CN102559659B - 一种用乙醇分级沉淀纯化dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法：(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35～45％，在-20℃下沉淀后，离心收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；(2)取所述的上清液A中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60～75％，在-20℃下再沉淀后，离心，除去上清液B，收集沉淀B；(3)取沉淀B用体积浓度为75％乙醇水溶液洗涤后，离心，除去上清液C，收集沉淀C；(4)50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，获得纯化后的DNA；本发明纯化方法成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等，具有广阔的应用前景。

Description

一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种DNA纯化的方法，特别涉及一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法。

(二)背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。通常认为SNP只有两种类型，即等位基因，在对已知SNP位点检测分型时只需对SNP进行两种不同类型碱基的确认分析。SNP广泛存在于低等和高等生物中，在人类基因组中约有300多万个。SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，它与许多疾病直接相关，如血友病和苯酮尿病等，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，对SNP的分型在临床检验和诊断、新药研究、个性化用药等领域显得极其重要。越来越多的SNP分型方法被快速发展起来，如引物延伸法、寡核苷酸连接反应法、内切酶酶切法、等位基因特异性杂交法等，其中，基于PCR扩增的引物延伸法因其简单、高效、经济等特点，被使用的最为广泛。引物延伸法中一个共同特性是通常需要用PCR方法首先扩增得到含目的SNP位点的扩增产物，对其进行纯化后，将其作为模板DNA再用于后续的等位基因分型。一般来讲，引物延伸法对模板DNA的纯度要求较高，因此，在用引物延伸法进行SNP分型中，发展一种有效、经济、简单的纯化PCR产物的方法显得尤为重要。被称为OLE(One-label Extension，单标记延伸)的方法(薛红、王子晖.单核苷酸多态性及点突变的检测方法.中国发明专利，专利申请号：200410029526.9，申请日：2004.3.18)就是一种引物延伸法，该方法是根据下列事实：紧邻在任何一个SNP位置之5’端的核苷是已知的，且紧接于该位置之3’端的相邻序列也是已知的；一个互补于紧邻在靶多核苷酸内SNP3’侧之序列的引物被用于链延伸；聚合酶反应混合物包含有一个链终止核苷酸，该链终止核苷酸所具有的碱基互补于紧邻该靶多核苷酸之SNP5’侧的核苷酸；可加入一个额外的dNTP以产生一个最多有两个碱基延伸的引物；对引物的链延伸长度或者从终止核苷酸标记了的形式渗入的标记量，以所形成的延长/终止反应产物来区分。该方法被成功发展建立并用于SNP的分型以研究SNP与精神分裂症的相关性(ZhiliangYu，Jianhuan Chen，Haifeng Shi，Gerald Stoeber，Shui-Ying Tsang，Hong Xue(2006).Analysis of GABRB2 association with schizophrenia in Germanpopulation with DNA sequencing and one-label extension method for SNPgenotyping.Clinical Biochemistry 39(3)：210-218.)，分型检测成功率为100％，显示了良好的应用前景。但是，一个较大的限制因素是：该方法对含目的SNP位点的PCR扩增后获得的模板DNA的纯度要求较高，由此需要用DNA纯化柱对PCR扩增产物进行纯化，从而导致每个分型成本达到了10元左右(主要是DNA纯化柱的成本)，大大高于其他一些分型方法的价格(1元左右的成本)，这极大的限制了该方法的产业化应用。模板DNA纯化成本过高也是其他一些引物延伸法中的一个共性问题，所以，发展建立一种经济、廉价及简单的纯化PCR扩增产物的方法，显得极为重要。

PCR扩增产物中，除了所需要的目的产物DNA片段外，主要的杂质是：焦磷酸(PPi)、多余的引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶，所以对PCR扩增产物纯化的实质就是如何去除这些会干扰后续SNP分型反应的主要杂质。目前，市场上常见的PCR扩增的DNA产物的纯化方法主要有：①一步乙醇沉淀法：该方法主要是在PCR反应混合物中加入终体积浓度为75％左右的乙醇来沉淀目的DNA片段。该方法的优点是：廉价及简单；缺点是：由于DNA聚合酶、多余的引物等杂质也会被同时沉淀下来，所以，纯化后获得的DNA纯度不高。②DNA纯化柱法：该方法主要是在管子中填加一些吸附介质，将大片段PCR扩增的DNA产物吸附，各类杂质不能被吸附而除去，然后用洗脱液将目的DNA再洗脱下来。该方法的优点是：方便且纯化后获得的DNA的纯度极高；缺点是：昂贵。③酶切法：该方法主要是用核酸外切酶(exonuclease I)将PCR反应混合物中多余的引物降解成核苷酸，再用虾碱性磷酸酶(shrimpalkaline phosphatase)将所有的核苷酸降解除去。该方法的优点：双酶的联用可以有效去除引物和核苷酸，而且也较简单；缺点：不但昂贵，而且不能有效去除DNA聚合酶和焦磷酸，导致纯化的DNA仍含有杂质聚合酶和焦磷酸。④膜过滤法：该方法主要是在管子中加装一张具有一定孔径的高聚合物薄膜，依据分子筛的原理，能有效地让焦磷酸、多余的核苷酸和多余的引物等通过薄膜被除去，而目的DNA片段和DNA聚合酶会被截留在膜上面。该方法的优点：方便而且能有效去除小分子量的杂质；缺点：昂贵而且不能去除DNA聚合酶，从而导致纯化后的DNA仍含有杂质聚合酶。

有鉴于以上不同方法的优缺点，本发明提供一种用乙醇分级沉淀的方法来纯化PCR扩增的DNA产物，该方法能有效去除焦磷酸(PPi)、多余的引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶等杂质，所纯化的含SNP位点的DNA能作为模板被应用于基于OLE的SNP分型检测中。该纯化方法不但具有经济、廉价、方便、广泛适用性等优点，而且所纯化的DNA具有较高的纯度，所以其能作为普适性的方法被推广应用于DNA纯化制备。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种乙醇分级沉淀纯化PCR扩增产物的方法，以及所述纯化方法适用于基于OLE方法的SNP分型检测的应用，该纯化方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等特点。

本发明采用的技术方案是：

一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，所述方法为：(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35～45％，在-20℃下沉淀后，离心收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；所述PCR扩增产物中还包含0～0.3mM焦磷酸(PPi)、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸(dNTPs)和0～0.1U Taq聚合酶；(2)取所述的上清液A中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60～75％，在-20℃下再沉淀后，离心，除去上清液B，收集沉淀B；(3)取沉淀B用体积浓度为75％乙醇水溶液洗涤后，离心，除去上清液C，收集沉淀C；(4)50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH＝8.0的10mMTris-HCl，1mM EDTA)溶解，获得纯化后的DNA。

所述步骤(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇水溶液的体积终浓度优选为38～42％，最优为40％。

所述步骤(2)中上清液A加入乙醇水溶液使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度优选为63～70％，最优为65％。

进一步，所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法推荐按如下步骤进行：(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液中乙醇体积终浓度为40％，在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；所述PCR扩增产物中还包含0～0.3mM焦磷酸、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸和0～0.1U Taq聚合酶；(2)所收集的上清液A中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为65％，在-20℃下再沉淀2h后，13000rpm离心，除去上清液B，收集沉淀B；(3)沉淀B用体积浓度为75％乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清液C，收集沉淀C；(4)50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl，1mM EDTA)溶解，获得纯化后的DNA。

所述PCR扩增产物按如下方法制备：1)PCR反应体系：人基因组DNA，引物，250μM的dNTPs，50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl₂和1U的Taq聚合酶；所述dNTPs由下列组分构成：62.5μM的dATP、62.5μM的dTTP、62.5μM的dCTP和62.5μM的dGTP；2)PCR扩增程序为：94℃变性5min，然后是35个循环，每个循环为94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸1min，循环结束后，72℃再延伸10min，获得PCR扩增产物，4℃保存；所述PCR扩增产物中还包含0～0.3mM焦磷酸、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸和0～0.1U Taq聚合酶，扩增结束后，用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳确证PCR目的产物大小，备用。本发明所用的人基因组DNA浓度为10ng，所述的引物为终浓度100nM的上游引物F2(5’GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3’)和100nM的下游引物R2(5’GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3’)。

本发明所述PCR扩增产物为185～2085bp。

进一步，所述PCR扩增产物包含SNP位点。

更进一步，所述PCR扩增产物大小723bps，包含1个SNP位点，所述SNP位点为5’-(G/G)T-3，SNP位点的具体位置对本发明没有影响，本发明的本质是一种纯化DNA的方法，SNP分型只是用来评价纯化方法。

本发明所述含目的SNP位点的PCR扩增产物纯化后的DNA作为模板用于单标记延伸(OLE)反应。

目的产物的特性描述：片段大小723bps，含有1个编号为rs1816072的SNP位点，该SNP位点是个A/G的变化(即有的人可能是一样的等位型AA或GG，有些人可能是不一样的等位型AG)，本发明所选用的样本是一个GG的等位型，紧邻SNP(rs1816072)位点是个碱基T，所以本样本rs1816072处是5’-(G/G)T-3’。

选用常用的4种不同的纯化方法对含目的SNP位点的PCR扩增产物进行纯化。所选用的方法和步骤如下：①一步乙醇沉淀法：在25μl PCR扩增产物中加入75μl的无水乙醇至乙醇终体积浓度为75％左右，在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min，除去上清，沉淀中加入100μl的体积浓度75％乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清，50℃烘干沉淀后，加入25μL的TE(Tris-EDTA)溶液溶解DNA备用。②DNA纯化柱法：按产品说明将25μl PCR扩增产物中加入到DNA纯化柱(VIOGENE，Taiwan)中，放置5min后，8000rpm离心1min，除去滤过液，加入100μl的洗涤液，放置1min后，8000rpm离心1min，除去滤过液，再13000rpm离心1min除去余液，加入25μL的洗脱液，放置5min后，13000rpm离心1min，收集纯化后DNA样品。③酶切法：25μl PCR扩增产物中加入1μl的10×虾碱性磷酸酶反应缓冲液、1U的虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)(Roche Molecular Biochemicals，USA)和2U的核酸外切酶(E.coli exonuclease I，Exo I)(USB，Cleveland，USA)，在37℃下消化1h后，95℃下高温处理1.5h使酶失活，获得纯化后DNA。④膜过滤法：按产品说明将25μl PCR扩增产物中加入到过滤膜(Millipore，USA)上，放置5min后，8000rpm离心1min，除去滤过液，加入100μl的洗涤液，放置1min后，8000rpm离心1min，除去滤过液，加入25μL的洗脱液即TE溶液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl，1mMEDTA)，室温放置30min后，收集洗脱液，即为纯化后DNA样品。

用OLE反应检测以上纯化后DNA的质量，以评价不同的纯化方法。

进一步，对每种纯化后DNA模板均建立如下的2个OLE反应：①反应1即dTTP反应：配置20μl的反应体系，内含：2μl以上不同方法纯化后DNA模板(含约120ng的DNA)，100nM OLE引物B2TCAF(5’-CTCATTCCAATGGCAACTCTA-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)(完全互补于紧邻在SNP rs1816072位置之3’端的序列)，15nM的R110-ddATP(PerkinElmer，Boston，USA)，4μl 5×OLE溶液(内含反应缓冲液和高保真的DNA聚合酶TopoTaq)(PharmacoGenetics Ltd.，Hong Kong)，50μM的dTTP；②反应2即dCTP反应，与反应1即dTTP反应一样，除了反应1中50μM的dTTP用50μM的dCTP替代。OLE反应程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火40s，循环结束后，用Victor-V型光谱仪(PerkinElmer，Boston，USA)测定反应1和反应2的荧光偏振值(激发波长480nm；发射波长535nm)的变化情况。R110-ddATP(用荧光染料R110标记的ddATP)带有荧光染料R110，当其没有被聚合酶整合到DNA链上时(游离态)，荧光偏振值较低，而当其被聚合酶整合到DNA链上时(结合态)，荧光偏振值会升高，R110-ddATP为双脱氧的核苷酸(终止型核苷酸)，一旦被整合到核苷酸链上，核苷酸链将不能继续被延伸。由于本发明所选用的样本在SNP位点处是5’-(G/G)T-3’，所以，如图1所示，理论上讲，对于反应1即dTTP反应，不会有OLE引物B2TCAF的延伸，R110-ddATP为游离态，荧光偏振值会比较低，而对于反应2即dCTP反应，会有OLE引物B2TCAF的两个碱基的延伸，R110-ddATP为结合态，荧光偏振值会比较高。对4种不同的纯化方法所获得的DNA模板，分别进行两个OLE反应，检测荧光偏振值。如图2所示，纯化柱法纯化效果较好，所得的DNA模板经OLE反应后，显示dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异最明显，区分度最大；其次是酶切法；再接下去是膜过滤法；而一步乙醇沉淀法效果最差，其纯化获得的DNA模板，经OLE反应显示，dTTP反应和dCTP反应的荧光偏振值都是高的，由此体现出样品SNP分型是AG型，与实际不符(经DNA测序证实：本样品实际的SNP分型是GG型)。综上可见，以上所测试的纯化方法种，纯化柱法效果最好，最能适宜于SNP分型，但是，纯化柱比较昂贵。

为建立乙醇分级沉淀DNA来纯化PCR扩增产物用于SNP分型的方法，采取以下策略：25μl的PCR扩增产物中加入低浓度的乙醇，在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min，收集上清(丢弃杂质沉淀)，并加入高浓度的乙醇后，在-20℃下再沉淀2h后，13000rpm离心10min，除去上清，DNA沉淀中加入100μl的体积浓度75％乙醇溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清，50℃烘干沉淀后，加入25μL的TE溶液溶解DNA备用。然后对每种纯化后DNA模板均建立如上所述的2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)以评估纯化效果。结果如图3所示：先采用终体积浓度为40％的乙醇沉淀去除杂质，再用终体积浓度为65％的乙醇沉淀DNA效果最好，纯化所得的DNA模板经OLE反应后，显示dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异最明显，区分度最大，其结果可与纯化柱法的结果相媲美，而成本却比纯化柱法远远要低；先采用终体积浓度为35％的乙醇沉淀去除杂质，再用终体积浓度为65％的乙醇沉淀DNA的效果次之；其他的分级沉淀纯化方法效果都不好。综上可见，从OLE分型检测的效果来看，采用先40％乙醇沉淀去杂再用65％的乙醇沉淀DNA的方法完全可以取代昂贵的纯化柱法。

为考察乙醇分级沉淀法去除核苷酸(dNTPs)的效果，建立以下反应体系：用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板：①纯化后的DNA中不额外加入dNTPs；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.267μM的dNTPs；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为2.67μM的dNTPs；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为26.7μM的dNTPs。对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估dNTPs杂质对OLE反应的影响。如图4中的A所示，不额外加入杂质dNTPs的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量dNTPs杂质(0.267μM)对SNP分型影响不大；而当杂质dNTPs增加到2.67μM时，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异明显缩小，区分度不明显，SNP分型不理想；当杂质dNTPs浓度进一步增加到26.7μM，对SNP分型的影响加剧。综上可见，DNA模板中的高浓度杂质dNTPs会干扰OLE反应中的dTTP和dCTP的特异性识别区分SNP位点的碱基，从而影响SNP分型。

进一步，按以上方法制备含杂质dNTPs浓度为26.7μM的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板：①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40％乙醇沉淀去杂再用65％的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质dNTPs的效果。结果如图4中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异很小，区分不明显，SNP分型不好；而经所选的3种不同纯化方法的纯化，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法、酶切法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除dNTPs；②3种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法和酶切法来去除dNTPs。

为考察乙醇分级沉淀法去除焦磷酸(PPi)的效果，建立以下反应体系：用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板：①纯化后的DNA中不额外加入PPi；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.003mM的PPi；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.03mM的PPi；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.3mM的PPi；⑤纯化后的DNA中额外加入终浓度为3mM的PPi。对以上5种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估PPi杂质对OLE反应的影响。如图5A所示，不额外加入杂质PPi的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量PPi杂质(0.003mM)对SNP分型基本没有影响；进一步增加PPi的浓度(0.03mM)，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异缩小，区分度变小，对SNP分型的有影响；而当杂质PPi增加到0.3mM或进一步增加到3mM时，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值均很低(高浓度PPi会抑制OLE反应中的引物延伸)，导致不能SNP分型。综上可见，DNA模板中的高浓度杂质PPi会抑制OLE反应中的OLE引物链延伸的正向反应，从而影响SNP分型。

进一步，按以上方法制备含杂质PPi浓度为0.3mM的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板：①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40％乙醇沉淀去杂再用65％的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质PPi的效果。结果如图5中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值均很低，不能SNP分型；而酶切法也不能去除杂质PPi，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值也均很低，也不能SNP分型；而纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除杂质PPi，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除PPi；②2种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法去除PPi。

为考察乙醇分级沉淀法去除Taq DNA聚合酶(Taq)的效果，建立以下反应体系：用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板：①纯化后的DNA中不额外加入Taq；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.0001U的Taq；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.001U的Taq；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.01U的Taq；⑤纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.1U的Taq。对以上5种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估Taq杂质对OLE反应的影响。如图6A所示，不额外加入杂质Taq的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量Taq杂质(0.0001U和0.001U)对SNP分型基本没有影响；进一步增加Taq的浓度至0.01U，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异有所缩小，区分度变小，对SNP分型的有点影响；而当杂质Taq增加到0.1U，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异进一步缩小，对SNP分型影响加剧。综上可见，由于普通PCR所用的常规Taq聚合酶不是严格保真的聚合酶，DNA模板中高浓度杂质Taq的存在会导致OLE反应中的非特异性扩增，从而引起dTTP反应(理论上的阴性反应)的荧光偏振值错误的增加，影响SNP分型。

进一步，按以上方法制备含杂质Taq浓度为0.1U的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板：①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40％乙醇沉淀去杂再用65％的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质Taq的效果。结果如图6中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异很小，不能SNP分型；而酶切法不能去除杂质Taq，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异也很小，也不能SNP分型；而纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除杂质Taq，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除Taq；②2种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法去除Taq。

为考察乙醇分级沉淀法去除PCR引物的效果，建立以下反应体系：用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板：①纯化后的DNA中不额外加入PCR引物；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0.200nM的PCR引物(0.100nM的上游引物F2和0.100nM的下游引物R2)；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为2.00nM的PCR引物(1.00nM的上游引物F2和1.00nM的下游引物R2)；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为20.0nM的PCR引物(10.0nM的上游引物F2和10.0nM的下游引物R2)。对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估PCR引物杂质对OLE反应的影响。如图7中的A所示，不额外加入杂质PCR引物的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量PCR引物杂质(0.200nM)对SNP分型没有影响；而当杂质PCR引物增加到2.00nM时，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异有所缩小，区分度有所减小，SNP分型仍然可以；当杂质PCR引物进一步增加到20.0nM，对SNP分型的影响有所加剧。综上可见，由于DNA模板中的高浓度的PCR引物杂质会与OLE反应中的OLE引物形成竞争而影响OLE引物与模板DNA的杂合，从而影响SNP分型。

进一步，按以上方法制备含PCR引物杂质浓度为20.0nM的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板：①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40％乙醇沉淀去杂再用65％的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除PCR引物杂质的效果。结果如图7中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异最小，区分度一般，SNP分型效果一般；而经所选的3种不同纯化方法的纯化，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法、酶切法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除PCR引物；②3种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法和酶切法来去除PCR引物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：提供了一种乙醇分级沉淀纯化PCR扩增产物的方法，该方法能有效去除PCR反应后的主要杂质：焦磷酸(PPi)、多余的PCR引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶，所述的乙醇分级沉淀方法所纯化的DNA模板适用于基于OLE方法的SNP分型检测的应用。该纯化方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等特点，在生物技术和生物工程领域的高纯度DNA制备方面具有广阔的应用前景。

(四)附图说明

图1OLE反应的流程示意图；

图2基于OLE反应评价的常见纯化方法纯化PCR产物的效果；

图3基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法纯化PCR产物的效果；

图4基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除dNTPs的效果，其中A为不同量的dNTPs杂质对OLE反应的影响；

图5基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除PPi的效果，其中A为不同量的PPi杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中PPi杂质的性能；

图6基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除Taq聚合酶的效果，其中A为不同量的Taq酶杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中Taq酶杂质的性能；

图7基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除PCR引物的效果，其中A为不同量的引物杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中引物杂质的性能；

图8基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法纯化不同长度的PCR产物的效果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1  常规PCR扩增反应制备含目的SNP位点的DNA

1)配置25μl的常规PCR反应体系：10ng人基因组DNA(Hong KongRed Cross，香港红十字会)，100nM的上游引物F2(5’-GGGAATGGTGCTCAGTAAAC-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)和100nM的下游引物R2(5’-GCACTGAAAGTCCAAGGTCC-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)，250μM的dNTPs(即含62.5μM的dATP、62.5μM的dTTP、62.5μM的dCTP和62.5μM的dGTP)，50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl₂和1U的Taq聚合酶。

2)PCR扩增程序为：94℃变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸1min，循环结束后，72℃再延伸10min，获得PCR扩增产物(含有PCR扩增目的产物及焦磷酸、多余的PCR引物、多余的核苷酸和Taq聚合酶等杂质)，4℃保存。扩增结束后，用质量浓度为1.0％琼脂糖进行凝胶电泳确证PCR目的产物大小后备用。

3)琼脂糖凝胶电泳确证PCR目的产物的特性描述：片段大小723bps，包含1个编号为rs1816072的SNP位点，是个A/G的变化(即有的人可能是一样的等位基因AA或GG，有些人可能是不一样的等位基因AG)，本发明所选用的样本是一个GG的等位型，紧邻SNP(rs1816072)位点是个碱基T，所以本样本rs1816072处是5’-(G/G)T-3’(如图1所示)。

实施例2  4种不同的纯化方法对含目的SNP位点的PCR扩增产物的纯化

①一步乙醇沉淀法：在实施例1方法制备的25μl PCR扩增产物中加入75μl的无水乙醇至乙醇终体积浓度为75％，在-20℃下沉淀2hr后，13000rpm离心10min，除去上清，沉淀中加入100μl的体积浓度75％乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清，50℃烘干沉淀后，加入25μL的TE溶液(10mM Tris-HCl pH＝8.0，1mM EDTA)溶解DNA备用。

②DNA纯化柱法：将实施例1方法制备的25μl PCR扩增产物加入到DNA纯化柱(VIOGENE，Taiwan)中，放置5min后，8000rpm离心1min，除去过滤液，加入100μl的洗涤液(VIOGENE，Taiwan)，放置1min后，8000rpm离心1min，除去过滤液，再13000rpm离心1min除去余液，加入25μL的洗脱液(VIOGENE，Taiwan)，放置5min后，13000rpm离心1min，收集纯化后DNA样品。

③酶切法：25μl实施例1方法制备的PCR扩增产物中加入1μl的10×虾碱性磷酸酶反应缓冲液、1U的虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase，SAP)(Roche Molecular Biochemicals，USA)和2U的核酸外切酶(E.coli exonuclease I，Exo I)(USB，Cleveland，USA)，在37℃下消化1h后，95℃下高温处理1.5h使酶失活后即获得纯化DNA。

④膜过滤法：按产品说明将实施例1方法制备的25μl PCR扩增产物加入到过滤膜(Millipore，USA)上，放置5min后，8000rpm离心1min，除去过滤液，加入100μl的洗涤液(Millipore，USA)，放置1min后，8000rpm离心1min，除去过滤液，加入25μL的洗脱液即TE溶液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，室温放置30min后，收集洗脱液，即为纯化后DNA样品。

实施例3  纯化DNA用于SNP分型的OLE反应

对每种纯化方法制备的DNA模板均建立如下的2个OLE反应：

①反应1即dTTP反应：配置20μl的反应体系，内含：2μl纯化制备的DNA模板(含约120ng的DNA)，100nM OLE引物B2TCAF(5’-CTCATTCCAATGGCAACTCTA-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)(完全互补于紧邻在SNP rs1816072位置之3’端的序列)，15nM的R110-ddATP(PerkinElmer，Boston，USA)，4μl 5×OLE溶液(内含反应缓冲液和高保真的DNA聚合酶TopoTaq)(PharmacoGenetics Ltd.，Hong Kong)，50μM的dTTP(Invitrogen，Carlsbad，USA)；

②反应2即dCTP反应，与反应1即dTTP反应一样，除了反应1中50μM的dTTP用50μM的dCTP(Invitrogen，Carlsbad，USA)替代。

OLE反应程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火40s，循环结束后，用Victor-V型光谱仪(PerkinElmer，Boston，USA)测定反应1和反应2的荧光偏振值(激发光波长480nm；发射光波长535nm)的变化情况。

实施例4  乙醇分级沉淀法对含目的SNP位点的PCR扩增产物的纯化程序

取实施例1方法制备的25μl的PCR扩增产物分成6组，每组分别加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为0、0、25％、35％、40％、50％(如图3所示)，分别在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min，收集上清(丢弃杂质沉淀)，并分别加入无水乙醇使乙醇终体积浓度分别为75％、65％、65％、65％、65％、65％(如图3所示)后，分别在-20℃下再沉淀2h后，13000rpm离心10min，除去上清，DNA沉淀中加入100μl的质量浓度75％乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清，50℃烘干沉淀后，加入25μL的TE溶液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl，1mM EDTA)溶解DNA，获得6组纯化后的DNA，分别按照实施例3所述的方法进行OLE反应，荧光偏振值见图3所示。

实施例5  DNA模板中不同的杂质对基于OLE反应的SNP分型的影响

用于OLE反应的DNA模板的制备：按实施例1的方法进行PCR扩增，再按实施例2中纯化柱法进行纯化，纯化后的DNA模板分成18组(组1～组18)，组1～组4分别加入不同浓度的dNTPs(0、0.267μM、2.67μM和26.7μM)、组5～组9分别加入不同浓度的PPi(0、0.003mM、0.03mM、0.3mM和3mM)、组10～组14分别加入不同量的Taq聚合酶(0、0.0001U、0.001U、0.01U和0.1U)和组15～组18分别加入不同浓度的PCR引物(0、0.200nM(0.100nM的F2和0.100nM的R2)、2.00nM(1.00nM的F2和1.00nM的R2)和20.0nM(10.0nM的F2和10.0nM的R2))。

上述18组模板，按实施例3的方法分别进行OLE反应，观察SNP分型情况以评估不同量的杂质对OLE反应的影响。结果如图4中A、图5中A、图6中A和图7中A所示，低浓度的杂质，如0.267μM的dNTPs、0.003mM的PPi、0.0001U和0.001U的Taq或0.200nM的PCR引物，对OLE反应没有影响，SNP分型比较清晰准确；当杂质浓度增加，如2.67μM的dNTPs、0.03mM的PPi、0.01U的Taq、或2.00nM和2.00nM的PCR引物，对OLE反应产生影响，从而导致SNP分型区分度下降；而当杂质浓度进一步增加，如26.7μM的dNTPs、0.3mM和3mM的PPi或0.1U的Taq，对OLE反应产生非常明显的影响，甚至会产生错误的SNP分型(与理论不符)。

实施例6  乙醇分级沉淀法去除DNA模板中杂质的性能

按实施例1的方法进行PCR扩增，再按实施例2中纯化柱法进行纯化，纯化后的DNA模板分成4组(组a～组d)，组a中加入终浓度为26.7μM的dNTPs、组b中加入终浓度为0.3mM的PPi、组c中加入终浓度为0.1U的Taq聚合酶、组d中加入终浓度为20.0nM的PCR引物(10.0nM的上游引物F2和10.0nM的下游引物R2)，对以上制备的4组含杂质的DNA分别进行乙醇分级沉淀法进行纯化，即25μl上述DNA溶液(组a～组d)中分别加入乙醇，使混合液汇总乙醇体积终浓度为40％，分别在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min，收集上清(丢弃杂质沉淀)，并加入乙醇使混合液中乙醇体积终浓度为65％，再分别在-20℃下再沉淀2h后，13000rpm离心10min，除去上清，DNA沉淀中分别加入100μl的体积浓度75％乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清，50℃烘干沉淀后，加入25μL的TE溶液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl，1mM EDTA)溶解DNA，获得4组纯化后的DNA模板(组a～组d)，备用。

将上述纯化后的DNA模板(组a～组d)按实施例3的方法分别进行OLE反应，同样条件下按照实施例2中的方法②和③及不纯化的模板作为对照，观察SNP分型情况以评估乙醇分级沉淀法去除DNA模板中杂质的性能。结果如图4中B、图5中B、图6中B和图7中B所示，含有杂质的DNA模板若不进行纯化，OLE反应后的SNP分型不好，甚至会产生错误的分型结果；含杂质的DNA模板经乙醇分级沉淀法纯化后，OLE反应后的SNP分型比较清晰、理想，均与事实相符，而且，乙醇分级沉淀法纯化的DNA模板的分型效果与商业化的纯化柱法纯化的相当。

实施例7  乙醇分级沉淀法纯化不同长度DNA模板的效果

分别采用不同的配对引物，按实施例1的方法PCR扩增不同长度的目的DNA：上游引物F2D(5’-TCAGGATGCGTTATTGGATAGT-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)和下游引物R2配对用于扩增185bps的目的DNA，上游引物F2C(5’-ACCAAGGTTTTATGGGCGTGCT-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)和下游引物R2配对用于扩增359bps的目的DNA，上游引物F2B(5’-TACGTATGATACAGGATCATCC-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)和下游引物R2配对用于扩增482bps的目的DNA，上游引物F2和下游引物R2配对用于扩增723bps的目的DNA，上游引物F2和下游引物R2N(5’-CCTAATGGGGGAGTTTGAAC-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)配对用于扩增1078bps的目的DNA，上游引物F2D和下游引物R4N(5’-CTTAATAGCTGGAAAGGTGAT-3’)(Invitrogen，Carlsbad，USA)配对用于扩增1534bps的目的DNA，上游引物F2和下游引物R4N配对用于扩增2085bps的目的DNA，所扩增的目的DNA均含有同一SNP位点rs1816072。

对上述含有不同长度目的DNA片段的PCR扩增产物按实施例6中的乙醇分级沉淀方法进行纯化，然后，对纯化后不同长度的DNA模板按实施例3的方法进行OLE反应，评估乙醇分级沉淀方法纯化不同长度DNA的效果。结果如图8所示，不同长度的DNA模板，经OLE反应，显现出一致的SNP分型结果，每种模板的2个OLE反应间的区分度基本一致，可见，先40％的乙醇沉淀去杂再65％的乙醇沉淀DNA的分级沉淀方法适用于纯化不同长度的PCR扩增产物，所纯化的DNA能被较好地用于基于OLE反应的SNP分型。

Claims (9)

1.一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述方法为：（1）在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35～45%，在-20℃下沉淀后，离心收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；所述PCR扩增产物中还包含0～0.3mM焦磷酸、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸和0～0.1U Taq聚合酶；（2）取所述的上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60～75%，在-20℃下再沉淀后，离心，除去上清液B，收集沉淀B；（3）取沉淀B用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后，离心，除去上清液C，收集沉淀C；（4）50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，获得纯化后的DNA。

2.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述步骤（1）中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为38～42%。

3.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述步骤（2）中上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为63～70%。

4.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：（1）在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液中乙醇体积终浓度为40%，在-20℃下沉淀2h后，13000rpm离心10min收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；所述PCR扩增产物还包含0～0.3mM焦磷酸、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸和0～0.1U Taq聚合酶；（2）取所述的上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为65%，在-20℃下再沉淀2h后，13000rpm离心，除去上清液B，收集沉淀B；（3）沉淀B用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心10min，除去上清液C，收集沉淀C；（4）50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，获得纯化后的DNA。

5.如权利要求1～4之一所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述PCR扩增产物按如下方法制备：1）PCR反应体系：人基因组DNA，引物，终浓度为250μM的dNTPs，50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl₂和1U的Taq聚合酶；所述dNTPs由下列组分构成：终浓度为62.5μM的dATP、62.5μM的dTTP、62.5μM的dCTP和62.5μM的dGTP；2）PCR扩增程序为：94℃变性5min，然后是35个循环，每个循环为94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸1min，循环结束后，72℃再延伸10min，获得PCR扩增产物；所述PCR扩增产物中还包含0～0.3mM焦磷酸、0～20.0nM寡核苷酸引物链、0～26.7μM核苷酸和0～0.1U Taq聚合酶。

6.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述PCR扩增产物为185～2085bp。

7.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述PCR扩增产物包含SNP位点。

8.如权利要求5所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述PCR扩增产物大小723bps，包含1个SNP位点，所述SNP位点为5’-（G/G）T-3；所述模板为人基因组DNA，所述的引物为：上游引物F2：5’GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3’和下游引物R2：5’GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3’。

9.如权利要求5所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，其特征在于所述人基因组DNA终浓度为10ng，引物为终浓度100nM的上游引物F2：5’GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3’和100nM的下游引物R2：5’GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3’。

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