CN110904094B - 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法 - Google Patents

一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的提取方法中应用了LH液，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm2陈旧唾液斑(约20μL唾液)样品即可。本发明的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。

Description

一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序 文库的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长度为16～22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，能够与信使RNA的非编码区结合，从而导致基因沉默或抑制基因转录。miRNA在多种体液中广泛表达，包括羊水、乳汁、支气管液、脑脊液、初乳、腹膜液、血浆、胸腔液、唾液、精液、眼泪和尿。
作为一种重要的调控因子，miRNA的表达具有组织特异性，目前miRNA成为法庭科学领域新的体液斑鉴定标记物。特别是法医实际案例中的检材通常具有微量、易降解、成分复杂等特点。传统的法医DNA分析在腐败、降解检材等案件中的应用仍然有一定的局限性。而miRNA由于具有长度较短，不易降解等特点，其作为法医新遗传标记的研究具有可观的前景。
目前针对miRNA的分析方法主要有荧光定量PCR和高通量测序方法，高通量测序技术具有效率高，通量高，能有效检出基因多态性等特点，成为目前miRNA表达谱检测的主流方法之一。但是高通量测序方法所需模板量大，通常需要100ng以上总RNA，不适用于体液斑等痕量样本，且应用传统方法进行唾液斑miRNA提取，效率低，难以满足高通量测序的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，该唾液斑miRNA的提取方法提取效率高；该唾液斑miRNA高通量测序文库建立的方法能够显著缩短时间，且对样品的需求量小。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。
优选的，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为1～1.5mL：4～6mL：0.3-0.5mL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。
优选的，步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为150～250μL，所述乙醇的用量为300～500μL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量为300～500μL。
本发明还提供了上述方案任意一项所述提取方法得到的唾液斑miRNA。
本发明还提供了一种利用上述方案所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
优选的，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2XMaster Mix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；
所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示。
优选的，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。
本发明的有益效果：本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，本发明的提取方法中应用了1.5×LH液和酚氯仿；所述1.5×LH液包括硫氰酸胍和柠檬酸钠，硫氰酸胍作为离液剂和强变性剂，有助于核酸的分离，柠檬酸钠用于调节pH值；所述酚氯仿使蛋白质变性，同时抑制了RNA酶的降解作用。本发明将1.5×LH液用于提取痕量唾液斑miRNA能够达到很好的效果，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm2陈旧唾液斑(约含10ng RNA)样品即可。本发明的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。
附图说明
图1为应用安捷伦Agilent 2100生物分析仪对是实施例1的miRNA文库进行的DNA电泳结果；
图2为人唾液斑表达水平最高的miRNA统计结果。
具体实施方式
本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水，优选为蒸馏水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。
本发明首先取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；所述唾液斑样本的面积优选的≥1cm2；所述唾液斑样本的体积优选的≥20μL；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比优选为20～40μL：1mL，更优选为30μL：1mL；所述取唾液斑样本的设备优选为打孔器；所述混合的容器优选为1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述离心的温度优选为20～25℃；所述离心的离心力优选为400g；所述离心的时间优选为30min。
得到第一上清液后，本发明将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；所述1.5×LH液优选的包括以下浓度的组分：硫氰酸胍6mol/L和柠檬酸钠37.5mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水，优选为蒸馏水；所述硫氰酸胍为离液剂和强变性剂有助于核酸的分离，柠檬酸钠用于调节pH值；所述酚氯仿优选的包括以下体积份的组分：酚5份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度优选为4.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量优选为1～1.5mL：4～6mL：0.3～0.5mL；所述酚氯仿使蛋白质变性，同时抑制了RNA酶的降解作用。
所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述震荡优选为剧烈震荡；所述震荡的时间优选为15s；所述冰浴的时间优选为8min；所述离心的时间优选为20min。
得到上层水相后，本发明将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述异丙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述静置的时间优选为4h；所述离心的时间优选为15min。
得到第一沉淀后，本发明优选的还包括将第一沉淀和乙醇水溶液混合，于7500g下离心8min，得到清洁第一沉淀；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比优选为75％。
将所述清洁第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度优选为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量优选为150～250μL，更优选为200μL；所述乙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述放置的时间优选为1h；所述离心的时间优选为15min。
得到第二上清液后，本发明将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述乙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述放置的时间优选为1h；所述干燥的时间优选为15min。
本发明得到唾液斑miRNA后，优选的还包括将唾液斑miRNA和无核酶水混合；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述无核酶水的用量优选为20μL。
本发明还提供了上述方案任意一项所述提取方法得到的唾液斑miRNA。
本发明还提供了一种利用上述方案所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
本发明首先将所述唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5′-rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2-3′；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为5′-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-3′。
本发明具体实施过程中，首先连接唾液斑miRNA和3'SR接头，得到第一连接混合物；所述唾液斑miRNA的用量优选为10～100ng；所述3'SR接头需提前在无核酸酶的水中以体积比1：2进行稀释；所述连接体系以20μL计包括：唾液斑miRNA6μL、3'SR接头1μL、3'连接反应缓冲液(2X)10μL和3'连接酶混合物3μL；所述反应程序：将唾液斑miRNA和3'SR接头混合，于70℃孵育2min，转移至冰上，加入3'连接反应缓冲液(2X)和3'连接酶混合物，于25℃孵育1h；孵育时间更长、温度更低(18h；16℃)可提高甲基化RNA的连接效率，如piRNAs(如果样品中存在)，但是会形成一些连接化产物。
得到第一连接混合物后，本发明将所述第一连接混合物、无核酸酶水和SR RT引物混合，杂交逆转录引物，得到第二连接混合物；以唾液斑miRNA用量为6μL计，所述无核酸酶水的用量为4.5μL，所述SR RT引物的用量为1μL；所述杂交逆转录引物的反应程序为：75℃、5min；37℃、15min；25℃、15min；所述SR RT引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，具体为：5′-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′。
得到第二连接混合物后，本发明连接第二连接混合物和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述5'SR接头重悬于无核酸酶水中；5'SR接头在无核酸酶水中优选的以体积比1：2进行稀释；所述连接的体系以30μL计包括：变性5'SR接头1μL、5'连接反应缓冲液(10X)1μL、5'连接酶混合物2.5μL和第二连接混合物25.5μL；所述连接的程序为：25℃孵育1h；所述变性5'SR接头采用以下方法制备得到：将5'SR接头于70℃孵育2min，再于冰上变性30min，得到变性5'SR接头。
得到连接接头的RNA后，本发明对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；所述逆转录的反应体系以40μL计包括：连接接头的RNA30μL、第一链合成反应缓冲液8μL、RNase抑制剂1μL和ProtoScript II逆转录酶1μL；所述逆转录的反应程序为：50℃孵育60min。
得到逆转录产物后，本发明对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2X Master Mix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCG-s-A-3′；所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：4～SEQ ID NO：15所示。
得到cDNA构建体后，本发明对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
本发明在得到cDNA构建体后，优选的还包括对所述cDNA构建体进行纯化，得到cDNA纯化物；本发明对所述纯化的方法或者采用的试剂盒没有特殊限制，采用本领域常规方法或试剂盒即可。
本发明具体实施过程中，得到cDNA纯化物后，将所述cDNA纯化物和凝胶上样染料混合，得到凝胶样品；所述cDNA纯化物和的体积比优选为5：1；所述凝胶上样染料优选为蓝色(6X)。
本发明对所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
在切胶回收146～153bp大小的片段后，本发明优选的还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库；相对于传统方法中于-80℃下冷冻30min，本发明将冷冻时间延长至2h，DNA回收效果更佳。
本发明中，以每组回收的洗脱液计，所述线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇的用量分别为1μL、25μL和750μL；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度优选为3M；所述乙酸钠水溶液的pH值优选5.5；所述离心的转速优选的>14,000×g；所述离心的温度优选为4℃；所述离心的时间优选为30min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 miRNA提取
配制LH液(1.5×):6mol/L硫氰酸胍，37.5mmol/L柠檬酸钠和蒸馏水；
1.用打孔器截取人唾液斑样本【样本为储存6个月的中国北方汉族人群唾液斑样本。(1～3为男性，4～6为女性，年龄为30～40岁)】(至少20μL唾液，唾液斑面积不小于1cm2)。放入1.5mL无酶离心管中。
2.加入PBS 1mL，混合均匀，室温400g离心30min。
3.去掉上清，加入15mL无酶离心管，加入4mL 1.5×LH液，加入8mL酚氯仿(酚：氯仿＝5：1，体积比)和0.5mL 4.2mol/L乙酸钠水溶液，混合均匀，剧烈震荡15s，冰浴5min。
4.12000g离心20min。
5.将上层水相转移至一个新的1.5mL无酶离心管中。
6.加入等体积异丙醇400μL，4℃放置4h。
7.12000g高速离心15min，管底即为RNA沉淀。
8.转移上清液至新的1.5mL无酶离心管，加入800μL 75％乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500g离心8min。
9.加入200μL 0.2mol/L氯化钠再溶解RNA，用400μL 100％乙醇沉淀RNA，-20℃放置1h。
10.12000g高速离心15min，用400μL 100％乙醇沉淀RNA，-20℃放置1h。
11.打开管口，室温干燥15min。
12.加入20μL无核酶水。
对比例1 trizol法提miRNA
试剂：三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，75℅乙醇，DEPC水、Trizol reagent
材料与仪器：EP管、匀浆器、移液枪、漩涡振荡器、低温高速冷冻离心机、冰袋、电泳仪、琼脂糖凝胶、超净工作台
操作步骤：
1)取人唾液斑样本(与实施例1相同)，加0.5mL Trizol reagent于冰上充分匀浆，然后再加入0.5mL Trizol冲洗匀浆器，转移至1.5mL EP管中
2)将匀浆样品在15～30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3)每使用1mL Trizol加0.2mL氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
4)4℃12000rpm，离心10～15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μL，约为所用Trizol试剂的60％)转移到新管中。
5)在得到的水相溶液中加入等体积(500μL)的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃、放置20～30min。
6)4℃12000rpm离心10min，去上清。
7)加入1mL 75％乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。
8)4℃12000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清。
9)室温放置晾干。加入30μL DEPC水。
实施例1和对比例1制备得到的miRNA浓度比较结果参见表1。
表1 实施例1和对比例1制备得到的miRNA浓度比较结果
Figure BDA0002310878670000101
实施例2 miRNA文库的建立
一、连接3'SR接头
分别取实施例1和对比例1的miRNA，总RNA量为10～100ng，3'SR接头需提前在无核酸酶的水中以1：2稀释。
1、将以下组分在无菌、无核酸酶的PCR管中混合：
Figure BDA0002310878670000102
Figure BDA0002310878670000111
2、在70℃预热的热循环仪中孵育2min。将管转移到冰上。
3、加入以下成分：
Figure BDA0002310878670000112
4、25℃下在热循环仪中孵育1h；
注意：孵育时间更长、温度更低(18h；16℃)可提高甲基化RNA的连接效率，如piRNAs(如果样品中存在)。但是，可能会形成一些连接化产物。
二、杂交逆转录引物
5、将以下组分添加到步骤4的连接混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000113
6、在75℃下加热样品5min。转移至37℃维持15min，接着在25℃维持15min。
三、连接5'SR接头
7、剩余5min时，将5'SR接头重悬于120μL无核酸酶水中。需要在无核酸酶水中1：2稀释引物。
8、将1.1NμL的5'SR接头分装到无核酸酶的200μL PCR管中，其中N等于当前实验所得的样品体积。
9、将接头在70℃的热循环仪中孵育2min，然后立即将管置于冰上。将管保持在冰上并在变性后30min内使用变性的接头。
注意：将剩余的重悬5'SR接头储存在-80℃。
10、将以下组分添加到步骤6的连接混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000114
Figure BDA0002310878670000121
11、25℃下在热循环仪中孵育1h。
四、执行逆转录
12、将以下组分在无菌、无核酸酶的试管中混合：
Figure BDA0002310878670000122
13、在50℃孵育60min。
14、立即进行PCR扩增。
五、进行PCR扩增
15、将以下组分添加到步骤14的RT反应混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000123
Prep Set包含1～12个PCR引物，每个引物具有不同的标志。对于每个反应，在PCR步骤中仅使用12个PCR引物中的一个。
RNA PCR Primer Index(RPIX)共12种，具体如下：
Index 1 Primer(第一引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 2 Primer(第二引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 3 Primer(第三引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 4 Primer(第四引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 5 Primer(第五引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 6 Primer(第六引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 7 Primer(第七引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 8 Primer(第八引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 9 Primer(第九引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 10(第十引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 11(第十一引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 12(第十二引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3
PCR循环条件参见表2。
表2 PCR循环条件
Figure BDA0002310878670000141
六、使用6％聚丙烯酰胺凝胶进行文库质量检查和长度选择
1.使用QIAQuick PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增的cDNA。
2.在27.5μL无核酸酶水中洗脱扩增的DNA。
3.使用DNA 1000芯片在生物分析仪上加载1μL PCR纯化物。
4.将纯化的PCR产物(25μL)与5μL凝胶上样染料，蓝色(6X)混合。
注意：在使用之前，震荡上样染料使其充分混匀。
5.在6％PAGE 10孔凝胶上的一个孔中加入5μLQuad-load pBR322 DNA-MspIDigest。
6.在6％PAGE 10孔凝胶的两个孔上各加扩增的cDNA构建体和上样染料混合物15μL。
7.120V凝胶电泳1h或直到蓝色染料到达凝胶底部。不要让蓝色染料离开凝胶。
8.从设备中取出凝胶，用SYBR Gold核酸凝胶染色剂将凝胶染色2～3min，然后在紫外透射仪上观察凝胶。
9.140和150个核苷酸条带分别对应于衍生自21和30个核苷酸RNA片段的衔接子连接的构建体。对于miRNAs，分离对应于～140bp的条带。对于piRNsA，分离对应于～150bp的条带。
10.将来自相同样品的两个凝胶切片放入一个1.5mL管中，并用不含RNase的一次性沉淀杵将凝胶切片压碎，然后浸泡在250μL DNA凝胶洗脱缓冲液(1X)中。
11.在20～25℃环境下在旋转培养器上以50rpm转旋转10h。
12.将洗脱液和凝胶碎片转移到凝胶过滤柱的顶部。
13.以>13,200rpm离心过滤器2min。
14.回收洗脱液并加入1μL线性丙烯酰胺、25μL 3M乙酸钠、pH 5.5和750μL 100％乙醇。
15.充分涡旋。
16.在-80℃下冷冻2h。
17.4℃下，在>14,000×g的微量离心机中旋转30min。
18.去除上清液，注意不要打乱沉淀。
19.通过用80％乙醇剧烈涡旋洗涤沉淀。
20.4℃下，在>14,000×g的微量离心机中旋转30min。
21.室温下风干沉淀多达10min，以除去残留的乙醇。
22.将沉淀重悬于12μL TE缓冲液中。
23.2100仪检测文库质量。
七、实施例1和对比例1对应的miRNA文库质量及测序结果
应用传统方法(对比例1)提取的miRNA无法实现唾液斑miRNA高通量测序检测，不能满足建库要求。
应用实施例1提取的miRNA成功建立miRNA文库，在146～153bp处有明显条带。
图1为应用安捷伦Agilent 2100生物分析仪对是实施例1的miRNA文库进行的DNA电泳结果；由图1可以看出在146～153bp处峰高明显，提示此处有明显DNA条带，结果表明miRNA文库片段大小正确。
人唾液斑表达水平最高的miRNA统计结果参见图2，由图2可以看出，在唾液斑中有效检出142种miRNA，占比最多的为let-7f-5p(7.12％)，let-7i-5p(7.23％)，miR-486-5p(5.86％)，let-7i-5p(4.77％)，miR-21-5p(3.89％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市理化分析测试中心
<120> 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcggaag agcacacgtc t 21
<210> 2
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
rgrururcra rgrargruru rcrurarcra rgrurcrcrg rarcrgraru rc 52
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
rgrrrcrarg rargrrrcrr arcrargrrc rcrgrarcrg rarrc 45
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atccaag 67
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagaagacgg catacgagat acatcggtga ctggagttca gacgtgtgct cttccgatc 59
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatgcctaa gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatcactgt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatattggc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatgatctg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agattcaagt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agatctgatc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agataagcta gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatgtagcc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agattacaag gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agacgtgtgc tcttccgatc t 21

Claims (8)

1.一种唾液斑miRNA的提取方法，由以下步骤组成：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液由以下浓度的组分组成：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿由以下体积份的组分组成：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L；
步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为250μL，所述乙醇的用量为300μL；
以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量500μL。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本所含唾液量和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为3～5mL：7～9mL：0.3～0.8mL。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。
5.权利要求1～4任意一项提取方法得到的唾液斑miRNA。
6.一种利用权利要求5所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2X MasterMix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；
所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。
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