 또는 RNA의 정제를 위한 별개의 키트를 제공한다.

어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems, Foster City, USA)는 RNA의 안정화를 위한 혈액 수집튜브를 시판하고 있다. 이들 튜브의 상품명은 템퍼스 (Tempus™) RNA 수집튜브이다. 이들 튜브는 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 제제를 사용한다. 이 생성물의 용액은 전혈액으로부터 전체 RNA를 실온에서 5일까지 동안 안정화시킨다.

암비온 (Ambion; Austin, TX)은 RNA 안정화를 위한 시약을 제공한다 (미국 특허 제 6,528,641 호). 이 시약의 상품명은 RNA래터 (RNAlater™) 용액이다. 이 시약은 암모늄 설페이트의 제제를 사용한다. RNA래터는 온전하고 동결되지 않은 조직 및 세포 샘플 내에서 세포성 RNA를 안정화시키고 보호하는 수성 조직 및 세포 저장시약이다. RNA래터는 샘플을 즉시 처리하거나, 후처리를 위해 액체 질소 중에서 샘플을 동결시킬 필요성을 제거한다. 사용자는 저장할 조직 샘플을 절단하여 이들을 적어도 하나의 크기가 0.5 ㎝ 미만이도록 하고, 이들이 샘플로부터 핵산을 정제할 준비가 될 때까지 이들을 5 용적의 RNA래터에 액침시킨다.

오메가 바이오-테크 (Omega Bio-Tek)는 RNA의 안정화를 위한 시약을 시판하고 있다. 이 시약의 상품명은 RNA세이퍼 안정화제 시약 (RNAsafer™ Stabilizer Reagent)이다. 이 시약이 샘플에 일단 적용되면, 이것은 세포 및 조직에 침투하여 실온에서 RNases를 불활성화시킨다. 샘플은 RNA세이퍼 안정화제 시약 중에서 -20℃로 12 개월까지 동안 저장될 수 있다.

본 발명의 방법

시약

본 발명은 몇가지 카테고리의 시약을 특징으로 한다: 희석 용액, 가용화 용액, 용해 용액, 프로테이나제 K 용액, 결합 용액, 세척 용액, 및 용출 용액.

(i) 희석 용액: 몇가지 구체예에서는 희석제를 안정화제의 존재 하에서 생물학적 물질에 첨가하여 조용해물의 침전을 촉진시킨다. 템퍼스 용액 (Applied Biosystems, Inc.)의 제조자는 PBS가 사용된다고 명시하였다. PAX 시스템은 희석 용액을 필요로 하지 않는다. 이하의 실시예 4에 기술된 한가지 구체예에서는 알콜을 사용하여 공정의 안전성 (robustness)을 개선시켰다.

( ii ) 가용화 용액: 가용화 용액은 원심분리한 후에 샘플 펠릿을 가용화시켜 조용해물을 생성시키기 위해서 사용된다. 일부의 구체예에서, 가용화 용액 제제는 완충액, 염기, 세제 또는 계면활성제 또는 이들의 혼합물과 같은 양친매성 시약, 및 임의의 킬레이터 (chelator)를 포함한다. 예를 들어, 가용화 용액은 pH 7-9 (예를 들어, pH 7.1, 7.3, 7.5, 7.8, 8.0, 8.2, 8.6, 8.8, 8.9 또는 9)의, 트리스 HCl과 같은 완충액을 함유할 수 있다. 일부의 구체예에서, 완충액 농도는 10-20 mM (예를 들어, 10.5 mM, 11 mM, 11.7 mM, 12 mM, 12.5 mM, 13 mM, 13.6 mM, 14 mM, 14.2 mM, 14.8 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM 또는 19.5 mM)일 수 있다. 염기 농도는 20-50 mM (예를 들어, 21 mM, 25 mM, 27 mM, 31 mM, 35 mM, 38 mM, 47 mM, 또는 49 mM의 트리스 염기)일 수 있다. 일부의 경우에, 가용화 용액은 추가로 양친매성 시약을 포함할 수 있다. 양친매성 시약은 탄화수소 쇄와 같은 소수성 작용기에 부착된 친수성 기를 갖고, 계면활성제 특성을 갖는 화합물 또는 분자를 포함한다. 일부의 경우에, 양친매성 시약은 세제이다. 음이온성, 양이온성 및 양성이온성 (zwitterionic) 세제가 사용될 수 있다. 특정의 경우에는, 비이온성 세제가 핵산 단리에 사용된다. 그 밖의 다른 구체예에서는, 트윈 부류 (Tween class)의 비이온성 세제가 사용된다 (예를 들어, 트윈-20, 트윈-40, 트윈-60, 트윈-80 등). 일부의 경우에는 트리톤 (Triton) 부류의 세제가 사용된다 (예를 들어, X-100, X-114, XL-80N 등). 그 밖의 다른 경우에는 테르지톨 (Tergitols; 예를 들어, XD, TMN-6), 모니데트 (Monidets) 또는 이게팔 (Igepal; 예를 들어, NP-40)이 사용된다. 일부의 구체예에서, 비이온성 세제는 5-15％ (예를 들어, 약 5％, 7％, 8％, 10％, 12％ 또는 14％의 트리톤-X)의 농도로 사용된다. 그 밖의 다른 구체예에서, 킬레이트화제인 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)은 1-20 mM (예를 들어, 5-10 mM, 6-9 mM, 7-8 mM, 8 mM 또는 7.5 mM)의 농도로 첨가된다.

( iii ) 용해 용액: 용해 용액은 핵산을 방출시키기 위한 효율적인 용해 (예를 들어, 생물학적 샘플 내의 세포의 용해)를 가능하게 하며, 핵산-분해성 효소의 활성을 효과적으로 억제하고, 핵산이 선택된 고체 지지체에 결합하도록 허용한다. 본 발명의 용해 용액은 완충액 (예를 들어, 트리스-HCl), 알칼리-금속염 (예를 들어, 나트륨염, 예를 들어, 나트륨 클로라이드, 또는 리튬염, 예를 들어, 리튬 클로라이드 또는 리튬 브로마이드), 양친매성 시약 (예를 들어, 세제 또는 계면활성제, 또는 이들의 혼합물), 및 임의로 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA 또는 CDTA)를 함유한다. 본 발명의 용해 용액은 구아니디늄염, 우레아 등과 같은 강력한 카오트로픽 물질의 첨가를 필요로 하지 않는다는 점에서 독특하다. 구아니디늄염 및 우레아는 물의 구조를 붕괴시키며, 따라서 소수성 상호작용의 강도를 감소시키는 경향이 있어서 다른 용질분자에 대한 격렬한 효과를 나타내는 강력한 카오트로픽 염이다. 예를 들어, 우레아는 물에 용해하면 단백질의 이급, 삼급 및 사급 구조를 붕괴시키고, 이어서 RNA로부터 단백질의 해리를 야기한다. 구아니디늄염 및 우레아는 흡열반응을 통해서 물에 용해한다. 구아니디늄염 및 우레아는 상대적 카오트로픽 강도에 따라서 양이온 및 음이온의 순위를 정하는 광범하게 사용되는 시스템인 호프마이스터 시리즈 (Hofmeister series)에 의해서 정의되는 바와 같은 강력한 카오트로픽 염인 것으로 생각된다 (F. Hofmeister, On the understanding of the effects of salts, Arch . Exp . Pathol . Pharmakol . (Leipzig) 24 (1888) 247-260).

강력한 카오트로픽 염과는 달리, 물 중의 알칼리-금속염 (예를 들어, 나트륨 클로라이드, 리튬 클로라이드 및 리튬 브로마이드)의 반응은 발열반응이고, 강력한 코스모트로픽 (kosmotropic) 리튬 이온에 의해서 나타나는 상당한 이온-쌍극자 (dipole) 상호작용 및 결과로 얻어지는 큰 용해도를 나타낸다. 이들과 같은 차이는 본 발명의, 구아니디늄염과 같은 강력한 카오트로픽 물질과 알칼리-금속염, 특히 리튬 클로라이드 사이의 차이를 나타내는 것이다.

용해 용액의 첫번째 성분은 용액의 pH를 유지시키는 완충액 (예를 들어, 트리스 완충액, 또는 그 밖의 다른 공지된 완충액)이다. 예를 들어, 완충액의 pH는 약 8 이상, 약 8.5 이상, 또는 약 9 이상까지 (예를 들어, 8.1, 8.4, 8.6, 8.7, 8.9, 9.1 또는 9.5)일 수 있다. 완충액은 약 8 이상 (예를 들어, 8.1, 8.3, 8.5, 8.6, 8.8 또는 8.9)의 pKa를 가질 수 있으며, 50-150 mM (예를 들어, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM 또는 140 mM)의 농도로 사용될 수 있다. 일부의 구체예에는 트리스 완충액이 적절한 완충액이다. 일부의 경우에는 pH가 8.0인 100 mM 농도의 트리스 완충액이 사용된다. 일부의 다른 구체예에서, 염기는 용해 용액의 pH를 조정하기 위해서 사용될 수 있다. 염기는 용액의 pH를 7 이상 (예를 들어, pH 7.5, 8, 8.5 또는 9.0)으로 상승시킬 수 있는 것일 수 있다. 일부의 경우에, 염기는 알칼리-금속 하이드록사이드일 수 있다. 이러한 알칼리-금속 알콕사이드에는 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 및 리튬 하이드록사이드가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

용해 용액의 또 다른 성분은 핵산이 단백질, 인지질 등과 같은 다른 오염물질 대신에 고체 지지체에 선택적으로 결합할 수 있도록 핵산에 대해 독특한 결합특성을 부여하는 컴플렉스화 염 (예를 들어, RNA-컴플렉스화 염)이다. 일부의 구체예에서, 이러한 컴플렉스화 염은 나트륨염, 또는 리튬 클로라이드 또는 리튬 브로마이드와 같은 리튬염과 같은 어떤 공지된 컴플렉스화 염이라도 될 수 있다. DNA 및 RNA의 고체 지지체에 대한 선택적 결합은 알칼리-금속염의 고농도에 의해서 증진되기 때문에 염은 3-10 M의 농도 (예를 들어, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M, 8 M 또는 9 M)로 존재할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 리튬 클로라이드가 용해 용액 중에서 4 M의 농도로 사용된다.

용해 용액은 추가로 하나 이상의 양친매성 시약을 포함한다. 양친매성 시약은 탄화수소 쇄와 같은 소수성 작용기에 부착된 친수성 기를 갖고, 계면활성제 특성을 갖는 화합물 또는 분자를 포함한다. 일부의 구체예에서, 양친매성 시약은 세제이다. 음이온성, 양이온성 및 양성이온성 세제가 사용될 수 있지만, 핵산 단리는 비이온성 세제를 사용함으로써 최적으로 달성된다. 어떤 비이온성 세제라고 사용될 수 있지만, 비이온성 세제의 예는 트윈 부류 (트윈-20, 트윈-40, 트윈-60, 트윈-80 등), 트리톤 부류 (예를 들어, X-100, X-114, XL-80N 등), 테르지톨 (XD, TMN-6 등), 모니데트 또는 이게팔 (NP-40 등)로부터 선택되는 것이다. 비이온성 세제는 5-15％ (예를 들어, 약 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도로 사용될 수 있다. 그 밖의 다른 구체예에서, 양친매성 시약은 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (DGME)와 같은 계면활성제이다. 계면활성제는 5-15％ (예를 들어, 6％, 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도로 사용될 수 있다. 일부의 경우에는, 세제와 계면활성제의 배합물이 사용될 수 있다. 특정의 경우에는, 세제와 계면활성제 트리톤-X 및 DGME의 배합물이 사용된다. 배합물은 5-15％ (예를 들어, 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도일 수 있다. 예를 들어, 배합물은 5％ 트리톤-X와 5％ DGME이다.

RNA와 같은 핵산의 분해를 방지하기 위해서 뉴클레아제-부재 물이 용해 용액에서 사용된다. 일부의 구체예에서, 킬레이트화제는 또한 오염성 핵산의 분해를 방지하기 위해서 사용될 수도 있다. 킬레이트화제의 사용은 핵산 중합체를 추가의 오염문제를 야기할 수 있는 더 작은 단편으로 분해되는 것으로부터 보호한다. 킬레이트화제는 1-100 mM (예를 들어, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 35 mM, 45 mM, 50 mM, 65 mM, 75 mM, 85 mM, 또는 95 mM)의 농도로, 또는 1-10 mM (예를 들어, 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 6 mM, 7 mM, 또는 9 mM)의 농도로 존재할 수 있다. 일부의 경우에는 킬레이트화제 EDTA가 사용된다. 다른 경우에는 킬레이트화제 CDTA가 사용된다.

본 발명의 용해 용액은 유리하다. 중성- 내지 고-pH 완충액 중의 고농도의 컴플렉스화 염과 고농도의 세제의 독특한 배합물은 페놀, 클로로포름 및 구아니디늄염과 같은 시약을 사용하지 않고도 핵산에 유해한 효소 (예를 들어, RNases)를 불활성화시킨다. 추가로, 용액은 핵산이 선택된 고체 지지체와 단단히 결합하도록 핵산에 높은 결합특성을 부여한다.

( iv ) 임의의 프로테이나제 K 용액: 일부의 구체예에서, RNA 정제 중에 사용자는 추가의 프로테이나제 K 단계를 수행한다. 일부의 구체예에서는 DNA 정제 중에 사용자가 추가의 프로테이나제 K 단계를 수행한다. 적합한 프로테이나제 K 용액은 약 10 내지 25 ㎎/㎖ 프로테이나제 K (예를 들어, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖ 또는 25 ㎎/㎖)를 포함한다. 특정의 경우에, 적합한 프로테이나제 K 용액은 20 ㎎/㎖ 농도의 프로테이나제 K를 갖는다.

(v) 결합 용액: 결합 용액은 고체 지지체에 대한 DNA의 결합을 개선시키기 위하여 안정화된 샘플로부터 DNA를 정제하는 경우에 사용될 수 있다. 결합은 염 농도의 상당한 증가를 통해서, 탈수에 의해서, 또는 이들 둘 다에 의해서 개선될 수 있다. 본 발명은 다음의 성분들을 갖는 결합 용액을 특징으로 한다: 완충액, 알칼리 금속염, 및 세제 또는 계면활성제 또는 이들의 혼합물과 같은 양친매성 시약.

결합 용액의 첫번째 성분은 용액의 pH를 유지시키는 완충액이다. 예를 들어, pH는 약 7 이상 (예를 들어, 7.5, 8, 8.5, 9 또는 9.5)일 수 있다. 완충액은 50-150 mM (예를 들어, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM 또는 140 mM)의 농도로 사용될 수 있다. 일부의 구체예에서는, 트리스 완충액이 적절한 완충액이다. 임의로, 염기를 사용하여 결합 용액의 pH를 조정할 수 있다. 염기는 용액의 pH를 7 이상 (예를 들어, pH 7.5, pH 8, pH 8.5 또는 pH 9.0)으로 상승시킬 수 있는 것일 수 있다. 일부의 구체예에서, 염기는 알칼리-금속 알콕사이드일 수 있다. 이러한 알칼리-금속 알콕사이드는 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 및 리튬 하이드록사이드를 포함한다.

결합 용액의 또 다른 성분은 핵산이 단백질, 인지질 등과 같은 다른 오염물질에 비해서 고체 지지체에 선택적으로 결합할 수 있도록 핵산에 대해 독특한 결합특성을 부여하는 컴플렉스화 염이다. 예를 들어, 이러한 컴플렉스화 염은 나트륨염, 또는 리튬 클로라이드 또는 리튬 브로마이드와 같은 리튬염과 같은 어떤 공지된 컴플렉스화 염이라도 될 수 있다. DNA의 고체 지지체에 대한 선택적 결합은 알칼리-금속염의 고농도에 의해서 증진되기 때문에 염은 5-15 M의 농도 (예를 들어, 약 6 M, 7 M, 8 M, 9 M, 10 M, 11 M, 12 M, 13 M, 또는 약 14 M)로 존재할 수 있다.

결합 용액의 또 다른 성분은 양친매성 시약이다. 양친매성 시약은 탄화수소 쇄와 같은 소수성 작용기에 부착된 친수성 기를 갖고, 계면활성제 특성을 갖는 화합물 또는 분자를 포함한다. 일부의 구체예에서, 양친매성 시약은 세제이다. 음이온성, 양이온성 및 양성이온성 세제가 사용될 수 있지만, 핵산 단리는 비이온성 세제를 사용함으로써 최적으로 달성된다. 어떤 비이온성 세제라고 사용될 수 있지만, 비이온성 세제의 예는 트윈 부류 (트윈-20, 트윈-40, 트윈-60, 트윈-80 등), 트리톤 부류 (예를 들어, X-100, X-114, XL-80N 등), 테르지톨 (XD, TMN-6 등), 모니데트 또는 이게팔 (NP-40 등)로부터 선택되는 것이다. 비이온성 세제는 5-15％ (예를 들어, 약 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도로 사용될 수 있다. 그 밖의 다른 구체예에서, 양친매성 시약은 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (DGME)와 같은 계면활성제이다. 계면활성제는 5-15％ (예를 들어, 6％, 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도로 사용될 수 있다. 일부의 경우에는, 세제와 계면활성제의 배합물이 사용될 수 있다. 특정의 경우에는, 세제와 계면활성제 트리톤-X 및 DGME의 배합물이 사용된다. 배합물은 5-15％ (예를 들어, 10％, 11％, 12％, 13％ 또는 14％)의 농도일 수 있다. 예를 들어, 배합물은 5％ 트리톤-X와 5％ DGME이다.

세제 또는 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양성이온성 또는 비온성일 수 있다. 한가지 구체예에서는 비이온성 세제가 사용된다. SDS와 같은 약간의 하전된 세제는 고농도 염 용액 중에서 가용화되어 유지되지 않으며, 실제로 이들은 오히려 빠르게 침전하는 경향이 있을 수 있는 것으로 관찰되었다. 그러나, 고체 지지체를 전-처리하기 위하여 본 발명의 한가지 구체예에 기술된 것을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 특정의 실험조건 하에서 이러한 하전된 세제를 사용할 수 있다. 비이온성 세제의 예로는 세제의 트윈, 트리톤, 테르지톨 및 모니데트 또는 이게팔 부류로부터 선택되는 세제가 포함된다. 한가지 구체예에서, 계면활성제는 DGME (디에틸 글리콜 모노에틸 에테르)이다. DNA 정제의 특정한 경우에, 세제의 수를 감소시킴으로써 키트를 단순화시키기 위하여 세척 I이 결합 용액으로 사용될 수도 있다.

( vi ) 세척 용액: 본 발명은 또한, 단백질, 인지질 등과 같은 비-핵산 오염물질을 제거하도록 핵산이 결합된 고체 지지체를 세척하기 위하여 사용되는 하나 이상의 세척 용액을 시시한다. 세척 용액은 50％ 초과의 농도 (예를 들어, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％)로 알콜을 함유할 수 있다. 알콜은 예를 들어, 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 일부의 구체예에서는 에탄올이 75％의 농도로 사용된다. 다른 구체예에서는 메탄올이 65％의 농도로 사용된다. 세척 I 용액은 4-10 M (예를 들어, 5-6 M, 4-7 M, 5-8 M, 6-9 M, 6-10 M, 7-10 M, 5 M, 6 M, 7 M, 8 M, 9 M, 또는 10 M)의 농도로 나트륨 또는 리튬염 (예를 들어, 리튬 클로라이드 또는 리튬 브로마이드)과 같은 고농도 알칼리 금속염을 함유한다. 본 발명의 목적에 따라, 높은 염 농도는 효소 활성을 억제하고, 핵산에 컴플렉스화하고, 고체상에 대한 핵산의 결합에 대한 염석효과를 제공하도록 하기에 충분히 높은 염 농도를 의미한다. 세척 I 용액은 추가로 알콜 (예를 들어, 에탄올 또는 메탄올)을 함유한다. 알콜 농도는 25-80％ (예를 들어, 30-40％, 40-50％, 35-45％, 55-65％, 60-70％, 65-75％, 70-80％, 30％, 40％, 55％, 60％, 70％ 또는 75％)이다. 일부의 구체예에서, 세척 I 용액은 에탄올을 70％의 농도로 함유한다. 그 밖의 다른 구체예에서, 세척 I 용액은 메탄올을 80％의 농도로 함유한다.

세척 II 용액은 완충액, 알콜, 및 임의의 킬레이터 (예를 들어, EDTA 또는 CDTA)를 함유한다. 본 발명의 목적에 따라, 세척 II 용액은 잔류하는 어떤 생물학적 물질이라도 제거하기 위한 최종 세척을 위해서 제공된다. 일부의 구체예에서, 완충액 조성물은 pH 6-8 (예를 들어, pH 6.5, 7 또는 7.5)과 같은 트리스-HCl일 수 있다. 완충액 농도는 50-150 mM (예를 들어, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 또는 140 mM)일 수 있다. 세척 II 용액은 추가로 알콜 (예를 들어, 에탄올 또는 메탄올)을 함유할 수 있다. 알콜 농도는 50-90％ (예를 들어, 55-65％, 60-70％, 65-75％, 70-80％, 55％, 60％, 60％, 75％, 80％ 또는 85％)일 수 있다. EDTA 농도는 1-20 mM (예를 들어, 5-10 mM, 7-15 mM, 10-17 mM, 15-20 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 15 mM, 17 mM, 또는 19 mM)일 수 있다. 특정의 경우에, 세척 II는 80％ 농도의 에탄올 및 8 mM 농도의 EDTA를 함유한다. 그 밖의 다른 경우에, 세척 II는 70％ 농도의 에탄올 및 10 mM 농도의 EDTA를 함유한다. 특정의 구체예에서, 세척 II는 60％ 농도의 메탄올 및 12 mM 농도의 EDTA를 함유한다. 그 밖의 다른 구체예에서, 세척 II는 75％ 농도의 메탄올 및 9 mM 농도의 EDTA를 함유한다.

DNA 제거는 단리된 RNA가 필요한 특정의 적용분야를 위해서 바람직할 수 있거나 더 중요할 수 있다. 본 발명의 DNase 세척 용액을 사용한 DNase 소화가 RNA 샘플로부터 DNA 오염을 제거하는 효과적인 방법인 것으로 입증되었다. DNase 세척 용액은 알콜 (예를 들어, 에탄올 또는 메탄올), 염 및 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA 또는 CDTA)를 함유한다. 알콜 농도는 10-50％ (예를 들어, 10-30％, 20-40％, 30-50％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％ 또는 45％)일 수 있다. 일부의 구체예에서, 알콜은 50％ 농도의 에탄올일 수 있다. 특정의 구체예에서, DNase 세척 용액은 리튬염 (예를 들어, 리튬 클로라이드, 리튬 브로마이드)과 같은 염을 함유할 수 있다. 리튬염 농도는 2-5 M (예를 들어, 3-4 M, 2 M, 3 M, 4 M 또는 5 M)일 수 있다. 일부의 경우에, DNase 세척 용액은 4 M 농도로 리튬 클로라이드를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제제는 추가로 킬레이트화제를 함유할 수 있다. 특정의 경우에, 킬레이트화제는 EDTA일 수 있다. 그 밖의 다른 경우에, 킬레이트화제는 시트레이트일 수 있다. 킬레이트화제는 25-100 mM (예를 들어, 30-70 mM, 40-80 mM, 50-90 mM, 35 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 75 mM, 85 mM, 또는 95 mM 트리나트륨 시트레이트)의 농도로 존재할 수 있다. 일부의 구체예에서, DNase 세척 용액은 30％ 농도의 에탄올, 4 M 농도의 LiCl, 및 50 mM 농도의 EDTA를 함유한다. 그 밖의 다른 구체예에서, DNase 세척 용액은 40％ 농도의 에탄올, 5 M 농도의 LiCl, 및 65 mM 농도의 EDTA를 함유한다.

( vii ) 용출 용액: 단리과정의 결과로 고체 지지체에 결합된, 실질적으로 분해되지 않은 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)은 용출 용액을 사용하여 용출시킬 수 있다. 생물학적 물질을 용해시키고, 고체 지지체에 핵산을 결합시키는데, 및 본 발명에 의해서 지시된 고체 지지체를 세척하는데 사용된 시약의 단순성이 간단한 용출 용액에 적합하다. 다양한 용출 용액은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 일부의 구체예에서는 베르사젠 (Versagene™) DNA 용출 용액 (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN)이 실질적으로 분해되지 않은 결합된 DNA를 용출시키기 위해서 사용될 수 있다. 일부의 경우에는 트리스-EDTA (TE)가 실질적으로 분해되지 않은 결합된 DNA를 용출시키기 위해서 사용될 수 있다.

고체 지지체에 결합된, 실질적으로 분해되지 않은 RNA는 RNA 용출 용액을 사용하여 용출될 수 있다. 일부의 경우에는 베르사젠 (Versagene™) RNA 용출 용액 (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN)이 실질적으로 분해되지 않은 결합된 RNA를 용출시키기 위해서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서는, 물을 디에틸 피로카보네이트 (DEPC)와 같은 RNases를 불활성화시키는 물질로 처리하여 RNA를 용출시키기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에게 공지된 다른 RNA 용출 용액이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 젠트라 고체상 (Gentra Solid Phase) RNA 용출 용액 (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN)이 사용될 수 있다.

고체 지지체

다양한 고체 지지체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 고체 지지체에는 예를 들어, 유리섬유와 같은 실리카-기본 지지체, 또는 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 니트로셀룰로즈, 나일론, 폴리에스테르, 폴리에테르설폰, 폴리올레핀, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 및 이들의 배합물과 같은 그 밖의 다른 물질이 포함된다. 일부의 구체예에서, 고체 지지체는 플러그-유동 (plug-flow) 또는 연속-유동 (continuous-flow) DNA 단리방법이 가능하도록 용기 내에 넣거나, 용기 내에서 고정화시킬 수 있다. 그 밖의 다른 구체예에서, 고체 지지체 물질은 튜브 또는 플레이트와 같은 적합한 용기 내에 고정화시키거나 넣을 수 있는 막, 디스크 (disk), 또는 실린더와 같은 독립적인 고체 지지체를 생성시키도록 충진될 수 있다. 일부의 구체예에서, 고체 지지체는 생물학적 물질과의 최적 접촉이 이루어지도록 섬유상이거나 미립상일 수 있다. 본 발명의 시약과 함께 사용하기에 적합한 고체 지지체의 크기는 물질 (예를 들어, 생물학적 물질)의 용적에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 유리섬유 막은 다양한 양의 DNA의 결합, 정제 및 용출이 가능하도록 하기 위하여 다양한 크기로 절단할 수 있다.

본 발명의 시약과 함께 사용하기에 적합한 고체 지지체의 형상은 예를 들어, 시트, 미리 절단된 디스크, 실린더, 단일 섬유, 또는 미립자로 구성된 고체 지지체일 수 있다. 고체 지지체의 물질은 적합한 용기 내에 고정화시키거나 넣을 수 있는 막, 디스크, 또는 실린더와 같은 독립적인 고체 지지체를 생성시키도록 충진될 수 있다. 필요한 경우에, 고체 지지체는 적절한 용기, 예를 들어, 종이 형태 (예를 들어, 구트리에 카드 (Guthrie card)), 미량원심분리 튜브, 스핀 튜브, 96-웰 플레이트, 챔버 또는 카트리지 내에 함유된다. 그 예는 배스킷 (basket) 내의 와트만 (Whatman) D 유리섬유 막이며, 2 ㎖ 미량원심분리 튜브 내부에 배치된다. 고체 지지체가 섬유를 갖는 경우에, 이것은 섬유를 적절하게 충진하고, 최적 핵산 결합, 및 단백질, 인지질 등과 같은 오염물질의 세척을 가능하도록 하기 위하여 적합한 용기 내에 넣을 수 있다.

일부의 경우에, 고체 지지체는 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 내에 존재하는 RNA를 분해시키기 위해서 RNase로 전-처리될 수 있다. 다른 경우에, 정제는 RNase-처리된 칼럼 (예를 들어, Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN에 의해서 제공되는 것)을 사용하여 개선될 수 있다. RNase-처리된 칼럼은 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 내에 존재하는 RNA를 분해시킨다. 추가로, 전-처리된 칼럼을 사용하여 일부의 DA 단리방법에서 필요한 것과 같은 별도의 RNase 소화단계에 대한 필요성을 제거한다. RNA 단리의 일부의 구체예에서, DNA 용해 용액은 고체 지지체 (예를 들어, 섬유 등)를 제조하는데 사용된 물질에 직접적으로 첨가될 수 있거나, 이것을 최종 사용자-준비 형태 (user-ready form)(예를 들어, 종이, 스와브, 디스크, 플러그, 칼럼 등)으로 제조하기 전에 건조시키도록 할 수도 있다.

정제/단리방법

본 발명은 또한, 팍스진 (Paxgene™), RNA세이퍼 (RBAsafer™), RNA레터 (RNAlater™) 및 템퍼스 (Tempus™) 용액이라는 상품명으로 이용되는 시약을 포함한 안정화 시약 내에 보존된 물질 (예를 들어, 생물학적 물질) ("안정화된 샘플")로부터 DNA 또는 RNA, 또는 이들 둘 다를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 교시된 시약 및 고체 지지체는 그 자체가 대체 단리방법에 적합하다.

일부의 구체예에서는, 희석제를 안정화 시약의 존재하에서 생물학적 물질에 첨가하여, 안정화된 샘플을 추가 정제하기 전에 조용해물의 제조를 용이하게 한다.

일부의 구체예에서는, 안정화된 샘플을 용해 용액과 접촉시키기 전에 가용화 용액과 접촉시킨다. 안정화 시약이 샘플 내의 핵산을 완전히 용해시키고 가용화시키는 다른 경우에는 가용화 용액이 필요하지 않을 수 있다.

일부의 구체예에서, 용해 용액과 가용화 용액을 배합할 수 있다.

일부의 경우에는, 샘플을 고체 지지체와 접촉시키기 전에 용해 용액을 안정화된 샘플과 접촉시킨다. 용해물을 고체 지지체에 첨가하기 전에, 용해 용액을 사용하여 물질 (예를 들어, 생물학적 물질)을 용해시키고, 핵산을 용해물 내로 방출시킨다. 또한, 용해 용액은 뉴클레아제와 같은 유해한 효소의 해로운 효과를 방지한다. 용해 용액 용적은 안정화된 샘플의 용적에 따라서 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일단 가용화된 샘플이 용해되면, 용해물은 다음에 고체 지지체에 첨가한다. 다른 경우에, 용해 용액은 고체 지지체에 직접적으로 첨가될 수 있으며, 이렇게 하여 단계를 배제하고, 방법을 더 단순화시키게 된다. 이 구체예에서는, 용해 용액을 고체 지지체에 적용한 다음에, 안정화된 샘플을 전-처리된 고체 지지체와 접촉시키기 전에 고체 지지체 상에서 건조시킬 수 있다.

RNase 및 DNase와 같은 효소를 고체 지지체에 직접 첨가하여 칼럼을 전-처리하거나, 용해 용액에 첨가하여 샘플 내에 존재하는 오염성 RNA 또는 DNA를 분해시킬 수도 있다. 전-처리된 칼럼과 용해 및/또는 RNase 또는 DNase를 사용하여 통상적인 방법에서 일반적으로 필요한 바와 같은 별도의 용해 및/또는 뉴클레아제 소화단계의 필요성을 제거한다.

DNA를 정제한 다음에 용해시키는 일부의 구체예에서, 고체 지지체에 대한 핵산의 결합은 결합 용액을 사용함으로써 개선될 수 있다. 결합은 염 농도의 상당한 증가에 의해서, 탈수에 의해서, 또는 이들 둘 다에 의해서 개선될 수 있다.

핵산의 용해 및 결합에 이어서, 핵산이 고체 지지체에 결합된 채로 남아 있도록, 잔류하는 생물학적 물질은 어떤 것이라도 원심분리, 피펫팅 (pipetting), 압력, 진공과 같은 적합한 수단에 의해서, 또는 이들 수단과 세척 용액과의 병용 사용에 의해서 임의로 제거된다. 일부의 경우에, 세척단계는 샘플 타입 및 샘플 내의 비-핵산 생물학적 물질의 양의 끈질김 (tenaciousness)에 따라서 반복될 수 있다. 단백질, 인지질 등을 포함하는 비-핵산 생물학적 물질의 잔여물은 우선 원심분리에 의해서 제거될 수 있다. 이렇게 함으로써, 비결합된 오염물질들은 고체 지지체로부터 단리된다. 세척단계는 고체 지지체로부터 실질적으로 모든 오염물질을 제거하며, 고체 지지체에 선택적으로 결합된 핵산을 남아 있도록 한다.

이어서, 결합된 핵산은 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에 공지된 용출 용액의 적절한 양을 사용하여 용출시킬 수 있다. 그 후, 고체 지지체를 원심분리하거나, 압력 또는 진공을 받도록 하여 고체 지지체로부터 핵산을 방출시킨 다음에, 적합한 용기 내에서 수집할 수 있다.

도 1은 본 발명을 사용하여 샘플로부터 DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 단리하는 과정을 도시한 흐름도이다. 일부의 구체예에서, 사용자는 본 발명에 특정화된 방법에 따라서 샘플로부터 단지 DNA 만의 단리를 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 사용자들은 본 발명에서 특정화된 방법에 따라 단지 RNA 만의 단리를 수행할 수도 있다. 일부의 구체예에서, 동일한 샘플로부터 RNA 및 DNA 둘 다의 단리를 수행하도록 선택한 사용자는 그의 수집 후에 샘플을 나눌 수 있다. 다른 경우에, 동일한 샘플로부터 RNA 및 DNA 둘 다의 단리를 수행하도록 선택한 사용자는 가용화 단계 후에 샘플을 나눌 수 있다.

제조의 제품

본 발명에서 특정화된 시약, 방법 및 키트는 핵산이 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에게 공지된 하류 방법에서 사용될 수 있도록 비교적 소량의 오염성 불순물을 갖는 실질적으로 순수하고 분해되지 않은 핵산을 제공한다. 본 발명은 특히, 시약 및 임의로 본 명세서에 기술된 고체 지지체와 함께, 본 발명의 방법에 따라 샘플로부터 DNA, RNA 또는 DNA와 RNA 둘 다를 정제하기 위해서 사용될 수 있는 키트를 특징으로 한다. 실질적으로 순수한, 분해되지 않은 핵산은 핵산 정량화, 제한효소 소화, DNA 서열결정, 서던 블러팅 (Southern Blotting) 등과 같은 하이브리드화 기술, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR), 리가제 연쇄반응 (LCR), 핵산 서열-기본 증폭 (NASBA), 자력 서열복제 (Self-sustained Sequence Replication; SSR 또는 3SR), 스트랜드 전위 증폭 (Strand Displacement Amplification; SDA), 및 전사 매개된 증폭 (Transcription Mediated Amplification; TMA)와 같은 증폭방법, 정량적 PCR (qPCR), 또는 그 밖의 다른 DNA 분석, 및 RT-PCR, 시험관내 해독, 노던 블러팅 (Northern blotting), 마이크로어레이 (microarray) 분석 및 그 밖의 RNA 분석을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 후속 분석에서 사용하기에 적합한 핵산이다.

본 발명은 본 명세서에 포함된 상세한 실시예를 참고로 하여 더 설명될 수 있다. 이들 실시예는 다양한 구체적이고 예시적인 구체예 및 기술을 더 설명하기 위해서 제공된다. 그러나, 본 발명의 범주 내에 유지되면서 다수의 변이 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 팍스진 (PAXgene) 혈액 RNA 수집튜브에 수집된 샘플로부터 DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 단리하거나, 본 발명을 사용하여 템퍼스 혈액 RNA 수집튜브에 수집된 샘플로부터 DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 단리하기 위해서 사용될 수 있는 방법을 도시한 흐름도 (flow chart)이다.
도 2 내지 4는 템퍼스 혈액 RNA 수집튜브로부터 조용해물의 제조를 위하여 상이한 희석제 및 원심분리 조건을 사용하는 효과를 설명하는 것이다.

실시예

실시예 1 - 프레아날리틱스 ( PreAnalytiX ™) 팍스진 ( Paxgene ™) 혈액 수집튜브로 부터 RNA 정제

혈액 샘플은 공여체로부터 팍스진 수집튜브 (PreAnalytiX™, Valencia, CA) 내로 수집하였다. 샘플은 본질적으로 제조자의 지시에 따라서 처리하였다. 샘플을 3000×g으로 10 분 동안 원심분리하였다. 팍스진 RNA 수집튜브의 원심분리에 의해서 수득된 생성된 샘플 펠릿은 총 핵산, 음으로 하전된 단백질 및 양이온성 계면활성제 카트리목스 (Catrimox™)의 수-불용성 침전이었다. 펠릿은 전체 혈액 생성물 오염이 제거된 것이었다. 5 ㎖의 물을 펠릿에 첨가하고, 샘플을 빠르게 소용돌이 일으켰다. 이어서 튜브를 3000×g으로 10 분 동안 다시 원심분리하고, 상등액을 경사시켜 더 청정한 펠릿을 수득하였다.

생성된 샘플 펠릿은 용해 용액 (6 M LiCl, 5％ 트리톤 X-100, 5％ DGME, 10 mM EDTA, 100 mM TRIZMA, pH 8.8)에 쉽게 가용성이 아니었으며, 따라서 가용화 용액이 사용되었다. 150 ㎕의 가용화 용액 (38 mM TRIZMA 염기, 12 mM TRIZMA HCl, 10 mM EDTA, 5％ 트리톤 X-100)을 샘플에 첨가하였다. 전부는 아니지만 대부분의 구체예에서는, 펠릿을 물 또는 트리스에 재현탁시켜 펠릿이 용해 용액에 가용화하는 것을 도와주었다. 예를 들어, 높거나 비정상적인 단백질 레벨을 갖는 혈액 공여체는 상승된 단백질 오염으로 인하여 이러한 RNA 단리에 실패할 수 있다. 그러나, 비이온성이며 완전히 상화적인 세제 (트리톤 X-100)를 가용화 용액에 첨가하여 펠릿을 완전히 가용화시켰다. 용해 용액에 첨가하는 경우에 이 현탁액은 단백질 오염 실패가 없이 RNA가 고체 지지체에 결합하도록 허용한다. 가용화 용액의 완충액 성분은 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 팍스진 RNA 수집튜브는 낮은 pH 성분과 함께 RNA를 보존하여 효소적 분해를 억제한다. 용해 용액 내에서 본 발명의 고체 지지체에 대한 RNA 결합은 최적으로 pH 8.5-9.5에서 일어난다. 이 실시예에서, 펠릿의 낮은 pH는 가용화 용액의 전반적 pH를 저하시키며, 일부의 구체예에서는 이 최적범위를 벗어나고, 또한 단백질 결합에 바람직하다. 따라서, 정확한 결합 pH에서 일정 용적의 완충액을 첨가하는 것은 펠릿으로부터의 어떤 흔적량의 산성 잔류물이라도 흡수하며, 실패없이 단리공정을 진행하도록 허용하였다. 따라서, 가용화 용액의 완충액의 pH는 안정화된 샘플에 대해 잔류하는 펠릿의 pH에 따라 조정을 필요로 할 수 있는 것으로 인식된다.

300 ㎕의 용해 용액을 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플과 혼합하였다. 이 경우에, 펠릿은 용해를 필요로 하지 않았으며, 용해 용액 제제 (6 M LiCl, 5％ 트리톤 X-100, 5％ DGME, 10 mM EDTA, 100 mM TRIZMA, pH 8.8)는 표적분자의 고체 지지체에 대한 결합을 촉진시켰다. 10 ㎕의 프로테이나제 K 용액을 각각의 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플은 얼음 상에서 15 분 동안 배양하였다. 전체 샘플을 결합 칼럼 (배스킷 내에 존재하며, 2 ㎖ 미량원심분리 튜브 내에 배치된 와트만 (Whatman) D 유리섬유 막)에 첨가하고, >13,000×g으로 1 분 동안 원심분리하였다. 400 ㎕의 세척 I 용액 (5 M LiCl, 55％ 에탄올)을 각각의 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플을 >13,000×g으로 2 분 동안 원심분리하였다. 그 다음에, 50 ㎕의 DNase 세척 용액을 첨가하고, 각각의 샘플을 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 200 ㎕의 DNase 세척 용액 (30％ 에탄올, 3.5 M LiCl, 50 mM 트리나트륨 시트레이트)을 첨가하고, >13,000×g으로 1 분 동안 원심분리하였다. 추가로 200 ㎕의 DNase 세척 용액을 첨가하고, 각각의 샘플을 >13,000×g으로 1 분 동안 원심분리한 다음에 200 ㎕의 세척 II 용액 (70％ 에탄올, 5 mM EDTA, 100 mM 트리스, pH 7)을 첨가하고, >13,000×g으로 1 분 동안 원심분리하였다. 이 최종 단계를 한번 반복하였다. 마지막으로, 50 ㎕의 DEPC-처리된 물을 칼럼에 첨가하여 RNA를 용출시켰다.

상술한 방법에 의해서 수득된 RNA의 품질을 시험하기 위하여, 정제하고 재현탁된 RNA를 1％ 아가로즈 겔 상에 부하시키고 단리시켰다. 상기 방법에 의해서 수득된 RNA는 온전하고 본질적으로 DNA를 함유하지 않았다.

실시예 2 - 프레아날리틱스 ( PreAnalytiX ™) 팍스진 ( Paxgene ™) 혈액 수집튜브로 부터 DNA 정제

100 ㎕의 가용화 용액 (38 mM TRIZMA 염기, 12 mM TRIZMA HCl, 10 mM EDTA, 5％ 트리톤 X-100, 2 ㎕의 4 ㎎/㎖ RNAse A)을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 소용돌이 일으켜 가용화시켰다. 200 ㎕의 용해 용액 (6 M LiCl, 5％ 트리톤 X-100, 5％ DGME, 10 mM EDTA, 100 mM TRIZMA, pH 8.8) 및 10 ㎕ 프로테이나제 K 용액을 샘플에 첨가하고, 소용돌이를 일으켜 혼합시키고, 15 분 동안 얼음 상에서 배양하였다. 샘플에 300 ㎕의 결합 용액 (10 M LiCl, 10％ DGME, 100 mM 트리스) 또는 300 ㎕의 세척 I 용액 (5 M LiCl, 55％ 에탄올)을 첨가하였다. 두가지 용액은 지놈 DNA가 유리섬유 고체 지지체에 결합하도록 허용하였다. 결합된 DNA를 400 ㎕의 세척 I 용액 (5 M LiCl, 55％ 에탄올)으로 한번, 및 200 ㎕의 세척 II 용액 (70％ 에탄올, 5 mM EDTA, 100 mM 트리스, pH 7)으로 2회 세척하였다. 이어서 DNA를 TE 완충액 (트리스-EDTA) 중에서 용출시켰다.

상술한 방법에 의해서 수득된 DNA의 품질을 시험하기 위하여, 정제하고 재현탁된 DNA를 1％ 아가로즈 겔 상에 부하시키고 전기영동 분리시켰다.

함께 고려하여, 결과는 DNA 및 RNA 모두가 프레아날리틱스로부터의 팍스진 RNA 수집튜브를 사용하여 수집된 혈액의 단일 튜브로부터 본 발명의 방법을 사용하여 제조될 수 있음을 입증하였다.

실시예 3 - 어플라이드 바이오시스템스 ( Applied Biosystems ) 템퍼스 ( Tempus ™) 혈액 수집튜브로부터 RNA 정제

3 ㎖의 혈액을 공여체로부터 템퍼스 (Tempus™) 튜브 내로 뽑아내고, <25℃에서 혼합하였다. 제조자의 지시에 따랐다: 샘플을 50 ㎖ 튜브 내로 경사시키고, 3 ㎖의 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)로 희석하고, 소용돌이를 일으켜 혼합시킨 다음에 4℃에서 2000×g으로 30 분 동안 원심분리하였다.

생성된 펠릿은 쉽게 볼 수 없었지만, 용해 용액 내에 직접적으로 가용성이고, 어떤 다른 결합 시약이 없이 유리섬유 고체 지지체에 직접 첨가될 수 있다. 펠릿은 300 ㎕의 용해 용액 (6 M LiCl, 5％ 트리톤 X-100, 5％ DGME, 10 mM EDTA, 100 mM TRIZMA, pH 8.8, + 3 ㎕ TCEP)을 첨가하여 가용화시켰으며, 60 초 동안 소용돌이를 일으켰다. 샘플을 결합 칼럼에 첨가하고, 3000×g으로 60 초 동안 원심분리하였다. 샘플을 새로운 튜브에 옮겼다. RNA는 400 ㎕의 세척 I을 첨가하고, 3000×g으로 30 초 동안 회전시켜 세척하였다. 템퍼스 수집튜브의 기술은 어떤 DNAse 처리에 대한 필요성을 경감시킨다. 따라서, 샘플을 200 ㎕의 세척 II를 첨가하고, 3000×g으로 30 초 동안 회전시켜 세척하였다. 200 ㎕의 세척 II를 첨가하고, 샘플을 3000×g으로 120 초 동안 회전시켰다. 50 ㎕의 RNase-부재 물을 첨가하여 RNA를 용출시키고, 샘플을 3000×g으로 1 분 동안 회전시켰다.

이 프로토콜은 EDTA 튜브 또는 팍스진 수집튜브 내에 수집되고 실시예 1 및 2의 방법으로 또는 혈액에 대한 팍스진 RNA 정제 프로토콜을 사용하여 단리된 혈액의 동등한 용적과 동등하거나 더 나은 총 RNA 수율을 제공한다.

실시예 4 - 에탄올을 사용한 어플라이드 바이오시스템스 ( Applied Biosystems ) 템 퍼스 (Tempus™) 혈액 수집튜브로부터의 RNA 정제

3 ㎖의 혈액을 공여체로부터, 약 6 ㎖의 텝퍼스 안정화제를 함유하는 템퍼스 튜브 내로 뽑아내고, <25℃에서 혼합하였다. 샘플은 실온에서 약 2 시간 동안 배양하였다. 그 다음에 샘플을 50 ㎖ 튜브 내로 경사시키고, 3 ㎖의 95％ 에탄올을 첨가하여 약 12 ㎖의 총용적을 수득하였다. 튜브를 약 120 초 동안 소용돌이를 일으킨 다음에, 6000×g으로 30-60 분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 경사하고, 튜브를 약 120 초 동안 뒤집어서 세포 펠릿을 건조시켰다.

펠릿은 300 ㎕의 용해 용액 (6 M LiCl, 5％ 트리톤 X-100, 5％ DGME, 10 mM EDTA, 100 mM TRIZMA, pH 8.8, + 3 ㎕ TCEP)을 첨가하여 가용화시켰으며, 60 초 동안 소용돌이를 일으켰다. 샘플을 결합 칼럼에 첨가하고, 3000×g으로 60 초 동안 원심분리하였다. 샘플을 새로운 튜브에 옮겼다. RNA는 400 ㎕의 세척 I을 첨가하고, 3000×g으로 120 초 동안 회전시켜 세척하였다. 50 ㎕의 DNAse (25 U/50 ㎕)를 첨가하고, 실온에서 약 15 분 동안 배양하도록 하였다. 그 다음에, 200 ㎕의 DNAse 세척액 (3.5 M 리튬 클로라이드, 50 mM 나트륨 시트레이트 및 30％ 에탄올)을 첨가하고, 튜브를 3000×g으로 60 초 동안 원심분리하였다. 상등액을 경사시키고, 200 ㎕의 세척 II 용액을 첨가한 다음에, 3000×g으로 60 초 동안 회전시켰다. 200 ㎕의 세척 II를 첨가하고, 샘플을 3000×g으로 120 초 동안 회전시켰다. 50 ㎕의 용출 용액 (뉴클레아제 부재 물, 또는 디에틸피로카보네이트 처리된 물, 또는 10 mM 트리스, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)을 첨가하여 RNA를 용출시키고, 샘플을 3000×g으로 1 분 동안 회전시켰다.

도 2는 초기 희석단계에서 PBS (실시예 3에서와 같음) 대신에 에탄올을 첨가하는 것이 더 낮은 원심분리 속도에서 RNA를 훨씬 더 큰 수율로 회수할 수 있도록 함을 나타내는 것이다. PBS에서의 최대 수율은 5500×g의 원심분리 속도를 필요로 하는 반면에 유사한 수율은 에탄올 중에서 3000×g으로 수득될 수 있다. 3000×g은 실험실에서 통상적으로 나타나는 훨씬 더 통상적인 원심분리 속도이다.

본 발명자들은 또한 이 방법에서 희석제로서 알콜의 상이한 농도를 시험하였다. 결과는 도 3에 나타내었다. 그래프는 희석제로서 상이한 농도의 알콜을 사용한 경우에 수득된 수율을 나타낸다. 모든 튜브는 다음을 함유하였다:

3 ㎖ 전혈액

6 ㎖ 템퍼스 튜브 안정화제

3 ㎖ 희석제

기준선으로서 PBS와 함께 더 빠른 5500×g 원심분리를 사용하여, RNA의 유사한 수율은 100％ 에탄올 또는 100％ 메탄올 중에서 희석하는 경우에 더 낮은 원심분리 속도에서 수득될 수 있음을 볼 수 있다. 에탄올이 생물공학 실험실에서 훨씬 더 통상적으로 나타나기 때문에, 에탄올이 특정의 구체예에서 선택된다. 고농도의 이소프로판올은 침전시키는 경향이 있어서 단리에 실패한다.

다수의 시약-등급 에탄올 제제는 주류 허가 및 과세를 피하기 위해서 5％ 메탄올 및/또는 5％ 이소프로판올로 변성된다. 다수의 에탄올 제제도 통상적으로 100％ 순도에 대립되는 것으로서 95％ 농도 (나머지는 물)로 구입한다. 70％ 에탄올도 또한 통상적인 실험실 농도이다. 도 4에 도시된 그래프는 이들 미묘한 제제 차이 중의 어떤 것을 변화시키는 경우에 영향이 없음을 나타내는 것이다.

본 발명의 다수의 구체예가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 의의 및 범주를 벗어나지 않는 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 다른 구체예들도 이하의 특허청구범위의 범주 내에 속한다.

Claims

(a) pH가 7 내지 9이며 농도가 10 내지 20 mM인 트리스-HCl,
(b) 농도 20 내지 50 mM의 트리스 염기,
(c) 농도 5 내지 15％의 트리톤-X, 및
(d) 농도 1 내지 20 mM의 EDTA를 포함하는,
핵산을 함유하는 물질을 가용화시키기 위한 가용화 용액.