CN108130362A - 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于EGFR基因突变检测的试剂盒及应用，属生物技术和医学领域。与现有技术相比，本发明所提供的引物、探针和扩增体系的试剂盒检测灵敏度高，可检测突变含量低至0.1％的标本；检测准确率高，采用双控检测体系和锁核酸技术，保证检测结果的可靠性；仅需8个反应，包括EGFR质控反应液、L858R检测反应液、19del检测反应液、G719X检测反应液、L861Q检测反应液、3Ins20检测反应液、T790M检测反应液和S768I检测反应液，即可用于检测非小细胞肺癌患者的血清或血浆、组织样本中EGFR基因的29种常见突变型。

Description

用于EGFR基因突变检测的试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及的是一种用于EGFR基因突变 检测的试剂盒及应用，包括EGFR基因突变检测的试剂盒及其引物、探针和扩增 体系。
背景技术
目前，肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万， 严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约(NSCLC)占80％，且就诊 时80％己失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。 IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10％-20％，中位生存时间仅10-12月。因 此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶 向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。
人类表皮生长因子受体(epidermal growth faCtor receptor，EGFR)是目前治疗最重要的分子靶点，其是原癌基因C-erbB-1(Her-1)的表达产物。该基因位于 人类7号染色体短臂7p12～14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨 酸激酶(TKI)家族，存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞。EGFR可以激 活酪氨酸激酶，从而调控下游信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、 黏附和细胞损伤修复等一系列过程，在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。因此， EGFR成为肿瘤靶向治疗研究的一个重要靶点。
目前，EGFR的靶向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制(EGFR-TKI)和单 克隆抗体两种机制。其中，基于EGFR-TKI机制的吉非替尼(Gefitinib，商品名 易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)，是目前肿瘤患者最有效的靶向药 物，但这些靶向药物并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。 临床研究结果表明，吉非替尼对EGFR外显子18、19或21发生突变的患者， 有效率可达80％，而对野生型患者基本无效。目前已发现至少30种突变 EGFR-TKI药物反应性有关，主要是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变。此外，研究表明部分EGFR-TKI类药物初始治疗有效的患者在后 期会发生耐药反应，这与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50％的 EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。
EGFR基因的酪氨酸激酶区存在多种突变，其中29种为常见突变(见表 1)，主要集中在外显子18-21上，其中约90％存在于外显子19和21上，包括外 显子19上747-750位氨基酸之间的19种常见缺失突变约占突变的45％；外显 子21上的L858点突变约占突变的40％-45％，这些位点也是中国人EGFR基因 的热点突变。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一 起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要 较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临 床需要。特异性探针法如以Scorpions ARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx 的EGFR检测试剂盒虽然检测灵敏度高，但其检测费用较高，不适合国内NSCLC 患者的常规检测和筛查，因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、 灵敏度高的检测EGFR基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断的时效性 要求。
突变扩增阻滞系统(amplification refraCtory mutation system，ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突 变分析的PCR技术。其依据的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外 切酶活性，因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸， 当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，扩增反应终 止。
锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种经过修饰的RNA，LNA中一 部分核糖上的2'与4'碳连结在一起，形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥， 降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。LNA寡核苷酸 与普通寡核苷酸相比具有以下优点：引入一个LNA碱基可对DNA探针的TM 值提高2-5℃、对RNA探针TM值提高3-8℃，可以大大缩短探针的长度，从而 大大增加探针的灵敏度及稳定性，可使降低探针背景荧光、增加信噪比。
综上，目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法，这两 种方法均存在一定的缺陷。测序法灵敏度较低约20％，且操作复杂，检测时间 较长，假阴性率较高。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于肿瘤组织 样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血液样本，如血浆或者血液中的 循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1％，ARMS-PCR方法灵敏度不足以 对血液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药 过程中可能会产生耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此，从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种快速、便捷、高灵敏 度的检测方法。
发明内容
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明目的在于提供一种高灵敏度EGFR基因突变检测的试剂盒。
在本发明的一方面，提供一种EGFR基因突变检测的引物和探针，其引物与 探针包括如下序列：
表1 EGFR突变基因引物和探针序列
本发明另一方面提供一种用于EGFR基因突变检测的试剂盒，所述的试剂盒 包括：PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照。引物 探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针，质控基因和内控检测引物探针， 突变和质控探针标记FAM荧光素，内控标记HEX荧光素，质控及内控均作为结 果判读的一部分，质控基因选择是人类EGFR基因相对保守的区段，内控选择 的是人β-aCtin保守基因，双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR 反应过程。
表2试剂盒组成
管号 试剂 组分 规格 数量
1 PCR反应液 5×PCR buffer(Mg2+Plus)、dN(U)TPs 192ul 1支
2 酶系1 Hitaq、UNG 24ul 1支
3 EC/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
4 G719X/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
5 19del/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
6 T790M/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
7 S768I/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
8 3Ins20/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
9 L861Q/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
10 L858R/IC引物探针 引物、探针和水 24ul 1支
11 阳性对照 含有上述目的基因片段的质粒菌 200ul 1支
12 阴性对照 DEPC-H2O 500ul 1支
13 说明书 1份 1份
本发明另一方面提供一种用于EGFR基因突变检测的PCR反应扩增体系如 下：
19del扩增体系：
18/20/21扩增体系
本发明再一方面，提供一种EGFR基因突变检测的方法(仅用于科研领域)，所 述方法包括以下步骤：
1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取：推荐使用Sigma公司的GenEluteTM Plasma/Serum Cell- FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取：推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (货号：56404)
2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制，PCR反应液16ul，酶系1 2ul、引物探针混合液2ul，模板DNA5ul，阴性对照和质控视为样本，作相同处 理。
3)结果判读：
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探 针进行PCR检测，突变和质控由FAM指示，内控由HEX信号指示，通过计算ΔCt 的大小进行判断，反应管的ΔCt值＜ΔCt Cut-off值时，则样品为该反应管 对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
ΔCt值＝突变样本Ct值-质控Ct值
表3 CutoffΔCt值
检测靶点 CutoffΔCt值
G719X 10
19del 10
T790M 8
S768I 12
3Ins20 8
L861Q 12
L858R 10
综上所述，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速、便 捷、高灵敏度的检测非小细胞肺癌患者的EGFR基因突变检测引物探针、试剂 盒及其检测方法，本发明的另一目的是提供一种用于EGFR基因突变检测的反 应体系。
本发明公开了一种快速、便捷、灵敏度高的非小细胞肺癌患者EGFR基因 突变检测的试剂盒。本试剂盒以血浆DNA为检测样本，通过检测EGFR基因突 变，可用于检测非小细胞肺癌患者的血清或血浆、组织样本中EGFR基因的29 种常见突变型，与现有技术相比，本发明的优点：(1)高灵敏度：可在100ng 野生型人类基因组背景下检测出1％微量突变模板，减少了假阴性结果的出现； (2)全封闭反应，避免假阳性结果的发生；(3)双控反应体系，质控及内源 对照，有效检测PCR扩增及核酸提取；(4)正对19del设计LNA寡核苷酸探针， 有效封闭野生型，提高检测灵敏度，确保检测结果的可靠性，可以满足临床快 速检测的实际需求。
附图说明
图1为G719X灵敏度结果
图2为19del灵敏度结果
图3为T790M灵敏度结果
图4为S768I灵敏度结果
图5为3Ins20灵敏度结果
图6为L861Q灵敏度结果
图7为L858R灵敏度结果
图8为临床阳性样本用G790X检测结果
图9为临床阳性样本用19del检测结果
图10为临床阳性样本用T790M检测结果
图11为临床阳性样本用S768I检测结果
图12为临床阳性样本用3Ins20检测结果
图13为临床阳性样本用L861Q检测结果
图14为临床阳性样本用L858R检测结果
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围 不限于下述的实施例。
实施例1
利用本发明实时荧光PCR检测EGFR 29种基因突变的方法包括如下步骤：
(1)核酸提取
以石蜡包埋组织为例，按照推荐的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit说明书进 行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。
(2)PCR反应体系的配制(25ul)
试剂名称 加入量
PCR反应液 16ul
酶系1 2ul
引物探针混合液 2ul
模板DNA 5ul
所述的模板DNA包含样本DNA和阴性、阳性对照DNA。
(3)PCR扩增
实时PCR扩增条件为：50℃2min，1个循环；95℃5min；95℃10s，55℃ 15s,72℃30s，5个循环；95℃10s，60℃45s(收集FAM和HEX荧光信号)， 40个循环。
(4)结果判定
1)检测结果除阴性对照外，突变反应管的内控信号HEX应有扩增曲线， 且Ct≤33；若Ct＞33，则提示样本DNA模板量偏低或存在PCR抑制剂，需重新 提取或者增加PCR模板量再做，但是如果管内FAM有信号，可能是由于突变的 扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。
2)质控管FAM信号Ct＜21，提示样品加入量过高，需减少样本加入量再 实验；质控管FAM信号Ct＞26或阴性，提示该样本加入量过低或提取失败， 需要增加样本量再实验或重新提取。
3)质控管FAM信号21≤Ct≤26
A：ARMS引物管Ct＜30，样本结果判读为阳性。
B：ARMS引物管＞阴性临界值或无扩增曲线，样本结果判读为阴性。
C：相应ARMS引物管30≤Ct值＜阴性临界值(如下表)，且其与质控管 FAM信号的ΔCt≤△Ct Cut-off值，该样本结果判读为阳性；反之则判读为阴 性。
实施例2
利用本发明检测EGFR基因突变阳性患者石蜡包埋组织样本10例，并与测 序结果进行对照，结果：检测出19del阳性4例，L858R阳性5例，T790M阳 性1例，与测序法符合率100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (5)

1.用于EGFR基因突变检测的引物、探针，其特征在于，包含如下序列：
2.用于EGFR基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的用于EGFR基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括EGFR PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
4.根据权利要求2或3任意所述的用于EGFR基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的EGFR基因突变的检测。
5.用于EGFR基因突变检测的PCR反应扩增体系，其特征在于，包括：19del扩增体系：
18/20/21扩增体系
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