CN112501289A - 一种微小核酸联合扩增检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种微小核酸联合扩增检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微小核酸联合检测方法及试剂盒，利用单链模板探针杂交捕获多个目标微小核酸，通过绿豆核酸酶酶切去除过量单链模板探针，纯化得到与目标微小核酸形成双链的模板探针，再进行PCR扩增检测，阳性扩增结果指示目标微小核酸的存在。本发明将微小核酸检测的PCR前处理步骤减少至3步，将通量提高至传统PCR法的4倍，并且避免基因组DNA、初级前体、次级前体、双链前体的干扰，有利于改善和推进微小核酸检测的普及应用。

Description

一种微小核酸联合扩增检测方法及试剂盒
1技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其是涉及一种微小核酸联合扩增检测方法(miRNACombined Amplification Protocol，MCAP)，及利用该方法进行微小核酸检测的试剂盒，以及该方法和试剂盒在体外诊断和鉴定中的应用。
2背景技术
微小核酸miRNA(microRNA，微小核糖核酸)是一类进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，长约22个核苷酸(nt)，广泛存在于真核生物包括人体及源于人体的组织、血液、体液内，由基因转录产生的初级前体pri-miRNA经剪切得到的次级前体pre-miRNA，再次剪切得到双链前体(miRNA duplex)，最后解链而得到。miRNA在体内具有多种重要的基因调节功能，其表达异常与各种疾病包括肿瘤的发生发展转移有着密切的关系。miRNA作为分子标记物应用于肿瘤早期筛查和诊断、预后判断以及药物选择、疗效检测，有着独特的优势，非常适合成为肿瘤液体活检靶标：(1)miRNA可在血液等体液中稳定富集易被检出。肿瘤细胞产生miRNA并通过微囊泡和外泌体等分泌机制分泌进入血液等体液中；且有微囊泡和外泌体的包被膜或RNA结合蛋白包装保护，因此，能在血液等体液中稳定富集存在，不易被降解，并可耐受反复冻融和极端pH环境等处理过程，而易被检出。(2)血液异常富集的miRNA可发生在肿瘤早期阶段。血液异常富集的miRNA来源于组织原位肿瘤细胞的表达和分泌，并不需要肿瘤细胞本身转移进入血液，因此，可发生在肿瘤早期阶段。循环肿瘤细胞(CTC)和游离DNA(ctDNA)则是肿瘤细胞直接转移进入血液的结果，而这一般发生在肿瘤晚期阶段。因此，miRNA检测能应用于肿瘤早期阶段，而CTC和ctDNA检测一般只适用于肿瘤晚期阶段。(3)miRNA组合表达具有高度的特异性。miRNA可在肿瘤组织的不同来源甚至不同分期，呈现出不同的表达组合，具有组织来源和分期特异性，因此，血液miRNA组合检测检测可以判断肿瘤组织来源，甚至可以进一步应用于肿瘤分期诊断。(4)miRNA检测可利用PCR扩增在高特异性基础上达到很高的灵敏度，诊断价值高。而肿瘤检测常用的血液蛋白质标志物，如：常规肿瘤标志物和自身抗体等，不是恶性肿瘤的特异性标志，灵敏度有限，在诊断上只有辅助价值。
当前检测miRNA的方法主要有：Northern blotting、miRNA测序、微阵列(基因芯片)、实时荧光定量PCR等。Northern blotting是经典的实验方法，其主要过程是利用标记的寡核苷酸探针与结合在硝酸纤维素膜上的目标miRNA互补杂交，然后显影指示结果。该方法操作步骤繁琐，过程冗长，一条探针对应一条miRNA，通量低，对稀有miRNA检测灵敏度较低，不适用于临床普及应用。miRNA测序是一种高通量研究方法，但是该方法需要先对纯化后的miRNA样品分别进行3’端和5’端接头连接反应，再进行逆转录和PCR扩增建立miRNA文库，然后再对文库进行检测和上机测序，过程复杂耗时，一般用于无任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA的表达谱及发现和鉴定新miRNA分子，而不用于体外诊断等临床普及应用领域。微阵列的主要步骤是首先对富集miRNA进行加尾荧光标记，再将标记的miRNA与固定于固相支持物上的多个与目标miRNA序列互补的探针进行杂交，洗涤后进行荧光信号扫描分析。该方法检测通量高，但不进行扩增，检测灵敏度不高，需较高浓度目标miRNA，且难以区分miRNA与其3种前体，重复性较差。实时荧光定量PCR能够比其它方法达到更好的灵敏度和准确度，是目前最常用的miRNA检测方法。现有基于实时荧光定量PCR的miRNA检测，均是以miRNA为起始模板进行逆转录制备PCR模板，后续的PCR扩增检测反应体系中含有荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，得到荧光扩增曲线图，在电脑系统设定基线和阈值线，反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的反应循环数为Ct值，其与模板的起始拷贝数存在反比关系，Ct值越小，起始模板拷贝数越多，无Ct值，则指示没有检测到起始模板，属阴性。根据其从miRNA逆转录制备PCR模板方法的不同又分为2种，分别为poly(A)加尾-连接酶接头-逆转录-PCR法(简称：PolyA加尾法)和加尾长引物逆转录-PCR法(简称：加长引物法)。PolyA加尾法，包含加尾、连接、逆转录、PCR等4步酶促反应，操作繁琐，灵敏度和重复性较差，已基本被加长引物法淘汰。当前重要的加长引物法，包括茎环引物法和LNA(锁核苷酸)引物法。茎环引物法利用一个自身形成茎环结构的加长引物3’端部分，与miRNA的3’端部分互补结合引导进行逆转录反应制备PCR模板，然后利用与miRNA的5’端部分同源的上游引物及与茎环同源的下游引物进行荧光定量PCR扩增检测。由于miRNA总体长度只有约22nt，因此可用于逆转录的部分和用于上游引物的部分都较短，分别约11nt，必须使用较低的退火温度启动逆转录和PCR扩增，导致该方法易受非特异逆转录和非特异扩增的干扰。LNA引物法，利用锁核苷酸(LNA)提高Tm值，能够提高退火温度和扩增特异性，其先通过一个加尾的miRNA特异引物从miRNA逆转录得到加尾cDNA，然后利用一个LNA修饰的miRNA特异性反向引物和一个与加尾序列一致的通用引物进行PCR扩增。由于LNA合成费用为普通核苷酸的200倍以上，LNA引物法显著增加了检测成本，且仍没有解决好miRNA检测以下2个方面的问题：(1)易受基因组DNA、miRNA前体及非特异逆转录的干扰，尤其是次级前体的干扰较大，导致重复性较差。在核酸提取步骤增加外泌体提取过程，进行外泌体miRNA检测，有利于排除基因DNA及前体干扰，但是，外泌体提取大大增加了操作的复杂性，容易导致miRNA的损失和较低的回收率，损害miRNA检测的灵敏度和重复性，不利于临床检测应用。近年来的研究表明，基因组DNA片段和miRNA次级前体也有可能被包装进入外泌体，干扰影响外泌体miRNA检测的重复性。(2)不兼容通用引物PCR，也较难进行多重PCR，检测通量较低。通用引物PCR，即由一对引物一个体系扩增检测多种模板，能够显著增加PCR的检测通量。多重PCR，即由多对引物在一个体系同时扩增多种模板，也能够提高PCR法的检测通量，但提升比较有限-一般很难超过3对引物，因为3对以上的引物在同一个体系中容易出现严重的非特异扩增干扰。由于miRNA的加长引物PCR体系中一种miRNA模板对应3条引物：加长引物、上游引物、下游引物各1条，miRNA的多重PCR体系比较复杂，且因必须使用较低的退火温度启动，非常容易造成引物之间严重干扰而失败。当前的荧光定量PCR一个体系一般只能检测一种miRNA，检测通量低。由于疾病包括肿瘤往往需要同时检测多种miRNA的组合，检测低通量的现状严重影响了miRNA的临床检测应用。
《一种RNA的免洗涤模板探针PCR检测方法》(ZL201310205271.6)是我们发明建立用于RNA的PCR检测方法，能使用通用引物，但其直接应用于miRNA检测，容易受基因组DNA及3种miRNA前体的杂交干扰，尚不能很好地解决上述问题。
3发明内容
本发明目的是针对性地解决上述miRNA检测的荧光定量PCR法存在的操作复杂、重复性差、通量低等问题，提供一种操作简单、重复性好、通量较高，能够在一个体系内同时进行多种miRNA组合检测的扩增检测方法及试剂盒。
本发明采用的技术方案是：微小核酸联合扩增检测，其使用模板探针杂交同时结合3种或更多的目标miRNA，同时以引物及互补探针与模板探针两端的引物位点结合，在以绿豆核酸酶酶切处理，切断未与目标miRNA结合的模板探针，再提取纯化得到被目标miRNA、引物及互补探针结合保护而保持完整的模板探针，进行PCR扩增，扩增结果指示miRNA的存在。具体如下：
准备阶段：设计合成模板探针。模板探针是一段人工合成的寡核苷酸单链DNA，其序列结构，从5’端至3’端包括3个区域，依次是：上游引物同源区、扩增区、下游引物结合区，全部区域都设计为miRNA结合区，可以连续结合2～4种miRNA。2个看家基因miRNA结合区分别位于上游引物同源区和下游引物结合区，2个疾病特异miRNA结合区位于扩增区。检测操作步骤：第一步，核酸样品制备。从血液、体液、细胞、已磨碎的组织等初始样品通过裂解、保温、离心或柱纯化等步骤得到初步纯化的核酸样品，模板探针可以添加在本步骤，同步完成模板探针与miRNA的杂交结合。第二步，绿豆核酸酶酶切。将第一步得到的核酸样品与含有绿豆核酸酶、氯化钠、乙酸钠、Zn2+的反应体系混合保温一段时间，与目标miRNA完全结合的模板探针形成双链核酸，而不会被酶切；没有被目标miRNA完全结合或者存在错配的非特异杂交结合的模板探针均不能形成双链保护而被酶切。第三步，核酸纯化。对第二步反应完成后的样品进行核酸纯化，得到核酸样品，其中包含与目标miRNA形成双链核酸的模板探针。第四步，扩增检测。将第四步得到的样品，与荧光定量PCR体系混合，其中包含上游引物、下游引物及与扩增区同源或结合的荧光探针或荧光染料、Taq DNA聚合酶等其它常规PCR组分。然后，在PCR热循环仪上，以常规PCR程序进行PCR反应。该反应以模板探针互补链为模板，上下游引物为引物，Taq DNA聚合酶催化进行PCR扩增，阳性结果(有扩增，即有Ct值)指示目标miRNA的同时存在于初始样品中。阴性结果(无扩增，即无Ct值)指示。该技术方案的流程原理图参见附图1。
上文所述的模板探针，可在其序列5’端和3’端各设置1个硫代核苷酸，以抑制核酸酶降解，增强稳定性，在3’端同时设置生物素修饰，可用于链霉亲和素纯化体系。
上文所述的核酸样品制备，是对脱离了有生命的人体的血液、体液、细胞、或已磨碎的组织碎片等初始样品，进行的裂解纯化处理制备过程。制备过程可以采用经典的TRIZOL法，也可以采用吸附柱法，也可以采用商品化抽提试剂盒。优选的裂解液组成为：10mM ZnCl2、3mM CTAB、5％(v/v)Triton X-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.7。该步骤涉及保温过程，优选的保温条件为室温10分钟。
上文所述的绿豆核酸酶酶切保温条件，优选的反应体系组成为：pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mM NaCl、1mM ZnCl2、0.05U/μl绿豆核酸酶，优选的保温条件为室温10分钟。
上文所述的扩增检测，可以是TaqMan等荧光探针PCR法，也可以是SYBR Green I等荧光染料PCR法。优选的方案是SYBR Green I荧光染料PCR法，优选的体系组成是：50mMTris-HCl pH8.3、50mM KCl、0.06U/μl Taq DNA聚合酶、0.4×SYBR Green I、0.1mM EDTA-Na2、5％(v/v)甲酰胺、5％(v/v)甘油、0.2mM dNTP、2.5mM MgCl2、0.2μM PCR上游和下游引物，将经绿豆核酸酶保温酶切之后的样品经核酸纯化后按1:10的比例加入到本体系后，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增检测。优选的反应程序为：93℃5分钟，然后40个循环的93℃15秒、65℃25秒、80℃35秒，荧光信号采集在80℃。
基于本方法的试剂盒，由吸附柱、收集管、处理液等主要组分组成。吸附柱和收集管的作用是吸附核酸和收集柱纯化步骤产生的废液。处理液1是裂解液，组成为：10mMZnCl2、3mM CTAB、5％(v/v)Triton X-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM NaAcpH 4.7，在使用前加入1/10体积的100nM模板探针，作用是裂解血液、体液、细胞、已磨碎的组织等初始样品，释放出核酸，并同步完成miRNA与模板探针的杂交结合。处理液2是洗涤液，组成为：pH 5.0的25mM乙酸钠，使用前用75％乙醇稀释25倍，作用是从吸附柱洗涤去除杂质。处理液3是酶切液，组成为：pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mM NaCl、1mM ZnCl2、0.05U/μl绿豆核酸酶，作用是酶切降解未完全互补结合目标miRNA的模板探针。处理液4是洗脱液，组成为：50mM Tris-HCl pH7.7、50mM KCl、5mM MgCl2、5mM 2-ME、0.4mM dNTP、3％(v/v)甲酰胺，作用是从吸附柱洗脱核酸，并给后续反应提供Mg2+和dNTP。处理液5是PCR液，组成为：pH 8.3的50mM Tris-HCl、25mM KCl、0.06U/μl Taq DNA聚合酶、0.8×SYBR GreenI、0.1mM EDTA-Na2、5％(v/v)甲酰胺、6％(v/v)甘油，在使用前加入1/10体积的4μM PCR上、下游引物，并按15μl体积分装至PCR管中备用，作用是进行PCR扩增检测。用于miRNA检测时，用户需先按本发明方法设计合成模板探针、上游引物、下游引物，并将模板探针配制成100nM工作液，将上、下游引物配制成5μM:5μM的工作液。实验开始前，将模板探针工作液按1:10的体积比加入到处理液1中，将上、下游引物工作液按1:10的体积比加入到处理液5中。实验时，取加有模板探针的处理液1与血液、细胞或已磨碎的组织等初始样品按10:1的体积比混匀，在室温静置5分钟，短暂离心后，取不超过800μl体积的上清加到吸附柱中，离心弃流出液，向柱子中加入600μl已用75％乙醇稀释25倍的处理液2，以≥12000rpm离心1分钟，弃流出液，向柱子吸附膜上加入50μl处理液3，在室温保温10分钟，再向柱子中加入600μl已用75％乙醇稀释25倍的处理液2，以≥12000rpm离心1分钟，弃流出液；将柱子放到空的收集管上，以≥12000rpm离心1分钟；转移至干净的1.5ml离心管上，再向柱子膜中间加入35μl处理液4，在60℃保温2分钟，以≥12000rpm离心1分钟，收集流出液，取15μl流出液与已分装至PCR管中的15μl处理液5混合，盖紧后，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，运行反应程序：93℃5分钟，然后40个循环的93℃15秒、60℃25秒、80℃35秒，荧光信号采集在80℃。
做为模式体系，我们合成了与miR-191、miR-93、miR-16、miR-3662这4个人体miRNA完全结合的模板探针TSNOT，其中miR-191和miR-93的互补序列分别位于TSNOT的5’和3’端，miR-16和miR-3662的互补序列位于TSNOT的中间相连，4段序列连续相接，不存在任何额外间隔。并且，我们合成了序列分别与这4个miRNA相同的寡核苷酸探针：OLI-191、OLI-93、OLI-16、OLI-3662。我们还合成了用于该体系的PCR上游引物PMF191和PCR下游引物PMR93。该模式体系用于检测大肠杆菌样品，阴性样品为20μl 105/μl的大肠杆菌样品，阳性样品为20μl 105/μl大肠杆菌样品添加了103拷贝的OLI-191、OLI-93、OLI-16、OLI-3662。向450μl处理液1中加入50μl 100nM TSNOT，混合后分别吸取200μl加入至阴性样品和阳性样品中，循裂解-保温-上柱-洗涤-酶切-洗涤-洗脱-PCR的步骤处理，阴性样品无Ct值，显示无扩增，阳性样品Ct值为28.53，有明显特异扩增。该结果验证了体系能够用于4种寡核苷酸探针联合检测。我们进一步扩大测试该体系联合检测特性。阴性样品为20μl 105/μl的大肠杆菌样品，阳性样品为20μl 105/μl大肠杆菌样品添加了103拷贝的OLI-191、OLI-93、OLI-16、OLI-3662，比对样品1、2、3、4为20μl 105/μl大肠杆菌样品分别只添加了103拷贝的OLI-191或OLI-93或OLI-16或OLI-3662，比对样品5、6、7为20μl105/μl大肠杆菌样品分别只添加了103拷贝的OLI-191、OLI-93或OLI-191、OLI-3662或OLI-16、OLI-3662，检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为28.43，而比对样品1、2、3、4、5、6、7均无扩增，显示该体系扩增特异于4种目标序列的联合存在。
我们进一步利用模板探针TSNOT、引物PMF191、引物PMR93体系，以20μl105/μl的大肠杆菌样品为阴性样品，以20μl 104/μl的人肺癌A549细胞样品为阳性样品，进行miR-191、miR-93、miR-16、miR-3662这4个人体miRNA的联合检测。操作步骤同上文所述，检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为26.77，显示该体系能够用于联合检测所述的4种目标miRNA。
本发明的有益之处：本方法将miRNA全长(约22nt)完整用于一个位点的特异结合，比现有的荧光定量PCR法分割用于2个各约11nt的短位点结合，显著增强了结合的特异性和稳定性，能够避免短位点造成的非特异逆转录及非特异扩增干扰。本方法利用一条模板探针同时结合4种miRNA，不仅将miRNA检测的通量提高至传统PCR法的4倍，而且，在不提供核酸变性条件下，只有miRNA的成熟体即单链miRNA与模板探针结合，而基因组DNA、初级前体、次级前体、双链前体都是双链结构，不与模板链结合，因此，本方法能够直接避免基因组DNA、初级前体、次级前体、双链前体的干扰。传统方法尤其存在受次级前体，基因组DNA及包括双链前体在内的3种前体的干扰，不需要进行外泌体提取等额外分离纯化步骤，能显著降低操作的复杂性，相应地增强miRNA检测的灵敏度和重复性。再者，单链miRNA由于长度过短，影响与吸附柱的吸附结合，提取回收率较低，本方法在miRNA提取过程中，单链miRNA与模板探针结合形成长度增加约3倍的双链杂合分子，增强了与吸附柱的吸附结合，有利于提高miRNA的提取回收率。本方法的模板探针设计只需要miRNA结合区为单个miRNA序列特异，用于PCR的引物同源/互补结合区可以设计为通用序列，利用多通道的荧光定量PCR仪，用一套通用引物在同一个体系同时扩增检测多种miRNA，能够提高检测通量，不仅比通常利用多对引物进行的多重PCR简单易优化，而且各靶标扩增效率一致而具有更好的比对和相对定量性能。进一步地，针对同时分辨更多miRNA种类的需要，通过在扩增区设置标签序列对应各种miRNA，结合高分辨率的单链构象多态性(SSCP)电泳系统，用一套通用引物在同一个体系同时扩增检测几乎所有已知序列的miRNA，可以达到很高的通量性。本方法及基于本方法的试剂盒，将能够显著改善和推进miRNA检测的普及应用。下表总结比对本方法与传统PCR方法：
Figure BDA0002706879850000081
(四)附图说明
附图1、技术方案的流程原理图
Phase I、II、III、IV:用于检测miRNA的结合延伸扩增方法的4个主要步骤过程，Phase I，裂解杂交。处理液1中加有单链模板探针，在裂解样品释放核酸的同时，模板探针结合目标miRNA形成双链；Phase II，酶切。处理液3中含有绿豆核酸酶反应体系，双链保持完整，不被切割，而单链模板探针及与其它miRNA或单链核酸形成部分互补结合的模板探针，都被绿豆核酸酶切割；Phase III，核酸纯化。酶切后的样品进行纯化，或者柱内洗涤除去绿豆核酸酶，洗脱得到纯化的双链核酸；Phase IV，PCR扩增检测。有Ct值，指示阳性(+)，即联合检测的4种目标miRNA同时存在于被测样品中；No Ct，指示阴性(-)，即联合检测的4种目标miRNA没有同时存在于被测样品中。T1-T3-T4-T2:模板探针，M1、M2、M3、M4:4种miRNA。
(五)具体实施方式
实施例1：利用本方法和试剂盒检测混入大肠杆菌样品中的寡核苷酸探针本方法试剂盒组成如说明书正文所述。我们合成了与miR-191、miR-93、miR-16、miR-3662这4个人体miRNA完全结合的模板探针TSNOT，序列为：CAGCTGCTTTTGGGATTCCGTTGCGCCAATATTTACGTGCTGCTA CATCAGTCACTACTCATCATTTTC GTTTCACGACAAGCACGTCCATC，其中miR-191和miR-93的互补序列分别位于TSNOT的5’和3’端，miR-16和miR-3662的互补序列位于TSNOT的中间相连，4段序列连续相接，不存在任何额外间隔。作为模式验证，用于联合检测混入大肠杆菌样品中的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针序列分别与以上4个miRNA相同：OLI-191、OLI-93、OLI-16、OLI-3662，序列分别为：CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG、GATGGACGTGCTTGTCGTGAAAC、TAGCAGCACGTAAATATTGGCG、GAAAATGATGAGTAGTGACTGATG。用于该体系的PCR上游引物PMF191和PCR下游引物PMR93，序列分别为：CAACGGAATCCCAAAAGCA、GTTTCACGACAAGCACGTCC。阴性样品为20μl 105/μl的大肠杆菌样品，阳性样品为20μl 105/μl大肠杆菌样品添加了103拷贝的OLI-191、OLI-93、OLI-16、OLI-3662。向450μl处理液1中加入50μl 100nM TSNOT，混合后分别吸取200μl加入至阴性样品和阳性样品中。将处理液2用75％乙醇稀释25倍成为洗涤液。将引物PMF191和PMR93配制成5μM:5μM的工作液，按1:10的体积比加入到处理液5中。然后，我们将样品循裂解-保温-上柱-洗涤-酶切-洗涤-洗脱-PCR的步骤处理。最后，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，运行反应程序：93℃5分钟，然后40个循环的93℃15秒、60℃25秒、80℃35秒，荧光信号采集在80℃。检测结果：阴性样品无Ct值，显示无扩增，阳性样品Ct值为28.53，有明显特异扩增，显示该体系扩增特异于4种目标序列的联合存在。
实施例2：利用本方法和试剂盒检测人肺癌A549细胞中的4种miRNA
本方法试剂盒组成如说明书正文所述。模板探针TSNOT、引物PMF191、PMR93序列如实施例1所述。我们进一步利用模板探针TSNOT、引物PMF191、引物PMR93体系，以20μl 105/μl的大肠杆菌样品为阴性样品，以20μl 104/μl的人肺癌A549细胞样品为阳性样品，进行miR-191、miR-93、miR-16、miR-3662这4个人体miRNA的联合检测。操作步骤同实施例1所述，检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为26.77，显示该体系能够用于联合检测所述的4种目标miRNA。
实施例3：利用本方法和试剂盒检测人肺癌A549细胞培养液中的4种miRNA
癌细胞能够活跃地以外泌体和微囊泡的途径向周边环境分泌miRNA。这些细胞外miRNA因有包被膜保护能够长时间地稳定存在于体液或培养液中。我们将A549细胞连续培养3天，使得生长密度接近100％，然后收集了10μl培养液，利用本方法和试剂盒进行miR-191、miR-93、miR-16、miR-3662这4个人体miRNA的联合检测。本方法试剂盒组成如说明书正文所述。模板探针TSNOT、引物PMF191、PMR93序列、操作步骤如实施例1所述。我们进一步利用模板探针TSNOT、引物PMF191、引物PMR93体系，以20μl 105/μl的大肠杆菌样品为阴性样品，以20μl104/μl的人肺癌A549细胞样品为阳性样品，A549细胞培养液为待测样品。操作步骤同实施例1所述，检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为26.96，显示实验质控合格，待测样品Ct值为29.02，显示这4个miRNA稳定存在于细胞培养液中。
实施例4：利用本方法和试剂盒检测人体肺癌组织中的4种miRNA
本方法试剂盒组成如说明书正文所述。模板探针TSNOT、引物PMF191、PMR93序列同实施例1。确诊的肺癌患者20例，手术肺癌组织织切下后，立即液氮保存.癌组织经过病理验证.取约0.1cm3大小的组织块放入1.5ml离心管中，加入200μl裂解液(含有10nM TSNOT的处理液1)，用吸头捣碎组织块，室温振荡10min，5000rpm离心5min，取上清上柱。以下操作步骤如实施例1所述。检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为26.86，显示实验质控合格，20例肺癌组织的Ct值在19.80～29.87之间，均为阳性，显示以本方法和试剂盒对这4个miRNA联合检测肺癌组织阳性率为100％。
实施例5：利用本方法和试剂盒检测人体血液中的4种miRNA
本方法试剂盒组成如说明书正文所述。模板探针TSNOT、引物PMF191、PMR93序列同实施例1。上述确诊的肺癌患者20例血常规检验剩余血液样品和健康志愿者体检剩余血液样品约200μl/样品，于冷藏状态下以10μl/份分装于干净的1.5ml离心管中冻存备用。实验时取出样品，加入200裂解液(含有10nM TSNOT的处理液1)，混匀，室温振荡10min，5000rpm离心5min，取上清上柱。以下操作步骤如实施例1所述。检测结果：阴性样品无扩增，阳性样品Ct值为26.03，显示实验质控合格；20例肺癌患者血液样品的Ct值在27.48～34.88之间，均为阳性，显示以本方法和试剂盒对这4个miRNA联合检测肺癌血液阳性率为100％；同时，20例健康志愿者血液样品均无扩增，显示以本方法和试剂盒对这4个miRNA联合检测血液阴性符合率为100％。

Claims (4)

1.一种微小核酸联合扩增检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)设计合成模板探针。模板探针是一段人工合成的寡核苷酸单链DNA，其序列结构，从5’端至3’端包括3个区域，依次是：上游引物同源区、扩增区、下游引物结合区，全部区域都设计为微小核酸结合区，可以连续结合2～4种微小核酸，2个看家基因微小核酸结合区分别位于上游引物同源区和下游引物结合区，2个疾病特异微小核酸结合区位于扩增区；
(2)从血液、体液、细胞、已磨碎的组织等初始样品通过裂解、保温、离心或柱纯化等步骤得到初步纯化的核酸样品，模板探针可以添加在本步骤，同步完成模板探针与微小核酸的杂交结合；
(3)将上一步得到的核酸样品与含有绿豆核酸酶、氯化钠、乙酸钠、Zn2+的反应体系混合保温一段时间，与目标微小核酸完全结合的模板探针形成双链核酸，而不会被酶切；没有被目标微小核酸完全结合或者存在错配的非特异杂交结合的模板探针均不能形成双链保护而被酶切；
(4)对上一步反应完成后的样品进行核酸纯化，得到核酸样品，其中包含与目标微小核酸形成双链核酸的模板探针；
(5)将第四步得到的样品，与荧光定量PCR体系混合，其中包含上游引物、下游引物及与扩增区同源或结合的荧光探针或荧光染料、Taq DNA聚合酶等其它常规PCR组分，然后，在PCR热循环仪上，以常规PCR程序进行PCR反应，该反应以模板探针互补链为模板，上下游引物为引物，Taq DNA聚合酶催化进行PCR扩增，阳性结果(有扩增，即有Ct值)指示目标微小核酸的同时存在于初始样品中，阴性结果(无扩增，即无Ct值)指示。
2.如权利要求1所述的微小核酸联合扩增检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述裂解液组成如下：10mM ZnCl2、3mM CTAB、5％(v/v)Triton X-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.7。
3.如权利要求1所述的微小核酸联合扩增检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述反应组成如下：pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mM NaCl、1mMZnCl2、0.05U/μl绿豆核酸酶。
4.一种微小核酸联合扩增检测试剂盒，其特征在于吗，所述试剂盒包括吸附柱、收集管、处理液，包括：
(1)吸附柱和收集管的作用是吸附核酸和收集柱纯化步骤产生的废液；
(2)处理液1是裂解液，组成为：10mM ZnCl2、3mM CTAB、5％(v/v)TritonX-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM NaAc pH 4.7，在使用前加入1/10体积的100nM模板探针，作用是裂解血液、体液、细胞、已磨碎的组织等初始样品，释放出核酸，并同步完成微小核酸与模板探针的杂交结合；
(3)处理液2是洗涤液，组成为：pH 5.0的25mM乙酸钠，使用前用75％乙醇稀释25倍，作用是从吸附柱洗涤去除杂质；
(4)处理液3是酶切液，组成为：pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mMNaCl、1mM ZnCl2、0.05U/μl绿豆核酸酶，作用是酶切降解未完全互补结合目标微小核酸的模板探针；
(5)处理液4是洗脱液，组成为：50mM Tris-HCl pH7.7、50mM KCl、5mMMgCl2、5mM 2-ME、0.4mM dNTP、3％(v/v)甲酰胺，作用是从吸附柱洗脱核酸，并给后续反应提供Mg2+和dNTP；
(6)处理液5是PCR液，组成为：pH 8.3的50mM Tris-HCl、25mM KCl、0.06U/μl Taq DNA聚合酶、0.8×SYBR Green I、0.1mM EDTA-Na2、5％(v/v)甲酰胺、6％(v/v)甘油，在使用前加入1/10体积的4μM PCR上、下游引物，并按15μl体积分装至PCR管中备用，作用是进行PCR扩增检测。
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