CN110904094B - 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法 - Google Patents

一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110904094B
CN110904094B CN201911258166.2A CN201911258166A CN110904094B CN 110904094 B CN110904094 B CN 110904094B CN 201911258166 A CN201911258166 A CN 201911258166A CN 110904094 B CN110904094 B CN 110904094B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
mirna
salivary
plaque
saliva
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911258166.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110904094A (zh
Inventor
方晨
武会娟
严江伟
刘旭
钱嘉林
李宝明
刘文丽
张小莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING CENTER FOR PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSIS
Original Assignee
BEIJING CENTER FOR PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSIS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING CENTER FOR PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSIS filed Critical BEIJING CENTER FOR PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSIS
Priority to CN201911258166.2A priority Critical patent/CN110904094B/zh
Publication of CN110904094A publication Critical patent/CN110904094A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110904094B publication Critical patent/CN110904094B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的提取方法中应用了LH液，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm2陈旧唾液斑(约20μL唾液)样品即可。本发明的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。

Description

一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序 文库的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长度为16～22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，能够与信使RNA的非编码区结合，从而导致基因沉默或抑制基因转录。miRNA在多种体液中广泛表达，包括羊水、乳汁、支气管液、脑脊液、初乳、腹膜液、血浆、胸腔液、唾液、精液、眼泪和尿。
作为一种重要的调控因子，miRNA的表达具有组织特异性，目前miRNA成为法庭科学领域新的体液斑鉴定标记物。特别是法医实际案例中的检材通常具有微量、易降解、成分复杂等特点。传统的法医DNA分析在腐败、降解检材等案件中的应用仍然有一定的局限性。而miRNA由于具有长度较短，不易降解等特点，其作为法医新遗传标记的研究具有可观的前景。
目前针对miRNA的分析方法主要有荧光定量PCR和高通量测序方法，高通量测序技术具有效率高，通量高，能有效检出基因多态性等特点，成为目前miRNA表达谱检测的主流方法之一。但是高通量测序方法所需模板量大，通常需要100ng以上总RNA，不适用于体液斑等痕量样本，且应用传统方法进行唾液斑miRNA提取，效率低，难以满足高通量测序的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，该唾液斑miRNA的提取方法提取效率高；该唾液斑miRNA高通量测序文库建立的方法能够显著缩短时间，且对样品的需求量小。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。
优选的，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为1～1.5mL：4～6mL：0.3-0.5mL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。
优选的，步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为150～250μL，所述乙醇的用量为300～500μL。
优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量为300～500μL。
本发明还提供了上述方案任意一项所述提取方法得到的唾液斑miRNA。
本发明还提供了一种利用上述方案所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
优选的，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2XMaster Mix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；
所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示。
优选的，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。
本发明的有益效果：本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，本发明的提取方法中应用了1.5×LH液和酚氯仿；所述1.5×LH液包括硫氰酸胍和柠檬酸钠，硫氰酸胍作为离液剂和强变性剂，有助于核酸的分离，柠檬酸钠用于调节pH值；所述酚氯仿使蛋白质变性，同时抑制了RNA酶的降解作用。本发明将1.5×LH液用于提取痕量唾液斑miRNA能够达到很好的效果，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm2陈旧唾液斑(约含10ng RNA)样品即可。本发明的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。
附图说明
图1为应用安捷伦Agilent 2100生物分析仪对是实施例1的miRNA文库进行的DNA电泳结果；
图2为人唾液斑表达水平最高的miRNA统计结果。
具体实施方式
本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水，优选为蒸馏水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。
本发明首先取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；所述唾液斑样本的面积优选的≥1cm2；所述唾液斑样本的体积优选的≥20μL；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比优选为20～40μL：1mL，更优选为30μL：1mL；所述取唾液斑样本的设备优选为打孔器；所述混合的容器优选为1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述离心的温度优选为20～25℃；所述离心的离心力优选为400g；所述离心的时间优选为30min。
得到第一上清液后，本发明将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；所述1.5×LH液优选的包括以下浓度的组分：硫氰酸胍6mol/L和柠檬酸钠37.5mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水，优选为蒸馏水；所述硫氰酸胍为离液剂和强变性剂有助于核酸的分离，柠檬酸钠用于调节pH值；所述酚氯仿优选的包括以下体积份的组分：酚5份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度优选为4.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量优选为1～1.5mL：4～6mL：0.3～0.5mL；所述酚氯仿使蛋白质变性，同时抑制了RNA酶的降解作用。
所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述震荡优选为剧烈震荡；所述震荡的时间优选为15s；所述冰浴的时间优选为8min；所述离心的时间优选为20min。
得到上层水相后，本发明将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述异丙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述静置的时间优选为4h；所述离心的时间优选为15min。
得到第一沉淀后，本发明优选的还包括将第一沉淀和乙醇水溶液混合，于7500g下离心8min，得到清洁第一沉淀；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比优选为75％。
将所述清洁第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度优选为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量优选为150～250μL，更优选为200μL；所述乙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述混合的容器优选为新的1.5mL无酶离心管；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述放置的时间优选为1h；所述离心的时间优选为15min。
得到第二上清液后，本发明将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述乙醇的用量优选为300～500μL，更优选为400μL；所述放置的时间优选为1h；所述干燥的时间优选为15min。
本发明得到唾液斑miRNA后，优选的还包括将唾液斑miRNA和无核酶水混合；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述无核酶水的用量优选为20μL。
本发明还提供了上述方案任意一项所述提取方法得到的唾液斑miRNA。
本发明还提供了一种利用上述方案所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
本发明首先将所述唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5′-rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2-3′；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为5′-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-3′。
本发明具体实施过程中，首先连接唾液斑miRNA和3'SR接头，得到第一连接混合物；所述唾液斑miRNA的用量优选为10～100ng；所述3'SR接头需提前在无核酸酶的水中以体积比1：2进行稀释；所述连接体系以20μL计包括：唾液斑miRNA6μL、3'SR接头1μL、3'连接反应缓冲液(2X)10μL和3'连接酶混合物3μL；所述反应程序：将唾液斑miRNA和3'SR接头混合，于70℃孵育2min，转移至冰上，加入3'连接反应缓冲液(2X)和3'连接酶混合物，于25℃孵育1h；孵育时间更长、温度更低(18h；16℃)可提高甲基化RNA的连接效率，如piRNAs(如果样品中存在)，但是会形成一些连接化产物。
得到第一连接混合物后，本发明将所述第一连接混合物、无核酸酶水和SR RT引物混合，杂交逆转录引物，得到第二连接混合物；以唾液斑miRNA用量为6μL计，所述无核酸酶水的用量为4.5μL，所述SR RT引物的用量为1μL；所述杂交逆转录引物的反应程序为：75℃、5min；37℃、15min；25℃、15min；所述SR RT引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，具体为：5′-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′。
得到第二连接混合物后，本发明连接第二连接混合物和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述5'SR接头重悬于无核酸酶水中；5'SR接头在无核酸酶水中优选的以体积比1：2进行稀释；所述连接的体系以30μL计包括：变性5'SR接头1μL、5'连接反应缓冲液(10X)1μL、5'连接酶混合物2.5μL和第二连接混合物25.5μL；所述连接的程序为：25℃孵育1h；所述变性5'SR接头采用以下方法制备得到：将5'SR接头于70℃孵育2min，再于冰上变性30min，得到变性5'SR接头。
得到连接接头的RNA后，本发明对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；所述逆转录的反应体系以40μL计包括：连接接头的RNA30μL、第一链合成反应缓冲液8μL、RNase抑制剂1μL和ProtoScript II逆转录酶1μL；所述逆转录的反应程序为：50℃孵育60min。
得到逆转录产物后，本发明对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2X Master Mix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCG-s-A-3′；所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：4～SEQ ID NO：15所示。
得到cDNA构建体后，本发明对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
本发明在得到cDNA构建体后，优选的还包括对所述cDNA构建体进行纯化，得到cDNA纯化物；本发明对所述纯化的方法或者采用的试剂盒没有特殊限制，采用本领域常规方法或试剂盒即可。
本发明具体实施过程中，得到cDNA纯化物后，将所述cDNA纯化物和凝胶上样染料混合，得到凝胶样品；所述cDNA纯化物和的体积比优选为5：1；所述凝胶上样染料优选为蓝色(6X)。
本发明对所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
在切胶回收146～153bp大小的片段后，本发明优选的还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库；相对于传统方法中于-80℃下冷冻30min，本发明将冷冻时间延长至2h，DNA回收效果更佳。
本发明中，以每组回收的洗脱液计，所述线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇的用量分别为1μL、25μL和750μL；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度优选为3M；所述乙酸钠水溶液的pH值优选5.5；所述离心的转速优选的>14,000×g；所述离心的温度优选为4℃；所述离心的时间优选为30min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 miRNA提取
配制LH液(1.5×):6mol/L硫氰酸胍，37.5mmol/L柠檬酸钠和蒸馏水；
1.用打孔器截取人唾液斑样本【样本为储存6个月的中国北方汉族人群唾液斑样本。(1～3为男性，4～6为女性，年龄为30～40岁)】(至少20μL唾液，唾液斑面积不小于1cm2)。放入1.5mL无酶离心管中。
2.加入PBS 1mL，混合均匀，室温400g离心30min。
3.去掉上清，加入15mL无酶离心管，加入4mL 1.5×LH液，加入8mL酚氯仿(酚：氯仿＝5：1，体积比)和0.5mL 4.2mol/L乙酸钠水溶液，混合均匀，剧烈震荡15s，冰浴5min。
4.12000g离心20min。
5.将上层水相转移至一个新的1.5mL无酶离心管中。
6.加入等体积异丙醇400μL，4℃放置4h。
7.12000g高速离心15min，管底即为RNA沉淀。
8.转移上清液至新的1.5mL无酶离心管，加入800μL 75％乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500g离心8min。
9.加入200μL 0.2mol/L氯化钠再溶解RNA，用400μL 100％乙醇沉淀RNA，-20℃放置1h。
10.12000g高速离心15min，用400μL 100％乙醇沉淀RNA，-20℃放置1h。
11.打开管口，室温干燥15min。
12.加入20μL无核酶水。
对比例1 trizol法提miRNA
试剂：三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，75℅乙醇，DEPC水、Trizol reagent
材料与仪器：EP管、匀浆器、移液枪、漩涡振荡器、低温高速冷冻离心机、冰袋、电泳仪、琼脂糖凝胶、超净工作台
操作步骤：
1)取人唾液斑样本(与实施例1相同)，加0.5mL Trizol reagent于冰上充分匀浆，然后再加入0.5mL Trizol冲洗匀浆器，转移至1.5mL EP管中
2)将匀浆样品在15～30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3)每使用1mL Trizol加0.2mL氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
4)4℃12000rpm，离心10～15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μL，约为所用Trizol试剂的60％)转移到新管中。
5)在得到的水相溶液中加入等体积(500μL)的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃、放置20～30min。
6)4℃12000rpm离心10min，去上清。
7)加入1mL 75％乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。
8)4℃12000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清。
9)室温放置晾干。加入30μL DEPC水。
实施例1和对比例1制备得到的miRNA浓度比较结果参见表1。
表1 实施例1和对比例1制备得到的miRNA浓度比较结果
Figure BDA0002310878670000101
实施例2 miRNA文库的建立
一、连接3'SR接头
分别取实施例1和对比例1的miRNA，总RNA量为10～100ng，3'SR接头需提前在无核酸酶的水中以1：2稀释。
1、将以下组分在无菌、无核酸酶的PCR管中混合：
Figure BDA0002310878670000102
Figure BDA0002310878670000111
2、在70℃预热的热循环仪中孵育2min。将管转移到冰上。
3、加入以下成分：
Figure BDA0002310878670000112
4、25℃下在热循环仪中孵育1h；
注意：孵育时间更长、温度更低(18h；16℃)可提高甲基化RNA的连接效率，如piRNAs(如果样品中存在)。但是，可能会形成一些连接化产物。
二、杂交逆转录引物
5、将以下组分添加到步骤4的连接混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000113
6、在75℃下加热样品5min。转移至37℃维持15min，接着在25℃维持15min。
三、连接5'SR接头
7、剩余5min时，将5'SR接头重悬于120μL无核酸酶水中。需要在无核酸酶水中1：2稀释引物。
8、将1.1NμL的5'SR接头分装到无核酸酶的200μL PCR管中，其中N等于当前实验所得的样品体积。
9、将接头在70℃的热循环仪中孵育2min，然后立即将管置于冰上。将管保持在冰上并在变性后30min内使用变性的接头。
注意：将剩余的重悬5'SR接头储存在-80℃。
10、将以下组分添加到步骤6的连接混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000114
Figure BDA0002310878670000121
11、25℃下在热循环仪中孵育1h。
四、执行逆转录
12、将以下组分在无菌、无核酸酶的试管中混合：
Figure BDA0002310878670000122
13、在50℃孵育60min。
14、立即进行PCR扩增。
五、进行PCR扩增
15、将以下组分添加到步骤14的RT反应混合物中并充分混合：
Figure BDA0002310878670000123
Prep Set包含1～12个PCR引物，每个引物具有不同的标志。对于每个反应，在PCR步骤中仅使用12个PCR引物中的一个。
RNA PCR Primer Index(RPIX)共12种，具体如下：
Index 1 Primer(第一引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 2 Primer(第二引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 3 Primer(第三引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 4 Primer(第四引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 5 Primer(第五引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 6 Primer(第六引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 7 Primer(第七引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 8 Primer(第八引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 9 Primer(第九引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 10(第十引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 11(第十一引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
Index 12(第十二引物)：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3
PCR循环条件参见表2。
表2 PCR循环条件
Figure BDA0002310878670000141
六、使用6％聚丙烯酰胺凝胶进行文库质量检查和长度选择
1.使用QIAQuick PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增的cDNA。
2.在27.5μL无核酸酶水中洗脱扩增的DNA。
3.使用DNA 1000芯片在生物分析仪上加载1μL PCR纯化物。
4.将纯化的PCR产物(25μL)与5μL凝胶上样染料，蓝色(6X)混合。
注意：在使用之前，震荡上样染料使其充分混匀。
5.在6％PAGE 10孔凝胶上的一个孔中加入5μLQuad-load pBR322 DNA-MspIDigest。
6.在6％PAGE 10孔凝胶的两个孔上各加扩增的cDNA构建体和上样染料混合物15μL。
7.120V凝胶电泳1h或直到蓝色染料到达凝胶底部。不要让蓝色染料离开凝胶。
8.从设备中取出凝胶，用SYBR Gold核酸凝胶染色剂将凝胶染色2～3min，然后在紫外透射仪上观察凝胶。
9.140和150个核苷酸条带分别对应于衍生自21和30个核苷酸RNA片段的衔接子连接的构建体。对于miRNAs，分离对应于～140bp的条带。对于piRNsA，分离对应于～150bp的条带。
10.将来自相同样品的两个凝胶切片放入一个1.5mL管中，并用不含RNase的一次性沉淀杵将凝胶切片压碎，然后浸泡在250μL DNA凝胶洗脱缓冲液(1X)中。
11.在20～25℃环境下在旋转培养器上以50rpm转旋转10h。
12.将洗脱液和凝胶碎片转移到凝胶过滤柱的顶部。
13.以>13,200rpm离心过滤器2min。
14.回收洗脱液并加入1μL线性丙烯酰胺、25μL 3M乙酸钠、pH 5.5和750μL 100％乙醇。
15.充分涡旋。
16.在-80℃下冷冻2h。
17.4℃下，在>14,000×g的微量离心机中旋转30min。
18.去除上清液，注意不要打乱沉淀。
19.通过用80％乙醇剧烈涡旋洗涤沉淀。
20.4℃下，在>14,000×g的微量离心机中旋转30min。
21.室温下风干沉淀多达10min，以除去残留的乙醇。
22.将沉淀重悬于12μL TE缓冲液中。
23.2100仪检测文库质量。
七、实施例1和对比例1对应的miRNA文库质量及测序结果
应用传统方法(对比例1)提取的miRNA无法实现唾液斑miRNA高通量测序检测，不能满足建库要求。
应用实施例1提取的miRNA成功建立miRNA文库，在146～153bp处有明显条带。
图1为应用安捷伦Agilent 2100生物分析仪对是实施例1的miRNA文库进行的DNA电泳结果；由图1可以看出在146～153bp处峰高明显，提示此处有明显DNA条带，结果表明miRNA文库片段大小正确。
人唾液斑表达水平最高的miRNA统计结果参见图2，由图2可以看出，在唾液斑中有效检出142种miRNA，占比最多的为let-7f-5p(7.12％)，let-7i-5p(7.23％)，miR-486-5p(5.86％)，let-7i-5p(4.77％)，miR-21-5p(3.89％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市理化分析测试中心
<120> 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcggaag agcacacgtc t 21
<210> 2
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
rgrururcra rgrargruru rcrurarcra rgrurcrcrg rarcrgraru rc 52
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
rgrrrcrarg rargrrrcrr arcrargrrc rcrgrarcrg rarrc 45
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atccaag 67
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagaagacgg catacgagat acatcggtga ctggagttca gacgtgtgct cttccgatc 59
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatgcctaa gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatcactgt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatattggc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatgatctg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agattcaagt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agatctgatc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agataagcta gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatgtagcc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agattacaag gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agacgtgtgc tcttccgatc t 21

Claims (8)

1.一种唾液斑miRNA的提取方法，由以下步骤组成：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液由以下浓度的组分组成：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿由以下体积份的组分组成：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L；
步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为250μL，所述乙醇的用量为300μL；
以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量500μL。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本所含唾液量和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为3～5mL：7～9mL：0.3～0.8mL。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。
5.权利要求1～4任意一项提取方法得到的唾液斑miRNA。
6.一种利用权利要求5所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；
S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；
S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2X MasterMix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；
所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。
CN201911258166.2A 2019-12-10 2019-12-10 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法 Active CN110904094B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911258166.2A CN110904094B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911258166.2A CN110904094B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110904094A CN110904094A (zh) 2020-03-24
CN110904094B true CN110904094B (zh) 2021-07-30

Family

ID=69824200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911258166.2A Active CN110904094B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110904094B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484451A (zh) * 2013-09-29 2014-01-01 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种植物小rna的快速提取方法
CN105385680A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 天津脉络生物科技有限公司 用于dna和rna同时提取的试剂，提取方法和用途
CN105624798A (zh) * 2016-02-19 2016-06-01 北京乐普基因科技股份有限公司 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
CN105907747A (zh) * 2016-04-11 2016-08-31 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法
CN108977435A (zh) * 2018-07-27 2018-12-11 北京市理化分析测试中心 陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法
CN109402108A (zh) * 2017-08-18 2019-03-01 上海叶知生物医药科技有限公司 一种细胞外囊泡中rna的提取方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070202511A1 (en) * 2006-02-28 2007-08-30 Sigma-Aldrich Co. Methods and compositions for the rapid isolation of small RNA molecules
CN102534813B (zh) * 2011-11-15 2013-09-04 杭州联川生物技术有限公司 构建中小片段rna测序文库的方法
CN102559659B (zh) * 2011-12-28 2013-07-31 浙江工业大学 一种用乙醇分级沉淀纯化dna的方法
CN102888396B (zh) * 2012-09-06 2014-06-04 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种分离植物低分子量rna的方法
CN106318931A (zh) * 2016-08-18 2017-01-11 深圳市人口和计划生育科学研究所 一种从血浆中提取微小rna的方法及其试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484451A (zh) * 2013-09-29 2014-01-01 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种植物小rna的快速提取方法
CN105385680A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 天津脉络生物科技有限公司 用于dna和rna同时提取的试剂，提取方法和用途
CN105624798A (zh) * 2016-02-19 2016-06-01 北京乐普基因科技股份有限公司 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
CN105907747A (zh) * 2016-04-11 2016-08-31 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法
CN109402108A (zh) * 2017-08-18 2019-03-01 上海叶知生物医药科技有限公司 一种细胞外囊泡中rna的提取方法
CN108977435A (zh) * 2018-07-27 2018-12-11 北京市理化分析测试中心 陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High-Yield RNA-Extraction Method for Saliva;Pandit P et al;《Clinical Chemistry》;20130701;第59卷(第7期);第1118-1122页 *
microRNA提取、检测新技术的构建及其初步评价;吕微风;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20190115(第1期);第E060-1249页 *
Recovery and Stability of RNA in Vaginal Swabs and Blood, Semen, and Saliva Stains;Mindy Setzer et al.;《JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES 》;20080219;第53卷(第2期);摘要，第297页左栏第3段，第299页表2 *
法医物证学miRNA分析的研究进展;胡荣 等;《中国法医学杂志》;20161020;第31卷(第5期);第456-458页，第462页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110904094A (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Körbler et al. A simple method for RNA isolation from formalin-fixed and paraffin-embedded lymphatic tissues
CN106498040A (zh) 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法
CN110396516B (zh) 一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法
CN112680797B (zh) 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法
WO2012037883A1 (zh) 核酸标签及其应用
CN111118001B (zh) 一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒
JP7248228B2 (ja) Ｒｎａライブラリーの構築のための方法及びキット
CN112662760A (zh) 一种癌症基因甲基化检测系统和在该系统在中执行的癌症体外检测方法
US20030186287A1 (en) Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cDNA and genomic DNA
CN108192965B (zh) 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法
CN112410331A (zh) 带分子标签和样本标签的接头及其单链建库方法
EP3719182B1 (en) Method for constructing library of cell-free dnas in body fluids and application thereof
US6387624B1 (en) Construction of uni-directionally cloned cDNA libraries from messenger RNA for improved 3′ end DNA sequencing
CN110904094B (zh) 一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法
CN105349666B (zh) 缺血性脑卒中miRNA标记物
JP2002534099A (ja) 核酸を同定する方法
US20220380839A1 (en) Methods and kits for depleting undesired nucleic acids
CN110592220B (zh) 一种早期结直肠癌诊断标志物circ3823及其应用
EP2196537B1 (en) Method for synthesis of single- or double-stranded dna, and kit for the synthesis
US6017739A (en) Method and nucleic acid-concentratiing assay kit for concentrating mutant nucleic acid
CN116463398B (zh) 一种与鸡核糖体rna结合的特异性探针组及应用
CN113817805B (zh) 一种mgmt启动子甲基化检测方法、引物组以及试剂盒
CN112941147B (zh) 一种高保真靶标基因建库方法及其试剂盒
CN112501289A (zh) 一种微小核酸联合扩增检测方法及试剂盒
CN116144784A (zh) 一种基于ssr区分野生羊鲍群体和底播群体的分子标记技术

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant