CN105441568A - 用于检测人类bcr-abl融合基因t315i突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物、探针和试剂盒,其中引物和探针包括突变上游ARMS引物AM1-F和突变下游引物AW1-R,以及检测探针AW1-P和阻断探针AW1-B。由其组成的试剂盒还可以包括外控引物和探针,以及内控引物和探针。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术,可以准确地检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变,特异性水平高,在高野生型基因背景下也能检出低含量突变序列,试剂盒使用方法简单,检测快速,结果易读,灵敏度高,可实现50拷贝突变基因的稳定检出;特异性好,20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增,检测能力高达1%。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术
慢性粒细胞白血病(ChronicMyelognousLeukemia,CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病,在我国的发病率小于1/10万人,其中90%以上病例均具有BCR-ABL融合基因。
BCR-ABL融合基因是由人体细胞第9号染色体上的ABL原癌基因与第22号染色体上的BCR基因相互易位形成的融合基因,可引起蛋白激酶持续性激活,使白细胞过分增殖而出现慢性粒细胞白血病。
不同的BCR-ABL融合基因类型与疾病表型相关。BCR-ABL融合基因中,主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息,而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。
格列卫的使用使有些造血干细胞移植适应症的CML患者放弃了移植,但格列卫并不能根治CML。因为它是通过抑制BCR-ABL融合蛋白的激酶活性发挥作用,本身并不能抑制融合蛋白的形成,因此停药后易复发。
格列卫临床应用不久就发现耐药现象(~15%),其耐药机制可分为以下四类:1、BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区发生突变,使格列卫结合位点酪氨酸激酶结构域的空间构象发生改变,导致格列卫不能竞争性结合融合蛋白(~80%;继发耐药);2、BCR-ABL融合蛋白过度表达,超过了格列卫的竞争结合能力(~10%);3、BCR-ABL融合基因基因组拷贝数的扩增,往往也会导致BCR-ABL融合蛋白的过度表达;4、CML克隆的增生不完全依赖BCR-ABL,还存在其他基因异常,如多药耐药基因的异常等。
目前报道的突变中,尤以T315I耐药程度最高,是惟一报道对所有激酶抑制剂都耐药的突变。这些高度耐药的突变预后差,需尽早改用其他治疗方案。而其他的突变类型耐药程度不高,可以通过提高剂量来抵抗耐药。因此,在用格列卫治疗前对患者的BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变进行检测(T315I),是指导CML患者用药的一个重要指标。
目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低,检测灵敏度只有20~30%;实验操作复杂,检测效率低、样品易污染,通常要1~2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测,直接测序的方法几乎无法实现其准确检测,会导致大量漏检及假阴性的发生。染料溶解曲线或探针溶解曲线法,都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂,且容易污染,假阳性率高。
近年来,随着核酸扩增技术的不断优化,国外开始报道采用外周血标本检测游离DNA中基因突变的方法。外周血取样不仅取材简便,且检测准确度与组织标本的结果符合率较高。这不仅极大地促进了靶向药物基因突变检测方法的研究进展,也使以游离DNA为靶分子对临床药物疗效及预后进行实时检测成为研究的热点。但外周血中癌细胞突变DNA存在于大量野生型基因背景中,其比例较低。因此,需要高性能的检测技术来实现低突变含量的检出。
发明内容
为了进一步提高人类BCR-ABL融合基因T315I突变检测的灵敏度和特异性,本发明提供了用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针。本发明还提供了包括上述引物和探针的检测试剂盒,该试剂盒操作简单,结果易读,检测快速,适用范围广。
本发明提供的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针,其核苷酸序列如下:
突变上游ARMS引物AM1-F:SEQIDNO:1,
突变下游引物AW1-R:SEQIDNO:2,
检测探针AW1-P:SEQIDNO:3,
阻断探针AW1-B:SEQIDNO:4;
其中,检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰,3’端标记有淬灭基团。
表1人类BCR-ABL融合基因T315I热点突变
突变名称 | 氨基酸变化 | 碱基变化 | CosmicID |
AM1 | T315I | 944C>T | 12560 |
上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物,其中,AM1-F为突变上游ARMS引物,与T315I(944C>T)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;AW1-R为突变下游引物,与ABL1基因保守序列结合;AW1-P为5’端标记有荧光基团,3’端标记淬灭基团的检测探针,能与扩增片段结合;AW1-B为5’端双脱氧修饰,3’端标记淬灭基团的阻断探针,能与T315I位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
优选地,所述荧光基团为FAM,所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合,进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针,MGB探针序列可设计得更短,特异性更强。
本发明提供的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,包括以上所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针。
优选地,上述用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒中,还包括外控引物和探针,核苷酸序列如下:
外控上游引物AR-F:SEQIDNO:5,
外控下游引物AR-R:SEQIDNO:6,
外控检测探针AR-P:SEQIDNO:7,外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM,3’端标记有MGB。
其中,AR-F和AR-R为外控上下游引物,扩增ABL1基因保守序列(此段保守序列不同于AW1-R为突变下游引物结合扩增的保守序列);AR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合。
优选地,上述用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,还包括内控引物和探针,核苷酸序列如下:
内控上游引物IC-F:SEQIDNO:8,
内控下游引物IC-R:SEQIDNO:9,
内控检测探针IC-P:SEQIDNO:10,内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE,3’端标记有BHQ1。
其中,IC-F和IC-R为内控上下游引物,扩增matK基因保守序列;IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针,能与扩增片段结合。
优选地,上述用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒中的反应体系分为两个:
检测反应体系:包括用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针,内控引物和探针,ABpremix,10×buffer和ddH2O;
质控反应体系:包括外控引物和探针、内控引物和探针,ABpremix,10×buffer和ddH2O;
所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix;所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液,缓冲液中含有Mg2+。
本发明提供的上述用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒的使用方法,是提取待检样品的基因组DNA,分别加入到检测反应体系和质控反应体系,进行荧光定量PCR反应;另外设置非模板对照和阳性对照,与待检样品的基因组DNA进行同样的操作;根据Ct值分析检测结果:
首先需要满足JOE信号Ct值≤25,非模板对照的FAM信号不起线,阳性对照的FAM信号Ct值≤20;9<Ct质控≤18;然后按照△Ct=Ct检测-Ct质控判定,△Ct≤8为阳性,△Ct>8为阴性;
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值,所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
所述的阳性对照可以由试剂盒提供,其为包含有NCBI数据库公布的ABL1基因(NCBIReferenceSequence:NM_005157.5)6号外显子发生T315I(见表1)碱基变化的基因片段(>gi|568815589:130872701-130873100)的突变质粒AM1,包含有NCBI数据库公布的ABL1基因(NCBIReferenceSequence:NM_005157.5)2号外显子基因片段(>gi|568815589:130854001-130854400)的外控质粒AR以及包含有NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守区域基因片段(>gi|11994090:c2400-2001)的内控质粒IC。
优选地,上述用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒的使用方法中,荧光定量PCR反应的条件为:
95℃10min;
92℃15sec,58℃1min,共15个循环;
92℃15sec,60℃1min,共30个循环;在60℃时收集信号。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术,可以特异性的检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变。其中,特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列;在此基础上,阻断探针与野生型序列特异性结合,有效抑制了野生型的非特异性扩增,进一步提高体系的特异性水平,从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中,对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。在本发明试剂盒的内控检测体系中,对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常,操作过程是否准确)。检测快速,且操作简单,结果易读。
(3)本方法灵敏度高,可实现50拷贝突变基因的稳定检出;特异性好,20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增,检测能力高达1%。
附图说明
图1是实施例1中IC实验结果;
图2是实施例1中非模板对照(NTC)实验结果;
图3是实施例1中阳性对照(STD)实验结果;
图4是实施例1中灵敏度实验结果;
图5是实施例1中精密度实验结果;
图6是实施例2中阴性样本的实验结果;
图7是实施例2中阳性样本的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、构建实时荧光PCR扩增反应体系:
1)人类BCR-ABL融合基因T315I突变检测引物和探针设计:
根据NCBI数据库公布的ABL1基因(NCBIReferenceSequence:NM_005157.5)野生型序列,以6号外显子T315I突变位点(见表1)为参考,设计特异性突变引物和探针(见表2)。以基因工程构建的突变质粒(AM1质粒,所插入基因片段为>gi|568815589:130872701-130873100)和野生型质粒(所插入基因片段为>gi|568815589:130872701-130873100)为模板,建立实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系,实现对BCR-ABL融合基因T315I突变的高灵敏度和高特异性检测。
表2用于检测T315I位点的特异性突变引物和探针组合
根据NCBI数据库公布的ABL1基因(NCBIReferenceSequence:NM_005157.5)2号外显子保守序列,设计外控引物和探针(见表3)。以基因工程构建的含ABL1基因2号外显子保守序列的外控质粒(AR质粒,所插入基因片段为>gi|568815589:130854001-130854400)为模板,建立实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系,对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。
表3用于样本质控的外控引物和探针组合
根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守序列(non-humanDNA),设计内控引物和探针(见表4)。以基因工程构建的含有matK基因保守序列的内控质粒(IC质粒,所插于基因片段为>gi|11994090:c2400-2001)为模板,建立实时荧光PCR内控(InternalControl)检测体系,对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表4用于内部质控的内控引物、探针组合
实时荧光PCR扩增反应体系设置:用2孔实时荧光PCR扩增反应液进行人类BCR-ABL融合基因T315I突变的检测。其中,反应体系1(见表6)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系,反应体系2(见表6)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
表5试剂盒组成成分
说明:IC-内控用于内部质控,含有反应体系1和2中JOE信号通路扩增所需目的片段(IC质粒),每孔反应均需加入(阳性对照已包含),以实现对反应操作和反应体系性能的质控要求。ABL1-阳性对照为阳性质控品,含有反应体系1和2中FAM信号通路扩增所需目的片段(AM1质粒和AR质粒)及JOE信号通路扩增所需目的片段(IC质粒)。
各反应体系组成如下:
表6实时荧光PCR扩增反应体系组成
注:ABpremix全称FastAdvancedMasterMix,购自美国应用生物系统公司;10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
反应体系1用于人类BCR-ABL融合基因T315I突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。
反应体系2用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。
实时荧光PCR反应总体积25μL,含19μL的反应体系和6μL的检测模板。反应体系已预先分装到8联PCR反应条中,使用时将检测模板分别加入到反应体系1和2中。其中,检测模板分为阳性对照(阳性质控),非模板对照(阴性质控)和待测样本模板。阳性对照由试剂盒提供,直接使用;非模板对照和待测样本模板需自配,分别将适量ddH2O(非模板对照)和待测样本基因组DNA稀释液与IC内控按照5:1的比例混合均匀即可。
实时荧光PCR扩增反应基本原理:上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE),3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前,检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近,由于荧光共振能量转移的作用,荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行,检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解,5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离,进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合,进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针,MGB探针序列可设计得更短,特异性更强。
2、获取待测样本基因组DNA
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)。按说明书提取CML(Ph+)患者全血基因组DNA,操作步骤简述如下:
取血液样本200μL到离心管,加入50μLProteinaseK,涡旋震荡混匀(2s每次,震荡5次);加入250μL裂解液BL,涡旋震荡混匀,室温静置10min充分裂解细胞;加入200μL无水乙醇,涡旋振荡混匀;将上述溶液全部转移到DNA吸附柱中,13000rpm离心1min,弃收集管;将吸附柱置于新的2mL收集管中并加入500μL的洗涤液BWB1,13000rpm离心1min,弃滤液;加入500μL洗涤液BWB2,13000rpm离心1min,弃收集管;将吸附柱置于1.5mL的核酸酶污染的离心管中,室温静置10min或超净工作台中风干5min使乙醇彻底挥发;向吸附膜中央小心加入50~100μL洗脱液BE,室温静置5min;13000rpm离心1min,收集滤液,-20℃保存。
将抽提好的DNA样本,用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量,DNA的浓度要求≥10ng/μL,DNA的质量OD260/280在1.8~2.0之间。定量后,母液-20℃保存。
3、实时荧光PCR扩增反应:
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L,pH8.0)稀释到2~10ng/μL作为模板,加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表6)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置如下:
表7:实时荧光PCR扩增反应条件
最优的,在Stage2阶段(15个循环),58℃的退火延伸温度,有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环),60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
4、检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果:以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25,扩增正常),以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线,阳性对照FAM信号Ct值≤20,体系性能良好,结果有效);以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct外控≤18,Ct外控≤9,说明加入的基因组DNA浓度过高,应稀释后重新检测该样本;Ct外控>18或无扩增曲线,说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解,建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测),以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct=Ct突变-Ct外控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤8为阳性,△Ct>8为阴性)。
5、用本发明中的人类BCR-ABL融合基因T315I突变检测试剂盒进行性能分析实验。
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果,Ct内控≤25,符合要求;图2为NTC检测结果,反应体系1~2FAM均不起线,符合要求;图3为STD检测结果,反应体系1~2FAM信号均起线且Ct≤20,符合要求。
(1)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有BCR-ABL融合基因T315I突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L,pH8.0)复溶,定量后稀释。取1×103拷贝/μL突变质粒DNA分别进行10倍稀释,稀释2个梯度,然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板,进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高,10拷贝/μL突变基因即可检出。
(2)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有BCR-ABL融合基因T315I突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L,pH8.0)复溶,定量后稀释。以5×101拷贝/μL突变质粒DNA为模板,进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定,CV<5%)。
实施例2
用本发明中人类BCR-ABL融合基因T315I突变检测试剂盒来检测临床采集的血液样本。
本实施例中收集临床病理诊断为CML(Ph+)的患者血液样本,并从中提取基因组DNA。用人类BCR-ABL融合基因T315I突变检测试剂盒检测待测样本中是否存在BCR-ABL融合基因T315I突变。具体步骤如下:
(1)样本基因组DNA提取
血液样本的提取使用宁波有成血液基因组DNA提取试剂盒(KR008F)。按说明书提取待测样本基因组DNA,将抽提好的DNA样本,用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量,DNA的浓度要求≥10ng/μL,DNA的质量OD260/280在1.8~2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L,pH8.0)稀释到2~10ng/μL作为PCR模板,进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表7,按照人类BCR-ABL基因T315I突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果:以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25,扩增正常),以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线,阳性对照FAM信号Ct值Ct≤20,体系性能良好,结果有效);以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct=Ct突变-Ct外控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤8为阳性,△Ct>8为阴性)。
图6中,Ct外控=13.4,符合要求;突变检测孔FAM信号均未起线,显示样本检测结果为阴性。
图7中,Ct外控=13.1,符合要求;AM1突变检测孔FAM信号起线,且CtAM1=16.8,△Ct=3.7,显示样本检测结果为CM1(T315I)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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<213>人工序列
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agcccccgttctatatcatcgt22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gccatctacagcagcaccac20
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
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cctcctggactacctg16
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<212>DNA
<213>人工序列
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atatcatcactgagttcatg20
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aggtaaaagggttgtgggca20
<210>6
<211>21
<212>DNA
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aacgagcaaagggtggtaggt21
<210>7
<211>15
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caattcccagatttc15
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<213>人工序列
<400>9
caacgggtttactaataggatgcc24
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tcgataccacagtccttgcaactcccc27
Claims (8)
1.用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针,其特征在于,核苷酸序列如下:
突变上游ARMS引物AM1-F:SEQIDNO:1,
突变下游引物AW1-R:SEQIDNO:2,
检测探针AW1-P:SEQIDNO:3,
阻断探针AW1-B:SEQIDNO:4;
其中,检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰,3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针,其特征在于,所述荧光基团为FAM,所述淬灭基团为MGB。
3.用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,其特征在于,还包括外控引物和探针,核苷酸序列如下:
外控上游引物AR-F:SEQIDNO:5,
外控下游引物AR-R:SEQIDNO:6,
外控检测探针AR-P:SEQIDNO:7,外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM,3’端标记有MGB。
5.根据权利要求4所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,其特征在于,还包括内控引物和探针,核苷酸序列如下:
内控上游引物IC-F:SEQIDNO:8,
内控下游引物IC-R:SEQIDNO:9,
内控检测探针IC-P:SEQIDNO:10,内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE,3’端标记有BHQ1。
6.根据权利要求5所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒,其特征在于,试剂盒中的反应体系分为两个:
检测反应体系:包括用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的引物和探针,内控引物和探针,ABpremix,10×buffer和ddH2O;
质控反应体系:包括外控引物和探针、内控引物和探针,ABpremix,10×buffer和ddH2O;
所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix;所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液,缓冲液中含有Mg2+。
7.权利要求6所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒的使用方法,其特征在于,提取待检样品的基因组DNA,分别加入到检测反应体系和质控反应体系,进行荧光定量PCR反应;另外设置非模板对照和阳性对照,与待检样品的基因组DNA进行同样的操作;根据Ct值分析检测结果:
首先需要满足JOE信号Ct值≤25,非模板对照的FAM信号不起线,阳性对照的FAM信号Ct值≤20;9<Ct质控≤18;然后按照△Ct=Ct检测-Ct质控判定,△Ct≤8为阳性,△Ct>8为阴性;
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值,所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
8.根据权利要求7所述的用于检测人类BCR-ABL融合基因T315I突变的试剂盒的使用方法,其特征在于,荧光定量PCR反应的条件为:
95℃10min;
92℃15sec,58℃1min,共15个循环;
92℃15sec,60℃1min,共30个循环;在60℃时收集信号。
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