CN115786511A - 小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用 - Google Patents

小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，属于生物化学技术领域。本发明从肺癌表达上调的小核酸中筛选肺癌相关靶标小核酸，且利用miRmine小核酸表达数据库查询，排除掉已知在普通人群血液中有高表达的小核酸，选择在普通人群血液中无表达或极低表达的小核酸。本发明在靶标各自独立且特异性均为100％的前提下，通过7个敏感性平均达到14.3％的靶标的并联联合检测，理论上可以达到100％的特异性和敏感性。

Description

小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌 预后的试剂或者试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用。
背景技术
小核酸(miRNA，微小核糖核酸)表达异常与各种疾病包括肿瘤的发生发展转移有着密切的关系，可在不同来源的肿瘤组织以及肿瘤的不同分期，呈现出不同的表达组合，可作为分子标记物应用于肿瘤早期筛查、预后判断以及药物选择、疗效检测等肿瘤液体活检方面。
细胞外小核酸又称游离小核酸，系由细胞内转录剪切合成，并通过外泌体或小囊泡机制分泌或细胞破裂进入到血液等体液中。外泌体体积较小，通透体内组织屏障能力较强，所以容易到达各种体液中，同时其脂质双分子层膜结构对其内容物起到了很好的保护作用，可防止内容物被血液循环中酶类物质降解。研究表明，血液异常富集的肿瘤来源的游离小核酸可发生在肿瘤早期阶段。肿瘤细胞通常比健康细胞释放更多的外泌体，健康人群血液中外泌体的含量约为108/ml，而肿瘤患者可超过109/ml，远远超过循环肿瘤细胞(CTC)含量(＜1～10个/ml)，而外泌体内容核酸以小核酸为主，因此，外泌体小核酸检测可比CTC或游离DNA(cfDNA)达到更好的灵敏度。
鉴于液体活检的样本(通常为血液)组成中源自正常的部分远大于异常的部分，直接检测异常信号出现或增加的正向检测远优于通过检测正常信号的减少而指示异常的反向检测，而消除正常本底是扩增检测放大异常与正常差异的有效手段。对于肺癌相关靶标小核酸而言，消除本底也即是把靶标特异性推进至100％，(1-特异性)是该靶标在非肺癌中出现几率，而敏感性是该靶标在肺癌中出现几率，在消除本底的同时，敏感性随之降低。因而，以小核酸为生物标志物在制备检测肺癌的试剂盒时，如何在保证特异性的情况下，同时提高敏感性成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，能够在保证特异性的情况下，有效提高敏感性。
本发明提供了小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，所述小核酸组合包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的探针组，所述小核酸包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p；
所述探针组包括主探针、通用辅探针和通用锚探针；
所述主探针从5’端至3’端顺次连接有通用辅探针结合区、小核酸结合区和通用锚探针结合区；
所述主探针包括第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针；
所述第一主探针的小核酸结合区能够和miR-191碱基互补结合；
所述第二主探针的小核酸结合区能够和miR-1244碱基互补结合；
所述第三主探针的小核酸结合区能够和miR-205碱基互补结合；
所述第四主探针的小核酸结合区能够和miR-205-3P碱基互补结合；
所述第五主探针的小核酸结合区能够和miR-3662碱基互补结合；
所述第六主探针的小核酸结合区能够和miR-944碱基互补结合；
所述第七主探针的小核酸结合区能够和miR-196a碱基互补结合；
所述第八主探针的小核酸结合区能够和miR-214碱基互补结合；
所述第九主探针的小核酸结合区能够和301b-5p碱基互补结合；
所述通用辅探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述通用锚探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的磁珠样本释放剂，包括上述方案所述的探针组和链霉亲和素磁珠；所述通用锚探针的5’末端标记有生物素。
优选的，所述磁珠样本释放剂以水为溶剂，包括以下浓度的组分：第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针分别为70nM、630nM通用辅探针、630nM通用锚探针、60mM氯化锌、60mM乙酸钠、60mM半胱氨酸、18g/100ml碳酸亚乙酯、体积浓度为30％的甲酰胺、6g/100ml十二烷基硫酸钠和630μg/ml链霉亲和素磁珠。
本发明还提供了上述方案所述的探针组或者所述的磁珠样本释放剂在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的试剂盒，包括上述方案所述的磁珠样本释放剂、洗涤剂、绿豆核酸酶液和PCR反应用试剂；
所述PCR反应用试剂包括引物组和荧光探针组，所述引物组包括通用上游引物和通用下游引物；
所述通用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述荧光探针组包括第一荧光探针、第二荧光探针、第三荧光探针、第四荧光探针、第五荧光探针、第六荧光探针、第七荧光探针、第八荧光探针和第九荧光探针；
所述第一荧光探针至第九荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ IDNO.13所示。
优选的，所述洗涤剂以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM 3-吗啉丙磺酸、60mM半胱氨酸、60mM乙酸钠、体积浓度为30％的甲酰胺和体积浓度为0.1％的吐温20。
优选的，所述绿豆核酸酶液中绿豆核酸酶的浓度为0.04U/μl。
优选的，所述绿豆核酸酶液以浓度为50mM的乙酸钠缓冲液为溶剂，包括以下浓度的组分：30mM氯化钠、1mM氯化锌和0.04U/μl绿豆核酸酶；所述乙酸钠缓冲液的pH值为5。
本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的小核酸同管联合检测的方法，包括以下步骤：
1)将待测血浆和磁珠样本释放剂混合，得到第一混合液，对所述第一混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第一剩余物；
2)在所述第一剩余物中加入洗涤液，得到第二混合液，对所述第二混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第二剩余物；
3)在所述第二剩余物种加入绿豆核酸酶液，进行保温，得到第三混合液，对所述第三混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第三剩余物；
4)在所述第三剩余物中加入洗涤液，得到第四混合物，对所述第四混合物进行磁铁吸附或离心1min，吸去上清，得到第四剩余物；
5)在所述第四剩余物种加入PCR反应用试剂，进行荧光定量PCR反应，启用CY5、FAM和HEX荧光检测通道和ROX本底校准；
结果判断：
CY5通道Ct值<37，指示取样及操作合格；
FAM通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662和miR-944中的1个或多个小核酸有扩增；
HEX通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-196a、miR-214和miR-301b-5p中的1个或多个小核酸有扩增。
本发明提供了小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，所述小核酸组合包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p。本发明的小核酸组合是采用如下条件选定：多篇报道印证>孤立报道；有ROC曲线>无ROC曲线；特异性达到100％时的敏感性≥14.3％。据此选择到miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214、miR-301b-5p等8个肺癌特异靶标小核酸。再选择稳定高表达常用于定量比对的miR-191为内参靶标。这样得到miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214、miR-301b-5p等9个小核酸。本发明从肺癌表达上调的小核酸中筛选肺癌相关靶标小核酸，且利用miRmine小核酸表达数据库查询，排除掉已知在普通人群血液中有高表达的小核酸，选择在普通人群血液中无表达或极低表达的小核酸。对于肺癌相关靶标而言，消除本底也即是把靶标特异性推进至100％，(1-特异性)是该靶标在非肺癌中出现几率，而敏感性是该靶标在肺癌中出现几率，在消除本底的同时，敏感性随之降低。通过组合多可消除本底的个特异靶标“并联”(即有其一存在即可，无需同时存在)的联合检测可以改善敏感性。理论上在靶标各自独立且特异性均为100％的前提下，通过7个敏感性平均达到14.3％的靶标的并联联合检测，即可以达到100％的特异性和敏感性，本发明对8个100％特异性和敏感性平均达到14.3％的靶标小核酸进行组合检测，不仅能达到100％敏感性，而且具有更大的冗余容错空间，还能同步根据分组进行药敏和预后评估，因此，大大提高了临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明技术方案的流程原理图。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，所述小核酸组合包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p。
在本发明中，miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944，主要在肺癌早期表达上调，预示可手术或化疗较敏感；miR-196a、miR-214、miR-301b-5p，主要在肺癌晚期表达上调，预示有转移浸润或放化疗较不敏感；miR-191为内参小核酸。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的探针组，所述小核酸包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p；
所述探针组包括主探针、通用辅探针和通用锚探针；
所述主探针从5’端至3’端顺次连接有通用辅探针结合区、小核酸结合区和通用锚探针结合区；
所述主探针包括第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针；
所述第一主探针的小核酸结合区能够和miR-191碱基互补结合；
所述第二主探针的小核酸结合区能够和miR-1244碱基互补结合；
所述第三主探针的小核酸结合区能够和miR-205碱基互补结合；
所述第四主探针的小核酸结合区能够和miR-205-3P碱基互补结合；
所述第五主探针的小核酸结合区能够和miR-3662碱基互补结合；
所述第六主探针的小核酸结合区能够和miR-944碱基互补结合；
所述第七主探针的小核酸结合区能够和miR-196a碱基互补结合；
所述第八主探针的小核酸结合区能够和miR-214碱基互补结合；
所述第九主探针的小核酸结合区能够和301b-5p碱基互补结合；
所述通用辅探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述通用锚探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，通用辅探针结合区、特异小核酸结合区、通用锚探针结合区，分别100％匹配结合通用辅探针、靶标小核酸、通用锚探针。
在本发明中，主探针3’末端碱基均为腺嘌呤，以与锚探针5’末端生物素标记引入的胸腺嘧啶匹配。在本发明中，所述第一主探针至所述第九主探针的核苷酸序列分别如SEQID NO.25～SEQ ID NO.33所示。
在本发明中，通用辅探针(GPC01)的序列具体为：TGCCATCACTGCAGCATCCGGACCTGCACCTGCTGTGCCTC(SEQ ID NO.1)。
在本发明中，通用锚探针(GAB01)序列具体为：ACGTCAGGGTCAGCTGGAGG(SEQ IDNO.2)，生物素标记于5’末端。
在本发明中，通用辅探针结合区序列较长，等于通用荧光探针互补序列加下述方案中通用上游引物互补序列；所述通用辅探针结合区序列具体为：GAGGCACAGCAGGTGCAGGTCCGGATGCTGCAGTGATGGCA(SEQ ID NO.14)；通用锚探针结合区的序列为：CCTCCAGCTGACCCTGACGT(SEQ ID NO.15)；通用锚探针序列与下述方案中通用下游引物相同，序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，特异小核酸结合区是可变特异区域，与相应的靶标小核酸序列完全互补。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的磁珠样本释放剂，包括上述方案所述的探针组和链霉亲和素磁珠；所述通用锚探针的5’末端标记有生物素。
在本发明中，所述磁珠样本释放剂以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针分别为70nM、630nM通用辅探针、630nM通用锚探针、60mM氯化锌、60mM乙酸钠、60mM半胱氨酸、18g/100ml碳酸亚乙酯、体积浓度为30％的甲酰胺、6g/100ml十二烷基硫酸钠和630μg/ml链霉亲和素磁珠。
在本发明中，乙酸钠、氯化锌、半胱氨酸、碳酸亚乙酯、甘油，提供合适的离子强度、pH值和核酸杂交条件；十二烷基硫酸钠、氯化锌、半胱氨酸提供样本裂解、蛋白质变性和RNase酶抑制作用；链霉亲和素磁珠特异吸附锚探针及其与主探针形成的双链。
本发明还提供了上述方案所述的探针组或者所述的磁珠样本释放剂在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于小核酸同管联合检测的试剂盒，包括上述方案所述的磁珠样本释放剂、洗涤剂、绿豆核酸酶液和PCR反应用试剂；
所述PCR反应用试剂包括引物组和荧光探针组，所述引物组包括通用上游引物和通用下游引物；
所述通用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：GAGGCACAGCAGGTGCAGG，所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：ACGTCAGGGTCAGCTGGAGG；
所述荧光探针组包括第一荧光探针、第二荧光探针、第三荧光探针、第四荧光探针、第五荧光探针、第六荧光探针、第七荧光探针、第八荧光探针和第九荧光探针；
所述第一荧光探针至第九荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ IDNO.13所示。
在本发明中，肺癌相关小核酸可分为预后较好和预后较差2组。预后较好组，统一采用5’FAM/3’BHQ1标记(FAM通道)：miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944，主要在肺癌早期表达上调，预示可手术或化疗较敏感；预后较差组，统一采用5’HEX/3’BHQ1标记(HEX通道)：miR-196a、miR-214、miR-301b-5p，主要在肺癌晚期表达上调，预示有转移浸润或放化疗较不敏感。另外，内参miR-191，采用5’CY5/3’BHQ3标记(CY5通道)。这样，每一组内虽然特异荧光探针序列各自对某一靶标小核酸特异，但使用相同荧光信号，可达到并联效果。
在本发明中，荧光探针组合中的各个序列由各靶标小核酸同源序列加辅探针5’端3～12个nt组成，使得Tm在66℃～68℃之间。
在本发明中，所述洗涤剂以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：10mM 3-吗啉丙磺酸、60mM半胱氨酸、60mM乙酸钠、体积浓度为30％的甲酰胺和体积浓度为0.1％的吐温20；所述水优选为纯化水。
在本发明中，所述绿豆核酸酶液中绿豆核酸酶的浓度优选为0.04U/μl。
在本发明中，所述绿豆核酸酶液以浓度为50mM的乙酸钠缓冲液为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：30mM氯化钠、1mM氯化锌和0.04U/μl绿豆核酸酶；所述乙酸钠缓冲液的pH值为5。
在本发明中，所述PCR反应用试剂优选的还包括热启动DNA聚合酶、dNTP和荧光定量PCR常规组分。在本发明中，所述PCR反应用试剂以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：50mM Tris-HCl、50mM KCl、0.05U/μl热启动DNA聚合酶、体积浓度为5％的甘油、0.2mMdNTP、2.5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、0.5μM通用上游引物和通用下游引物、第一荧光探针至第九荧光探针各0.2μM各个荧光探针和40nM ROX；所述Tris-HCl的pH值为8.8。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照；所述阳性对照优选的包括A549细胞培养液上清。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒由磁珠样本释放剂、洗涤液、绿豆核酸酶液、PCR反应用试剂和1×阳性对照组成；所述试剂盒的规格优选为8反应/包装，包含340μl1×磁珠样本释放剂、1.7ml 10×洗涤液、420μl 1×绿豆核酸酶液、260μl 1×PCR扩增用试剂和100μl阳性对照。其中，“×”指示组分中具体组成的浓度系数，1×可以直接使用，否则需调至1×。本发明的试剂盒用于从80～100μl血浆样本检测miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p。使用时，用户需向向10×洗涤液加入15.3ml纯化水。
本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的小核酸同管联合检测的方法，包括以下步骤：
1)将待测血浆和磁珠样本释放剂混合，得到第一混合液，对所述第一混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第一剩余物；
2)在所述第一剩余物中加入洗涤液，得到第二混合液，对所述第二混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第二剩余物；
3)在所述第二剩余物种加入绿豆核酸酶液，进行保温，得到第三混合液，对所述第三混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第三剩余物；
4)在所述第三剩余物中加入洗涤液，得到第四混合物，对所述第四混合物进行磁铁吸附或离心1min，吸去上清，得到第四剩余物；
5)在所述第四剩余物种加入PCR反应用试剂，进行荧光定量PCR反应，启用CY5、FAM和HEX荧光检测通道和ROX本底校准；
结果判断：
CY5通道Ct值<37，指示取样及操作合格；
FAM通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662和miR-944中的1个或多个小核酸有扩增；
HEX通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-196a、miR-214和miR-301b-5p中的1个或多个小核酸有扩增。
在本发明中，FAM-Ct<37、HEX-Ct无值，提示早期肺癌可能，预后较好。
本发明首先将待测血浆和磁珠样本释放剂混合，得到第一混合液，对所述第一混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第一剩余物；所述混合的温度优选为25～30℃；所述混合的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为1min。
在本发明中，所述待测血浆优选的由待测抗凝全血样本离心收集得到，所述待测抗凝全血样本和待测血浆的体积比优选为(180～220)：(80～100)，每180～200μl抗凝全血样本离心收集得到80～100μl血浆样本。
在本发明中，当用于80～100μl待测血浆样本检测时，所述磁珠样本释放剂的用量优选为40μl。
得到第一剩余物后，本发明在所述第一剩余物中加入洗涤液，得到第二混合液，对所述第二混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第二剩余物；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为1min。
得到第二剩余物后，本发明在所述第二剩余物种加入绿豆核酸酶液，进行保温，得到第三混合液，对所述第三混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第三剩余物；所述保温的温度优选为25～30℃；所述保温的时间优选为1min；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为1min。
在本发明中，当用于80～100μl待测血浆样本检测时，所述绿豆核酸酶液的用量优选为50μl。
得到第三剩余物后，本发明在所述第三剩余物中加入洗涤液，得到第四混合物，对所述第四混合物进行磁铁吸附或离心1min，吸去上清，得到第四剩余物；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为1min。
在本发明中，当用于80～100μl待测血浆样本检测时，所述洗涤剂的用量优选为1ml/次。
得到第四剩余物后，本发明在所述第四剩余物种加入PCR反应用试剂，进行荧光定量PCR反应，启用CY5、FAM和HEX荧光检测通道和ROX本底校准；所述荧光定量PCR反应优选的于PCR热循环仪上进行；在本发明中，所述荧光定量PCR反应程序优选为：95℃10分钟，再40个循环的93℃10秒、65℃40秒，荧光信号采集在65℃。
在本发明中，当用于80～100μl待测血浆样本检测时，所述PCR反应用试剂的用量优选为30μl。
在本发明中，CY5、FAM、HEX等3个荧光检测通道，并开启ROX本底校准。结果判断：CY5通道Ct值(CY5-Ct)<37，指示取样及操作合格；FAM或/和HEX通道Ct值(FAM-Ct或/和HEX-Ct)<37，指示阳性，代表肺癌相关小核酸有扩增；其中，若FAM-Ct<37、HEX-Ct无值，提示早期肺癌可能，预后较好。
本发明基于探针锚定双链扩增(Probe-Anchored and Double-StrandedAmplification，PADSA)，使用包含主探针、通用辅探针、通用锚探针和链霉亲和素磁珠的磁珠样本释放剂与样本混合保温，主探针可以同时杂交结合通用辅探针、通用锚探针和靶标小核酸，形成完整双链，并通过通用锚探针5’末端的生物素标记结合于链霉亲和素磁珠上，在吸去上清并洗涤后，样本中过量的非靶标核酸被洗去，再加入绿豆核酸酶体系进行单链特异酶切反应，没有结合靶标小核酸的主探针处于单链或部分单链状态而被降解，已捕获靶标小核酸的主探针在双链中保持完整，再次洗涤之后，加入PCR扩增用试剂，进行热变性和PCR扩增反应，阳性扩增结果指示至少存在1个靶标小核酸。本发明利用探针锚定，通过洗涤和酶切去除包括rRNA、mRNA、非编码核酸和其它小核酸在内的各种非靶标核酸，不需要提取外泌体。
本发明利用探针锚定双链扩增(PADSA)和3个荧光通道对8个肺癌上调表达的小核酸和1个内参小核酸进行同管联合扩增检测，提供了一种不需要提取外泌体，抗干扰、操作简单、重复性好的9个小核酸同管联合扩增检测方法及试剂盒，针对性地解决了小核酸联合扩增检测方法受限于外泌体提取和干扰、异常与正常差异较小、一致性较差、难以实现多靶标同管扩增检测等问题。实验验证表明本发明通过数据库筛选并将所使用样本体积限制在不超过100μl，能使得8个肺癌上调表达的小核酸在健康志愿者无扩增，达到0本底，便于用户通过Ct值判断分辨正常与异常，有利于检测应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明技术方案的流程原理图参见图1。在样本裂解杂交捕获之后，主探针结合锚探针、辅探针及靶标小核酸A形成完整双链，不被绿豆核酸酶酶切，仍能保持完整进行荧光定量PCR扩增，而没有杂交结合靶标小核酸的主探针只能形成部分双链，可被绿豆核酸酶酶切破坏而不能进行荧光定量PCR扩增；有Ct值，指示阳性(+)，即靶标小核酸存在于样本中；No Ct，指示阴性(-)，即靶标小核酸没有存在或拷贝数过低。P-T-A:主探针，P：辅探针结合区，T：靶标小核酸结合区，A：锚探针结合区，U：辅探针，M:靶标小核酸，B：锚探针。
主探针共有9个(第一主探针～第九主探针)，序列组成中间为特异小核酸结合区，两端为通用序列，分别是通用辅探针结合区和通用锚探针结合区。特异小核酸结合区是可变特异区域，与相应的靶标小核酸序列完全互补，具体序列信息见序列表。主探针3’末端碱基均为腺嘌呤，以与锚探针5’末端生物素标记引入的胸腺嘧啶匹配。通用辅探针结合区序列等于通用荧光探针互补序列加通用上游引物互补序列。通用锚探针序列与通用下游引物相同。通用辅探针(GPC01)和通用锚探针(GAB01)的具体序列信息见序列表1。
磁珠样本释放剂组成为：70nM各个主探针(1～9)、630nM通用辅探针、630nM通用锚探针、60mM氯化锌、60mM乙酸钠、60mM半胱氨酸、18％(w/v)碳酸亚乙酯、30％(v/v)甲酰胺、6％(w/v)十二烷基硫酸钠、630μg/ml链霉亲和素磁珠。当用于80～100μl血浆样本检测时，用量为40μl。
洗涤液组成为：10mM 3-吗啉丙磺酸、60mM半胱氨酸、60mM乙酸钠、30％(v/v)甲酰胺、0.1％(v/v)吐温20，当用于80～100μl血浆样本检测时，用量为1ml/次。
绿豆核酸酶液组成为：pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mM氯化钠、1mM氯化锌、0.04U/μl绿豆核酸酶，当用于80～100μl血浆样本检测时，用量为50μl。
PCR扩增用试剂的体系组成是：50mM Tris-HCl pH8.8、50mM KCl、0.05U/μl热启动DNA聚合酶、5％(v/v)甘油、0.2mM dNTP、2.5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、0.5μM通用上游引物和通用下游引物、0.2μM各个荧光探针(FP0191、1244、0205、205*、3662、0944、196a、0214、301b*)、40nM ROX，当用于80～100μl血浆样本检测时，用量为30μl。
通用上游引物(GPF01)和通用下游引物(GPF02)的序列分别为：GAGGCACAGCAGGTGCAGG(SEQ ID NO.3)，ACGTCAGGGTCAGCTGGAGG(SEQ ID NO.4)。
PCR反应程序为：95℃10分钟，再40个循环的93℃10秒、65℃40秒，荧光信号采集在65℃。
基于本发明的9个小核酸同管联合扩增检测试剂盒，由磁珠样本释放剂、洗涤液、绿豆核酸酶液、PCR扩增用试剂和1×阳性对照组成，各组分的具体组成同上文所述。该试剂盒常规规格为8反应/包装，包含340μl 1×磁珠样本释放剂、1.7ml 10×洗涤液、420μl 1×绿豆核酸酶液、260μl 1×PCR扩增用试剂、100μl阳性对照。其中，“×”指示组分中具体组成的浓度系数，1×可以直接使用，否则需调至1×。该试剂盒用于从80～100μl血浆样本检测上文所述9个小核酸。使用时，用户需向向10×洗涤液加入15.3ml纯化水。1×阳性对照为100μl蛋白质浓度为5mg/ml的A549细胞培养液上清。其余组分具体组成及检测操作与前文相同。
涉及的序列表如表1所示：
表1
Figure BDA0003931221270000091
Figure BDA0003931221270000101
Figure BDA0003931221270000111
试验例1本发明体系建立与探针用量优化
本发明体系中绿豆核酸酶用量是关键控制点。探针在杂交体系中浓度达到20nM能保证杂交成功，因此，把9个主探针在体系中的工作浓度定为各20nM。辅探针和锚探针的量需保持足够结合所有的主探针，浓度为主探针×9，即180nM，链霉亲和素磁珠的吸附容量保持与锚探针用量相当，140μl体系中用量25.2μg。绿豆核酸酶活性很强，根据其酶活定义，1U足以在50μl体系中1分钟消化产生约3nmol的核苷酸，也即能完全降解0.03nmol的长度为100nt的单链寡核苷酸，相当于140μl体系中9个靶标小核酸主探针各23.8nM，但酶量不仅需保证充分降解没有捕获靶标小核酸的主探针，并需预留充足空间以排除样本中少量非靶标核酸残留干扰，具体用量需经优化确定。利用无模板(纯化水，NTC)、高非特异核酸(107大肠杆菌，FTCG)、饱和非特异核酸(108大肠杆菌，FTCB)、阳性对照(104A549细胞，PC104)等4种模式样本进行实验测试优化绿豆核酸酶用量，50μl体系中酶量(U)分别为：1.0、1.5、2.0、2.5。每个反应进行3次重复。其余体系和操作方法按前文所述。结果显示，当绿豆核酸酶用量达到2.0U时，阴性对照NTC、FTCG、FTCB均为无扩增(No Ct)，同时，阳性对照PC104能保持稳定扩增，因此，本发明选择2.0U/50μl的用量。具体数据见下表2所示。
表2本发明体系绿豆核酸酶用量优化测试
Figure BDA0003931221270000121
Figure BDA0003931221270000131
注：NTC为纯化水阴性对照。Ct1-Ct3，为3次平行实验结果。
试验例2利用肺癌A549细胞检验本发明方法分组检测的可行性和灵敏度
取新鲜收获的A549细胞并以PBS缓冲液将细胞浓度调整至106/ml，取100μl细胞悬浮液，以PBS缓冲液连续进行10倍梯度稀释，得到浓度分别为105/ml、104/ml、103/ml、102/ml、101/ml的细胞悬浮液样本各900～1000μl，分别记为PC104、PC103、PC102、PC101、PC100。各取样100μl，每样本3个重复，应用本发明方法进行上述9个小核酸同管联合扩增检测，体系和操作方法按前文所述。结果显示，当样本细胞数为10个或更多时，3个通道都能给出稳定的扩增结果：同一通道Ct值与细胞数呈现相反关系，同性质样本同通道Ct值差异较小；同时，同性质样本在不同通道Ct值呈现FAM>HEX>CY5，指示在A549细胞中，预后较好组表达弱于预后较差组更弱于内参miR-191；当样本细胞数为1个时，预后较好组(FAM通道)和预后较差组(HEX通道)已不能得到或不能稳定得到Ct值；样本细胞数为10个时，是所有3个通道能得到稳定扩增Ct值的最低数量，显示本发明方法以A549细胞数衡量的检测灵敏度为10个细胞，对应的Ct值接近37。具体数据如下表所示(表3)：
表3本发明方法(PADSA)A549细胞检测灵敏度测试
Figure BDA0003931221270000132
注：NTC为纯化水阴性对照。Ct1-Ct3，为3次平行实验结果。
试验例3利用A549细胞培养液上清检验本发明对游离小核酸的检测
将A549细胞在生长密度接近100％的条件下连续培养3天，收集培养液，以5000rpm4℃离心10min取上清，取样以考马斯亮蓝G250吸光度法测定蛋白质浓度，以PBS将培养液上清调至5mg/ml，共得到12ml；然后分为2份，6ml/份，其中1份，以100μl/份分装得到A549培养液上清样本，记为S0105；另一份在贝克曼OptimaL-80XP超速离心机100000g 21℃离心60min，弃上清，以1ml PBS重悬后，以100μl/份分装得到A549外泌体样本，记为E0105。分别取样，利用本发明方法进行前述9个靶标小核酸组合的同管联合检测，各进行3个重复。体系和操作方法按前文所述。结果显示，从培养液上清和外泌体都能得到有效扩增，一致性较好，因此，外泌体提取并非必须。具体数据如下表所示(表4)：
表4本发明方法(PADSA)检测A549细胞培养液上清和外泌体
Figure BDA0003931221270000141
注：NTC为纯化水阴性对照。APC为104A549阳性对照。Ct1-Ct3，为3次平行实验结果。
试验例4利用健康志愿者血液样本检验确定本发明血浆方法取样体积
收集了20例健康志愿者肝素钠抗凝全血样本各5ml，分别按800μl、400μl、200μl各分装3管，以5000rpm 4℃离心5min后，分别吸取400μl、200μl、100μl血浆上清转移至含有40μl磁珠样本释放剂的管中，以前述体系和检测操作进行，结果显示：当血浆取样体积为400μl时，所有样本CY5通道都有显著稳定扩增(CY5-Ct：20.52～23.29)，有5例样本FAM和HEX通道也有本底扩增呈现(FAM-Ct：36.78～38.45，HEX-Ct：35.66～37.33)；当血浆取样体积为200μl时，所有样本CY5通道都有显著稳定扩增(CY5-Ct：21.72～24.50)，有2例样本FAM和HEX通道也有本底扩增呈现(FAM-Ct：37.94～39.77，HEX-Ct：37.25～38.93)；当血浆取样体积为100μl时，CY5通道仍能保持有稳定扩增(CY5-Ct：23.84～26.38)，FAM和HEX通道均无扩增(No Ct)。因此，本发明血浆取样体积定在100μl。
试验例5利用肺癌志愿者血液样本检验本发明方法的肺癌检测敏感性
收集了20例早期肺癌患者术后各300μl血常规剩余抗凝全血样本，以5000rpm 4℃离心3min后，分别吸取约100μl上清，转移至含有40μl磁珠样本释放剂的管中，每例3管，按前述操作进行检测，结果显示：20例肺癌患者CY5通道均有显著扩增(CY5-Ct：24.07～27.55)，指示取样及检测操作均为合格；所有患者FAM通道也均有显著扩增(FAM-Ct：28.91～36.56)，显示以本发明方法对20例早期肺癌检测敏感性达到100％；同时，有4例患者HEX通道也有显著扩增(HEX-Ct：30.88～36.10)，提示这4例患者应该密切关注后续治疗。
实施例1：本发明试剂盒的配制生产
以按该试剂盒常规规格8反应/包装生产95套为例。按通常95％的得率计划量100套，各组分及所需量见下表5，进行物料准备(表6)，按说明书正文试剂盒配方配制分装。
表5 100套计划量组分表
编号 组分 规格 100套计划量 备注
PADC91 1×磁珠样本释放剂 340μl 34ml
PADC92 10×洗涤液 1.7ml 170ml
PADC93 1×绿豆核酸酶液 420μl 42ml
PADC94 1×PCR扩增用试剂 260μl 26ml
PADC95 1×阳性对照 100μl 10ml
表6物料清单
Figure BDA0003931221270000151
Figure BDA0003931221270000161
Figure BDA0003931221270000171
实施例2：本发明试剂盒的质检
按下表7准备质检用参考品
表7本发明试剂盒的参考品
Figure BDA0003931221270000172
Figure BDA0003931221270000181
然后，从按实施例1生产的试剂盒抽取7个，按本发明说明书正文方法进行检测操作，样本及检测Ct值范围如下表8：
表8本发明试剂盒质检
样本 数量 CY5-Ct FAM-Ct HEX-Ct
阴性参考品 10 100％<37 0％<37 0％<37
阳性参考品 10 100％<37 100％<37 100％<37
检测限 20 95％<37 95％<37 95％<37
重复性 10 100％<37 0％<37 0％<37
NTC 3 0％<37 0％<37 0％<37
PC 3 100％<37 100％<37 100％<37
注：NTC，无模板对照；PC，阳性对照。“No Ct”归入>37。
实施例3：应用本发明试剂盒检测体检血常规剩余抗凝全血
体检血常规通常以EDTA抗凝采集静脉血约2ml，但是用量一般不超过1ml，超过血液标本一半的剩余血常温暂存，待化验结果报告后作为医学废物处理掉。从已在常温暂存约2小时待废弃处理的剩余血中分别吸取300μl上清存入1.5ml离心管中，共30例；以4℃5000rpm离心3分钟后，将上清按95μl/管分装冻存；再每例抽取1管，使用本发明试剂盒按本发明说明书正文方法进行检测操作，结果显示，30例样本CY5-Ct值范围处于24.82～30.17之间，均符合本发明Ct<37属于有效扩增的定义，可判定为合格。30例样本FAM-Ct和HEX-Ct均为No Ct，属于无扩增，判断为阴性结果。
实施例4：肺癌患者手术后复查检测
取10名早期肺癌患者手术出院一个月后复查血常规剩余血浆各100μl于1.5ml离心管中，使用实施例1试剂盒，按本发明说明书正文描述进行检测操作，结果显示，10例样本CY5-Ct值范围处于24.06～27.91之间，符合本发明Ct<37属于有效扩增的定义，可判定为合格。10例样本FAM-Ct和HEX-Ct均为No Ct，属于无扩增，判断为阴性结果。
实施例5：肺癌用药敏感性及疗效评估检测研究
CT测量肿瘤病灶大小变化是肺癌疗效评估的常规方法，但周期通常需要3个月时间，且存在假性进展现象。多维度的辅助手段尤其是液体活检有望用于肺癌用药敏感性及疗效评估的增强补充。选取顺铂化疗疗程中的肺癌患者10例，收集血常规剩余血浆100μl进行检测研究，使用实施例1试剂盒，按本发明说明书正文描述进行检测操作，取样及检测结果如下表9所示：
表9取样及检测结果
Figure BDA0003931221270000182
Figure BDA0003931221270000191
由表中结果可见，10名肺癌患者的HEX通道检测结果均为阳性，提示化疗效果可能不会尽如人意。具体化疗效果尚有待继续观察。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.小核酸组合作为生物标志物在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用，所述小核酸组合包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p。
2.一种用于小核酸同管联合检测的探针组，其特征在于，所述小核酸包括miR-191、miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662、miR-944、miR-196a、miR-214和301b-5p；
所述探针组包括主探针、通用辅探针和通用锚探针；
所述主探针从5’端至3’端顺次连接有通用辅探针结合区、小核酸结合区和通用锚探针结合区；
所述主探针包括第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针；
所述第一主探针的小核酸结合区能够和miR-191碱基互补结合；
所述第二主探针的小核酸结合区能够和miR-1244碱基互补结合；
所述第三主探针的小核酸结合区能够和miR-205碱基互补结合；
所述第四主探针的小核酸结合区能够和miR-205-3P碱基互补结合；
所述第五主探针的小核酸结合区能够和miR-3662碱基互补结合；
所述第六主探针的小核酸结合区能够和miR-944碱基互补结合；
所述第七主探针的小核酸结合区能够和miR-196a碱基互补结合；
所述第八主探针的小核酸结合区能够和miR-214碱基互补结合；
所述第九主探针的小核酸结合区能够和301b-5p碱基互补结合；
所述通用辅探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述通用锚探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种用于小核酸同管联合检测的磁珠样本释放剂，其特征在于，包括权利要求2所述的探针组和链霉亲和素磁珠；所述通用锚探针的5’末端标记有生物素。
4.根据权利要求3所述的磁珠样本释放剂，其特征在于，所述磁珠样本释放剂以水为溶剂，包括以下浓度的组分：第一主探针、第二主探针、第三主探针、第四主探针、第五主探针、第六主探针、第七主探针、第八主探针和第九主探针分别为70nM、630nM通用辅探针、630nM通用锚探针、60mM氯化锌、60mM乙酸钠、60mM半胱氨酸、18g/100ml碳酸亚乙酯、体积浓度为30％的甲酰胺、6g/100ml十二烷基硫酸钠和630μg/ml链霉亲和素磁珠。
5.权利要求2所述的探针组或者权利要求3或4所述的磁珠样本释放剂在制备诊断肺癌和/或评估肺癌预后的试剂或者试剂盒中的应用。
6.一种用于小核酸同管联合检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4所述的磁珠样本释放剂、洗涤剂、绿豆核酸酶液和PCR反应用试剂；
所述PCR反应用试剂包括引物组和荧光探针组，所述引物组包括通用上游引物和通用下游引物；
所述通用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述荧光探针组包括第一荧光探针、第二荧光探针、第三荧光探针、第四荧光探针、第五荧光探针、第六荧光探针、第七荧光探针、第八荧光探针和第九荧光探针；
所述第一荧光探针至第九荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.13所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM 3-吗啉丙磺酸、60mM半胱氨酸、60mM乙酸钠、体积浓度为30％的甲酰胺和体积浓度为0.1％的吐温20。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述绿豆核酸酶液中绿豆核酸酶的浓度为0.04U/μl。
9.根据权利要求6或8所述的试剂盒，其特征在于，所述绿豆核酸酶液以浓度为50mM的乙酸钠缓冲液为溶剂，包括以下浓度的组分：30mM氯化钠、1mM氯化锌和0.04U/μl绿豆核酸酶；所述乙酸钠缓冲液的pH值为5。
10.一种基于权利要求6～9任意一项所述的试剂盒的非诊断目的的小核酸同管联合检测的方法，包括以下步骤：
1)将待测血浆和磁珠样本释放剂混合，得到第一混合液，对所述第一混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第一剩余物；
2)在所述第一剩余物中加入洗涤液，得到第二混合液，对所述第二混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第二剩余物；
3)在所述第二剩余物种加入绿豆核酸酶液，进行保温，得到第三混合液，对所述第三混合液进行磁铁吸附或离心，吸去上清，得到第三剩余物；
4)在所述第三剩余物中加入洗涤液，得到第四混合物，对所述第四混合物进行磁铁吸附或离心1min，吸去上清，得到第四剩余物；
5)在所述第四剩余物种加入PCR反应用试剂，进行荧光定量PCR反应，启用CY5、FAM和HEX荧光检测通道和ROX本底校准；
结果判断：
CY5通道Ct值<37，指示取样及操作合格；
FAM通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-1244、miR-205、miR-205-3P、miR-3662和miR-944中的1个或多个小核酸有扩增；
HEX通道Ct值<37，指示阳性，代表miR-196a、miR-214和miR-301b-5p中的1个或多个小核酸有扩增。
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