CN107177682A - 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107177682A
CN107177682A CN201710443065.7A CN201710443065A CN107177682A CN 107177682 A CN107177682 A CN 107177682A CN 201710443065 A CN201710443065 A CN 201710443065A CN 107177682 A CN107177682 A CN 107177682A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kit
probe
control
braf
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710443065.7A
Other languages
English (en)
Inventor
韦玉军
李航
王娟
苏军
吴远航
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Anlong Gene Ltd Medical Examination
Original Assignee
Anhui Anlong Gene Ltd Medical Examination
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Anlong Gene Ltd Medical Examination filed Critical Anhui Anlong Gene Ltd Medical Examination
Priority to CN201710443065.7A priority Critical patent/CN107177682A/zh
Publication of CN107177682A publication Critical patent/CN107177682A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，试剂盒包括PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照。引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针、质控基因和内控检测引物探针，突变和质控探针5’端标记FAM荧光素，3’端标记MGB荧光素；内控5’端标记HEX荧光素，3’端标记BHQ1荧光素。质控基因选择是人类BRAF V600E基因相对保守的区段，内控选择的是人β‑aCtin保守基因，双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR反应过程。与现有技术相比：利用本发明所提供的引物、探针和扩增体系的试剂盒检测灵敏度高，可检测突变含量低至0.1％的标本；检测准确率高，采用双控检测体系，保证检测结果的可靠性。

Description

用于BRAF V600E基因突变的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及的是用于BRAF V600E基因突变的试剂盒及检测方法。
背景技术
目前，肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约(NSCLC)占80％，且就诊时80％己失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10％-20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。
甲状腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。2010年甲状腺癌的发病率均居所有女性恶性肿瘤的前十位。随着人们生活方式、饮食结构的改变，平均寿命的提高，甲状腺癌的发病率可能还将进一步上升。在常规健康体验中，有很多人会被查出甲状腺结节，“良性还是恶性？”是大家最关心的问题。目前，B超引导下穿刺涂片检查是鉴别结节良恶性的主要手段。但受多种因素的影响，不少结节依靠穿刺涂片检查仍无法定性。
有一种叫做BRAF的原癌基因，该基因的突变与多种肿瘤的发生有关，最常见于甲状腺乳头状癌和皮肤黑色素瘤。乳头状癌约占所有甲状腺癌的85％以上。发现并鉴定BRAF突变是近年来甲状腺癌研究领域的重大进展。一般认为，与没有BRAF突变的甲状腺癌相比，检出BRAF突变的甲状腺癌恶性程度更高，转移和复发的风险也更大。
突变扩增阻滞系统(amplification refraCtory mutation system，ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技术。其依据的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，扩增反应终止。
BRAF基因是EGFR信号传导通路重要成员，参与和调控细胞的增值分化和增长全过程。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。特异性探针法如以ScorpionsARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx的BRAF V600E检测试剂盒虽然检测灵敏度高，但其检测费用较高，不适合国内NSCLC患者的常规检测和筛查，因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒成本过高的不足，提供了一种用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，本发明的另一目的在于，提供一种用于BRAF V600E基因突变的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，其特征在于：包括BRAF V600E基因突变检测的特异引物和探针，其特异引物与探针包括如下序列：
优选的，所述的探针5’端FAM荧光素，3’端标记MGB猝灭荧光素。
优选的，所述的试剂盒还包括BRAF V600E突变及BRAF野生型PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
优选的，还应包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的BRAF V600E基因突变的检测。
作为优选，还应包括如下扩增体系：
一种BRAF V600E基因突变的检测方法，所述的方法包含以下步骤：
(1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取：推荐使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取：推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号：56404)
(2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制，PCR反应液16ul，酶系1
2ul、引物探针混合液2ul，模板DNA5ul，阴性对照和质控视为样本，作相同处理。
(3)结果判读：
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探针进行PCR检测，突变和质控由FAM指示，内控由HEX信号指示，通过计算ΔCt的大小进行判断，反应管的ΔCt值＜ΔCt Cut-off值时，则样品为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
表CutoffΔCt值
检测靶点 CutoffΔCt值
V600E 10
本发明提供了用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照和说明书。引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针，质控基因和内控检测引物探针，突变和质控探针5’端标记FAM荧光素，3’端标记MGB荧光素；内控5’端标记HEX荧光素，3’端标记BHQ1荧光素，质控及内控均作为结果判读的一部分。质控基因选择是人类BRAF V600E基因相对保守的区段，内控选择的是人β-aCtin保守基因，双控体系共同用于监控血浆样本DNA质量和PCR反应过程。与现有技术相比：1)高灵敏度：可在100ng野生型人类基因组背景下检测出1％微量突变模板，减少了假阴性结果的出现；2)全封闭反应，避免假阳性结果的发生；3)双控反应体系，质控及内源对照，有效检测PCR扩增及核酸提取。
附图说明
图1为V600E灵敏度结果图；
图2为临床阳性样本用V600E检测结果图；
图3位V600E试剂盒扩增野生型样本结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
利用本发明实时荧光PCR检测BRAF V600E 7种基因突变的方法包括如下步骤：
1、核酸提取
以石蜡包埋组织为例，按照推荐的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit说明书进行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。
2、PCR反应体系的配制(25ul)
试剂名称 加入量
PCR反应液 16ul
酶系1 2ul
引物探针混合液 2ul
模板DNA 5ul
所述的模板DNA包含样本DNA和阴性、阳性对照DNA。
3、PCR扩增
实时PCR扩增条件为：50℃2min，1个循环；95℃5min；95℃10s，55℃15s,72℃30s，5个循环；95℃10s，60℃45s(收集FAM和HEX荧光信号)，40个循环。
4、结果判定
1)检测结果除阴性对照外，突变反应管的内控信号HEX应有扩增曲线，且Ct≤33；若Ct＞33，则提示样本DNA模板量偏低或存在PCR抑制剂，需重新提取或者增加PCR模板量再做，但是如果管内FAM有信号，可能是由于突变的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。
2)质控管FAM信号Ct＜21，提示样品加入量过高，需减少样本加入量再实验；质控管FAM信号Ct＞26或阴性，提示该样本加入量过低或提取失败，需要增加样本量再实验或重新提取。
3)质控管FAM信号21≤Ct≤26
A：ARMS引物管Ct＜30，样本结果判读为阳性。
B：ARMS引物管＞阴性临界值或无扩增曲线，样本结果判读为阴性。
C：相应ARMS引物管30≤Ct值＜阴性临界值(如下表)，且其与质控管FAM信号的ΔCt≤△Ct Cut-off值，该样本结果判读为阳性；反之则判读为阴性。
实施例2
利用本发明检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织样本10例，并与测序结果进行对照，结果：检测出V600E阳性2例，与测序法符合率100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，其特征在于：包括BRAF V600E基因突变检测的特异引物和探针，其特异引物与探针包括如下序列：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物探针混合液，引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针、质控基因和内控检测引物探针；突变和质控探针5’端标记FAM荧光素，3’端标记MGB荧光素；内控5’端标记HEX荧光素，3’端标记BHQ1荧光素。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括BRAF V600E突变及BRAF野生型PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还应包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的BRAF V600E基因突变的检测。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还应包括如下扩增体系：
6.一种BRAF V600E基因突变的检测方法，所述的方法包含以下步骤：
(1)样本DNA的提取
血清游离DNA提取：推荐使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-FreeCirculating DNA Purification Midi Kit。
组织样本DNA提取：推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号：56404)
(2)PCR反应体系的配制
在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制，PCR反应液16ul，酶系1
2ul、引物探针混合液2ul，模板DNA5ul，阴性对照和质控视为样本，作相同处理。
(3)结果判读：
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探针进行PCR检测，突变和质控由FAM指示，内控由HEX信号指示，通过计算ΔCt的大小进行判断，反应管的ΔCt值＜ΔCt Cut-off值时，则样品为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。
表CutoffΔCt值
检测靶点 CutoffΔCt值 V600E 10
CN201710443065.7A 2017-06-13 2017-06-13 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法 Pending CN107177682A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710443065.7A CN107177682A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710443065.7A CN107177682A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107177682A true CN107177682A (zh) 2017-09-19

Family

ID=59835366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710443065.7A Pending CN107177682A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107177682A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753961A (zh) * 2018-05-07 2018-11-06 广州迈景基因医学科技有限公司 Braf v600e基因突变检测引物、方法及试剂盒
CN110964818A (zh) * 2019-11-28 2020-04-07 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类braf基因v600e突变的检测试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099425A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 上海赛安生物医药科技有限公司 一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒
CN104846106A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 沈阳优吉诺生物科技有限公司 检测braf基因v600e突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099425A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 上海赛安生物医药科技有限公司 一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒
CN104846106A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 沈阳优吉诺生物科技有限公司 检测braf基因v600e突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753961A (zh) * 2018-05-07 2018-11-06 广州迈景基因医学科技有限公司 Braf v600e基因突变检测引物、方法及试剂盒
CN110964818A (zh) * 2019-11-28 2020-04-07 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类braf基因v600e突变的检测试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104818318B (zh) 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒
CN101608240B (zh) 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法
CN102242207B (zh) 癌基因brafv600e突变检测的引物和探针
CN107034296A (zh) 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用
CN105112522A (zh) Her2基因扩增的检测引物组及试剂盒
CN105441573A (zh) 用于检测人类jak2基因v617f突变的引物、探针及试剂盒
WO2021164492A1 (zh) 一组结肠癌预后相关基因的应用
EP3998354A1 (en) Genetic marker combination and application thereof
KR20230017885A (ko) 유전자 마커 조합 및 이의 용도
CN105463111B (zh) 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒
CN106480201A (zh) 乳腺癌转移评估试剂盒
CN102534008A (zh) 一种与非贲门癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用
CN108949961A (zh) 用于检测腺病毒肺炎的试剂盒及其筛选
CN104818322B (zh) miRNA和Cyfra21‑1联合在检测非小细胞肺癌中的应用
CN107177682A (zh) 用于brafv600e基因突变的试剂盒及检测方法
CN104293932A (zh) 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法
CN107164495A (zh) 用于人类kras基因突变检测的试剂盒及其检测方法
CN108130362A (zh) 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用
CN105441568A (zh) 用于检测人类bcr-abl融合基因t315i突变的引物、探针及试剂盒
CN111808963A (zh) 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法
CN107746887B (zh) lncRNA组合物及制备诊断预示Luminal A型乳腺癌骨转移基因诊断试剂盒的用途
CN107916291B (zh) 一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒
CN103290120A (zh) 一种用于检测alk基因表达的探针、引物及试剂盒
WO2020134950A1 (zh) 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒
CN112391478B (zh) 外泌体mRNA在乳腺疾病诊断中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170919