CN108130362A - 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于EGFR基因突变检测的试剂盒及应用,属生物技术和医学领域。与现有技术相比,本发明所提供的引物、探针和扩增体系的试剂盒检测灵敏度高,可检测突变含量低至0.1%的标本;检测准确率高,采用双控检测体系和锁核酸技术,保证检测结果的可靠性;仅需8个反应,包括EGFR质控反应液、L858R检测反应液、19del检测反应液、G719X检测反应液、L861Q检测反应液、3Ins20检测反应液、T790M检测反应液和S768I检测反应液,即可用于检测非小细胞肺癌患者的血清或血浆、组织样本中EGFR基因的29种常见突变型。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域,尤其涉及的是一种用于EGFR基因突变 检测的试剂盒及应用,包括EGFR基因突变检测的试剂盒及其引物、探针和扩增 体系。
背景技术
目前,肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因,全球每年新发病例150万, 严重威胁人类健康。在肺癌患者中,非小细胞肺癌约(NSCLC)占80%,且就诊 时80%己失去手术或放射治疗最佳机会,致使其长期生存率低,疗效令人堪忧。 IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10%-20%,中位生存时间仅10-12月。因 此,人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率,其中以分子靶 向治疗为代表的新治疗方法,为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。
人类表皮生长因子受体(epidermal growth faCtor receptor,EGFR)是目前治疗最重要的分子靶点,其是原癌基因C-erbB-1(Her-1)的表达产物。该基因位于 人类7号染色体短臂7p12~14区,由28个外显子组成,该蛋白属于受体酪氨 酸激酶(TKI)家族,存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞。EGFR可以激 活酪氨酸激酶,从而调控下游信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、 黏附和细胞损伤修复等一系列过程,在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。因此, EGFR成为肿瘤靶向治疗研究的一个重要靶点。
目前,EGFR的靶向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制(EGFR-TKI)和单 克隆抗体两种机制。其中,基于EGFR-TKI机制的吉非替尼(Gefitinib,商品名 易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib,商品名特罗凯),是目前肿瘤患者最有效的靶向药 物,但这些靶向药物并非对所有患者有效,EGFR敏感突变是药物有效的前提。 临床研究结果表明,吉非替尼对EGFR外显子18、19或21发生突变的患者, 有效率可达80%,而对野生型患者基本无效。目前已发现至少30种突变 EGFR-TKI药物反应性有关,主要是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变。此外,研究表明部分EGFR-TKI类药物初始治疗有效的患者在后 期会发生耐药反应,这与EGFR20号外显子的突变密切相关,其中50%的 EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。
EGFR基因的酪氨酸激酶区存在多种突变,其中29种为常见突变(见表 1),主要集中在外显子18-21上,其中约90%存在于外显子19和21上,包括外 显子19上747-750位氨基酸之间的19种常见缺失突变约占突变的45%;外显 子21上的L858点突变约占突变的40%-45%,这些位点也是中国人EGFR基因 的热点突变。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变,突变细胞往往与野生型细胞混杂在一 起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA,所以对体细胞突变检测需要 较高的特异性,而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限,不能完全满足临 床需要。特异性探针法如以Scorpions ARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx 的EGFR检测试剂盒虽然检测灵敏度高,但其检测费用较高,不适合国内NSCLC 患者的常规检测和筛查,因此,临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、 灵敏度高的检测EGFR基因突变的试剂盒,满足临床用药和检测诊断的时效性 要求。
突变扩增阻滞系统(amplification refraCtory mutation system,ARMS)也叫等位基因特异性PCR,该法是在PCR基础上发展而成的,是一种直接用于点突 变分析的PCR技术。其依据的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外 切酶活性,因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸, 当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时,扩增反应终 止。
锁核酸(Locked nucleic acid,LNA)是一种经过修饰的RNA,LNA中一 部分核糖上的2'与4'碳连结在一起,形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥, 降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。LNA寡核苷酸 与普通寡核苷酸相比具有以下优点:引入一个LNA碱基可对DNA探针的TM 值提高2-5℃、对RNA探针TM值提高3-8℃,可以大大缩短探针的长度,从而 大大增加探针的灵敏度及稳定性,可使降低探针背景荧光、增加信噪比。
综上,目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法,这两 种方法均存在一定的缺陷。测序法灵敏度较低约20%,且操作复杂,检测时间 较长,假阴性率较高。ARMS-PCR方法能够达到1%的灵敏度,对于肿瘤组织 样本能够满足检测需求,但是对于取样方便的血液样本,如血浆或者血液中的 循环肿瘤细胞,肿瘤DNA含量往往低于1%,ARMS-PCR方法灵敏度不足以 对血液进行检测,局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外,在临床用药 过程中可能会产生耐药性突变,以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此,从这些低含量样本中检测突变的基因,需要找一种快速、便捷、高灵敏 度的检测方法。
发明内容
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明目的在于提供一种高灵敏度EGFR基因突变检测的试剂盒。
在本发明的一方面,提供一种EGFR基因突变检测的引物和探针,其引物与 探针包括如下序列:
表1 EGFR突变基因引物和探针序列
本发明另一方面提供一种用于EGFR基因突变检测的试剂盒,所述的试剂盒 包括:PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照。引物 探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针,质控基因和内控检测引物探针, 突变和质控探针标记FAM荧光素,内控标记HEX荧光素,质控及内控均作为结 果判读的一部分,质控基因选择是人类EGFR基因相对保守的区段,内控选择 的是人β-aCtin保守基因,双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR 反应过程。
表2试剂盒组成
管号 | 试剂 | 组分 | 规格 | 数量 |
1 | PCR反应液 | 5×PCR buffer(Mg2+Plus)、dN(U)TPs | 192ul | 1支 |
2 | 酶系1 | Hitaq、UNG | 24ul | 1支 |
3 | EC/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
4 | G719X/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
5 | 19del/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
6 | T790M/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
7 | S768I/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
8 | 3Ins20/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
9 | L861Q/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
10 | L858R/IC引物探针 | 引物、探针和水 | 24ul | 1支 |
11 | 阳性对照 | 含有上述目的基因片段的质粒菌 | 200ul | 1支 |
12 | 阴性对照 | DEPC-H2O | 500ul | 1支 |
13 | 说明书 | 1份 | 1份 |
本发明另一方面提供一种用于EGFR基因突变检测的PCR反应扩增体系如 下:
19del扩增体系:
18/20/21扩增体系
本发明再一方面,提供一种EGFR基因突变检测的方法(仅用于科研领域),所 述方法包括以下步骤:
1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取:推荐使用Sigma公司的GenEluteTM Plasma/Serum Cell- FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取:推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (货号:56404)
2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制,PCR反应液16ul,酶系1 2ul、引物探针混合液2ul,模板DNA5ul,阴性对照和质控视为样本,作相同处 理。
3)结果判读:
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:利用特异性引物和荧光探 针进行PCR检测,突变和质控由FAM指示,内控由HEX信号指示,通过计算ΔCt 的大小进行判断,反应管的ΔCt值<ΔCt Cut-off值时,则样品为该反应管 对应信号突变阳性,反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
ΔCt值=突变样本Ct值-质控Ct值
表3 CutoffΔCt值
检测靶点 | CutoffΔCt值 |
G719X | 10 |
19del | 10 |
T790M | 8 |
S768I | 12 |
3Ins20 | 8 |
L861Q | 12 |
L858R | 10 |
综上所述,本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种快速、便 捷、高灵敏度的检测非小细胞肺癌患者的EGFR基因突变检测引物探针、试剂 盒及其检测方法,本发明的另一目的是提供一种用于EGFR基因突变检测的反 应体系。
本发明公开了一种快速、便捷、灵敏度高的非小细胞肺癌患者EGFR基因 突变检测的试剂盒。本试剂盒以血浆DNA为检测样本,通过检测EGFR基因突 变,可用于检测非小细胞肺癌患者的血清或血浆、组织样本中EGFR基因的29 种常见突变型,与现有技术相比,本发明的优点:(1)高灵敏度:可在100ng 野生型人类基因组背景下检测出1%微量突变模板,减少了假阴性结果的出现; (2)全封闭反应,避免假阳性结果的发生;(3)双控反应体系,质控及内源 对照,有效检测PCR扩增及核酸提取;(4)正对19del设计LNA寡核苷酸探针, 有效封闭野生型,提高检测灵敏度,确保检测结果的可靠性,可以满足临床快 速检测的实际需求。
附图说明
图1为G719X灵敏度结果
图2为19del灵敏度结果
图3为T790M灵敏度结果
图4为S768I灵敏度结果
图5为3Ins20灵敏度结果
图6为L861Q灵敏度结果
图7为L858R灵敏度结果
图8为临床阳性样本用G790X检测结果
图9为临床阳性样本用19del检测结果
图10为临床阳性样本用T790M检测结果
图11为临床阳性样本用S768I检测结果
图12为临床阳性样本用3Ins20检测结果
图13为临床阳性样本用L861Q检测结果
图14为临床阳性样本用L858R检测结果
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围 不限于下述的实施例。
实施例1
利用本发明实时荧光PCR检测EGFR 29种基因突变的方法包括如下步骤:
(1)核酸提取
以石蜡包埋组织为例,按照推荐的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit说明书进 行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。
(2)PCR反应体系的配制(25ul)
试剂名称 | 加入量 |
PCR反应液 | 16ul |
酶系1 | 2ul |
引物探针混合液 | 2ul |
模板DNA | 5ul |
所述的模板DNA包含样本DNA和阴性、阳性对照DNA。
(3)PCR扩增
实时PCR扩增条件为:50℃2min,1个循环;95℃5min;95℃10s,55℃ 15s,72℃30s,5个循环;95℃10s,60℃45s(收集FAM和HEX荧光信号), 40个循环。
(4)结果判定
1)检测结果除阴性对照外,突变反应管的内控信号HEX应有扩增曲线, 且Ct≤33;若Ct>33,则提示样本DNA模板量偏低或存在PCR抑制剂,需重新 提取或者增加PCR模板量再做,但是如果管内FAM有信号,可能是由于突变的 扩增抑制了内控序列的扩增,结果仍然可信。
2)质控管FAM信号Ct<21,提示样品加入量过高,需减少样本加入量再 实验;质控管FAM信号Ct>26或阴性,提示该样本加入量过低或提取失败, 需要增加样本量再实验或重新提取。
3)质控管FAM信号21≤Ct≤26
A:ARMS引物管Ct<30,样本结果判读为阳性。
B:ARMS引物管>阴性临界值或无扩增曲线,样本结果判读为阴性。
C:相应ARMS引物管30≤Ct值<阴性临界值(如下表),且其与质控管 FAM信号的ΔCt≤△Ct Cut-off值,该样本结果判读为阳性;反之则判读为阴 性。
实施例2
利用本发明检测EGFR基因突变阳性患者石蜡包埋组织样本10例,并与测 序结果进行对照,结果:检测出19del阳性4例,L858R阳性5例,T790M阳 性1例,与测序法符合率100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明 的保护范围之内。
Claims (5)
1.用于EGFR基因突变检测的引物、探针,其特征在于,包含如下序列:
2.用于EGFR基因突变检测的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的用于EGFR基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括EGFR PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
4.根据权利要求2或3任意所述的用于EGFR基因突变检测的试剂盒,其特征在于,包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的EGFR基因突变的检测。
5.用于EGFR基因突变检测的PCR反应扩增体系,其特征在于,包括:19del扩增体系:
18/20/21扩增体系
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CN (1) | CN108130362A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111206099A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-05-29 | 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 |
CN111363810A (zh) * | 2018-12-25 | 2020-07-03 | 河南爱微迪生物技术有限公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
CN112322739A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-05 | 深圳市罗湖区人民医院 | 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102851375A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-01-02 | 上海源奇生物医药科技有限公司 | 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 |
CN105112544A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种用于检测egfr基因t790m突变的探针、引物及试剂盒 |
-
2017
- 2017-12-29 CN CN201711468609.1A patent/CN108130362A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102851375A (zh) * | 2012-09-11 | 2013-01-02 | 上海源奇生物医药科技有限公司 | 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 |
CN105112544A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种用于检测egfr基因t790m突变的探针、引物及试剂盒 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111363810A (zh) * | 2018-12-25 | 2020-07-03 | 河南爱微迪生物技术有限公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
CN111363810B (zh) * | 2018-12-25 | 2023-10-20 | 郑州方欣生物科技有限责任公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
CN111206099A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-05-29 | 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 | 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒 |
CN112322739A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-05 | 深圳市罗湖区人民医院 | 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 |
CN112322739B (zh) * | 2020-11-24 | 2023-08-15 | 深圳市罗湖区人民医院 | 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 |
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