CN110358825A - 检测人bcr-abl融合基因的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及融合基因检测领域,具体讲,涉及一种检测人BCR‑ABL融合基因的试剂盒。本申请的试剂盒采用一步法逆转录对人BCR‑ABL融合基因进行检测,试剂盒包括核酸扩增试剂,核酸扩增试剂包括BCR‑ABL PCR反应液、内参PCR反应液和混合酶液。本申请的试剂盒将荧光PCR和逆转录技术相结合,采用一步法检测样本中BCR‑ABL210融合基因的表达水平,具有高特异性、高准确性和高灵敏度的技术优势。
Description
技术领域
本申请涉及融合基因检测领域,具体讲,涉及一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒及其使用方法。
背景技术
白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤,其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖,并浸润体内各组织脏器,导致正常造血组织细胞受抑制,产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血,肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL),根据白血细胞的形态和生化特征,又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒-单核细胞白血病(CMML)等。
白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一,其发病率为2.76/10万人口,我国估计有5万以上患者,且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位,但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。近年临床研究表明,大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变,如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因,这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以,对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此,世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。
BCR-ABL融合基因是各类白血病中研究的最为深入的部分,BCR-ABL和费城(Ph)染色体的形成相关,是白血病中最常见的染色体异常。Ph染色体形成的分子基础是9号染色体上的C-ABL基因易位到22号染色体上的BCR基因上形成BCR-ABL融合基因,即t(9;22)(q34;q11)易位。根据断裂点的不同,BCR-ABL融合基因可分为3种类型,P190,P210,P230,CML病人约90%~95%病人含有P210,因此临床上把检测P210作为CML分型诊断依据、疗效评价,以及微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。在CML中,还有一部分的Ph染色体阴性的CML患者,其BCR-ABL融合基因也为阳性,这可能是一部分的Ph染色体不易看清楚,据统计,在CML病人中,BCR-ABLP210融合基因的阳性率为99%,这也说明分子水平的检测较细胞遗传学的方法更为敏感。
此外,BCR-ABLP210融合基因的水平与临床疗效有很好的相关性,并能预先对临床病情变化提出警示,对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义,因此,定期检测BCR-ABLP210融合基因水平是必要的。美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《CML临床实践指南》(2012版)明确将P210检测作为慢粒白血病患者初筛和酪氨酸激酶抑制剂疗效跟踪的预后指标,并提出了更早的治疗方案决策时间点(3个月),同时建议IM治疗3个月内未实现BCR-ABL/ABL水平≤10%的患者,换用第二代TKI药物,考虑异基因造血干细胞移植或临床试验,并停用IM。
目前对白血病的检查主要有血象检查、骨髓涂片检查、血液生化检查等,但这些都没有对融合基因进行检查,获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH),PCR和基因芯片等。
其中,FISH技术是利用已知的核酸探针,与组织、细胞染色体标本中相关核酸序列杂交,通过间接免疫荧光反应,直接定位基因,适用于多种临床标本,包括血液,骨髓、组织印片,甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH对处于分裂中期和间期细胞都能检测,克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍,但最低检出量较低,主要用于初诊和复发的检测。
PCR是检测融合基因的首选方法,不同类型的白血病和淋巴瘤存在不同的染色体易位,目前检测融合基因的主要PCR方法有巢式PCR方法,但这些大多是终点PCR方法,而且需要经过电泳检查,容易污染,极大地抑制了其在临床的广泛应用。
基因芯片方法是将许多白血病特异的探针固定在特定的介质上,利用分子之间相互识别的原理,来检测与探针相互作用的分子。通过基因芯片检查,可以发现病人骨髓中是否存在染色体易位。但目前该技术尚不够成熟,尤其是在PCR后的开管取样用于杂交,对其后的PCR反应,存在着很大的污染隐患,因此有一定的假阳性和假阴性率,且结果不容易解释,临床推广困难。
在荧光定量PCR技术普及前,很多研究学者采用竞争性定量PCR技术对融合基因进行定量分析,但竞争性定量PCR不仅耗时耗力,而且不利于标准化操作的建立,极大限制了其在临床上的应用。
实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)基于荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET),通过检测PCR过程的荧光信号而得知靶基因的初始拷贝数。实时定量PCR应用简化了检测过程,其反应速度快,最低检出量高,特异性强,可重复性好,是目前国内外学者研究白血病融合基因首选的检测手段。2002年,由欧洲10个国家26个实验室共同参与制定了“欧洲防癌计划”,建立了一套白血病标准化的融合基因检测方法,为大规模的临床融合基因检测奠定了理论基础,但因为缺乏中国患者的数据,未能在中国大规模应用。
鉴于此,特提出本申请。
发明内容
本申请的发明目的在于提出一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒。
为了完成本申请的目的,采用的技术方案为:
本申请涉及一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒,所述试剂盒采用一步法逆转录对人BCR-ABL融合基因进行检测,所述试剂盒包括核酸扩增试剂,所述核酸扩增试剂包括BCR-ABL PCR反应液、内参PCR反应液和混合酶液;
其中,所述BCR-ABL PCR反应液中含有用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针,所述内参PCR反应液中含有用于检测内参基因的引物和探针,所述混合酶液中含有Taq酶、UNG酶、RT酶和Rnasin;
其中,所述用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:1所示的上游引物;由SEQ ID NO:2所示的下游引物;由SEQ ID NO:3所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
所述内参PCR反应液用于控制检测的有效性,所述用于检测内参基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:4所示的上游引物;由SEQ ID NO:5所示的下游引物;由SEQ ID NO:6所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团。
优选的,SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA;SEQID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。
可选的,所述核酸扩增试剂中还包括BCR-ABL PCR参考品反应液和内参参考品反应液;BCR-ABL PCR参考品反应液含有所述用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针,内参参考品反应液含有所述用于检测内参基因的引物和探针。
可选的,所述核酸扩增试剂中还包括对照酶液;对照酶液含有Taq酶和UNG酶。
可选的,所述试剂盒中还包括对照品,所述对照品包括阴性对照和阳性对照,阴性对照的成分为工艺用水,阳性对照中含有K562细胞株裂解物K562细胞株裂解物采用市售原料,并通过测序验证正确。
可选的,所述试剂盒中还包括参考品,所述参考品用于形成目的基因和内参基因的标准曲线从而对目的基因和内参基因的进行分别定量,所述参考品如表1所示:
表1
其中,BCR-ABL-210-b2a2质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,BCR-ABL-210-b3a2质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,BCR-ABL-190质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,BCR-ABL-230质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;
内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
可选的,试剂盒所适用的样本选自外周血标本或骨髓标本。
可选的,所述混合酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份,RT酶0.25~0.45体积份,Rnasin 0.2~0.3体积份;所述对照酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份;
优选的,所述混合酶液中含有Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份,RT酶0.375体积份,Rnasin 0.25体积份;所述对照酶液中含有Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份;
其中,UNG酶的活性单位为1U/μl,Taq酶的活性单位为5U/μl,RT酶的活性单位为200U/μl。
本申请还涉及一种检测人BCR-ABL融合基因的引物和探针,包括用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针和用于检测内参基因的引物和探针:
所述用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:1所示的上游引物;由SEQ ID NO:2所示的下游引物;由SEQ ID NO:3所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
所述用于检测内参基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:4所示的上游引物;由SEQ ID NO:5所示的下游引物;由SEQ ID NO:6所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
优选的,SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA;SEQID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。
本申请还涉及上述试剂盒的使用方法,至少包括以下步骤:
(1)样本处理:
提取RNA,得到样本;
(2)扩增试剂配制:
将BCR-ABL PCR反应液与混合酶液混合、将内参PCR反应液与混合酶液混合、将BCR-ABL PCR参考品反应液与对照酶液混合、将内参参考品反应液与对照酶液混合,得到相应的PCR预混液;
(3)加样:
从样本、阴性对照、阳性对照、BCR-ABL PCR参考品1~BCR-ABL PCR参考品4、内参参考品1~内参参考品4中分别取样,加入到相应的PCR预混液中,
(4)PCR扩增;
(5)检测。
本申请的技术方案至少具有以下有益的效果:
本申请试剂盒将荧光定量PCR和逆转录技术相结合,采用一步法检测样本中BCR-ABL210融合基因的表达水平,具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势:
1、本申请试剂盒的最低检出量高:敏感度达102copies,且线性范围宽,可在102~1010copies的范围内进行定量。
2、本申请试剂盒特异性强:荧光探针和模板杂交的应用,并通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,故与传统的PCR技术相比,特异性大为提高。
3、本申请试剂盒稳定性好,因为域值设置在指数扩增期,各反应组分浓度相对稳定,CT值与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比,能更精确地反映起始模板的拷贝数。
4、本申请试剂盒的污染小:一般PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和紫外光进行观察,或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,且染色剂溴化乙锭对人体有害,这些繁杂的实验过程给污染和假阳性提供了机会。本申请试剂盒采用一步法逆转录,只须在加样时打开一次盖子,其后的过程完全是闭管操作,不需要逆转录后或PCR后处理,因此操作简便、省时、减少污染,避免了常规PCR操作中的诸多弊端。
下面结合具体实施例,进一步阐述本申请。应理解,这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
具体实施方式
本申请实施例涉及一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒,本申请实施例的试剂盒将荧光定量PCR和逆转录技术相结合,即RT-RQ-PCR技术,在将样本中的mRNA逆转录成cDNA同时,运用荧光定量PCR技术,采用一步法检测样本中BCR-ABL210融合基因的表达水平。本申请实施例的试剂盒只须在加样时打开一次盖子,其后的过程完全是闭管操作,不需要逆转录后或PCR后处理,因此操作简便、省时、减少污染,避免了常规PCR操作中的诸多弊端,具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。
同时,本申请实施例的试剂盒还使用尿苷酶(UNG)防污染体系,经加热可选择性地降解U-DNA,以防止先前PCR扩增产物的污染;采用内参基因,控制整个试剂盒检测过程的有效性。
并且,本申请实施例的试剂盒还采用两套参考品标准曲线对目的基因和内参基因的进行分别定量以达到精准比值。
具体的,本申请实施例的试剂盒具体如表2所示:
表2
其中,混合酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份,RT酶0.25~0.45体积份,Rnasin 0.2~0.3体积份;优选为Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份,RT酶0.375体积份,Rnasin 0.25体积份;
对照酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份;优选为对照酶液中含有Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份;
其中,UNG酶的活性单位为1U/μl,Taq酶的活性单位为5U/μl,RT酶的活性单位为200U/μl。
具体的,引物和探针的核苷酸序列具体如表3所示:
表3:
具体的,质粒DNA的核苷酸序列具体如表4所示:
表4
本申请试剂盒的使用方法为:
1、样本处理
本申请试剂盒采用阴性对照、阳性对照与标本同时处理,具体的处理步骤为:
采用Trizol方法抽提RNA,具体步骤如下:
1.1取保存在Trizol里的标本500μl,加入500μl氯仿,混匀,室温放置5分钟;15000rpm离心10分钟,离心后吸取无色上清液。
1.2在上述上清中加入等体积预冷的异丙醇,颠倒混匀后室温放置10分钟;15000rpm离心10分钟,吸弃上清。
1.3在上述离心管中,加入300μl预冷的70%乙醇,15000rpm离心5分钟,吸弃上清;室温10分钟,使乙醇挥发。
1.4加入200μl DEPC-ddH2O混匀溶解,以此作为相关PCR反应的模板。
2、扩增试剂准备:
从试剂盒中取出各种BCR-ABL PCR反应液、内参PCR反应液、BCR-ABL PCR参考品反应液、内参参考品反应液、混合酶液和对照酶液,室温融化并振荡混匀后,短暂离心数秒;
其中:BCR-ABL PCR反应液、内参PCR反应液体系1人份均按如下配制:
8μl BCR-ABL PCR反应液+2μl混合酶液(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个阳性对照之和),得到BCR-ABL PCR预混液;
8μl内参PCR反应液+2μl混合酶液(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个阳性对照之和),得到内参PCR预混液;
参考品PCR反应液体系1人份按如下配制:
8μl BCR-ABL PCR参考品反应液+2μl对照酶液(PCR管数应为4个参考品),得到BCR-ABL PCR参考品预混液;
8μl内参参考品反应液+2μl对照酶液(PCR管数应为4个参考品),得到内参参考品预混液。
将上述配制好的预混液,分别按每管10μl的量,分装于各PCR管内。
3、加样:
从各参考品和样本(包括阴性对照、阳性对照)处理液中分别取15μl,加至装有上述相应PCR预混液的PCR管中,盖紧管盖、将其移至检测区。具体见下表5和6:
表5
表6
4、PCR扩增:
4.1扩增条件
ABI7500荧光PCR检测仪扩增条件:42℃,30min;94℃,5min;(94℃,15sec;60℃,60sec)40个循环。反应体系为25μl。
在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。
4.2检测通道和参比荧光
ABI系列荧光PCR检测仪检测通道为:FAM-TAMRA,参比荧光设定为none。
5.检测:
(1)基线的确定:软件默认设定3~15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中,一般选择曲线波动较小,较稳定的那段作为基线,用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高,设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方,终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。依据实验曲线走势的不同,一般start值可选择在3~12之间;stop值选择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则,以更好满足统计基线标准偏差的数学要求。
(2)阈值的确定:在阴性对照无扩增的情况下,阈值设定在无扩增曲线样本的最高点,即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点,且阴性对照未检出为原则,确定起始阈值。
(3)注意:对于同一个标本,需同时进行阴性、阳性对照及参考品标准曲线的分析,并且目的基因和内参基因反应液应使用相同的基线和阈值进行分析。
下面通过具体实施例进一步说明本申请,如无特殊说明,本申请所用到的原料均为市售原料。
实施例1
一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒(20测试/份),其组成如表7所示:
表7:
其中,UNG酶的活性单位为1U/μl,Taq酶的活性单位为5U/μl,RT酶的活性单位为200U/μl。
试剂盒各组分的包装及含量如表8所示:
表8:
品名 | 管子类别 | 标识体积(/管) | 实际分装体积(/管) |
BCR-ABL PCR反应液 | 1.5ml紫色盖螺旋管 | 160μl | 170μl |
BCR-ABL PCR参考品反应 | 1.5ml橘色盖螺旋管 | 160μl | 170μl |
内参PCR反应液 | 1.5ml灰色盖螺旋管 | 160μl | 170μl |
内参参考品反应液 | 1.5ml褐色盖螺旋管 | 160μl | 170μl |
混合酶液 | 1.5ml黄色盖螺旋管 | 80μl | 90μl |
对照酶液 | 1.5ml白色盖螺旋管 | 80μl | 90μl |
阳性对照 | 1.5ml红色盖螺旋管 | 500μl | 600μl |
阴性对照 | 1.5ml绿色盖螺旋管 | 500μl | 600μl |
210参考品1:1×10<sup>6</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
210参考品2:1×10<sup>5</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
210参考品3:1×10<sup>4</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
210参考品4:1×10<sup>3</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
内参参考品1:1×10<sup>6</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
内参参考品2:1×10<sup>5</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
内参参考品3:1×10<sup>4</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
内参参考品4:1×10<sup>4</sup>copies | 0.6ml无色压盖管 | 80μl | 100μl |
实施例2:本申请试剂盒的准确性检测
采用实施例1的试剂盒对准确性参考品进行检测:
其中,准确性参考品的配制方法如表9所示:
表9
将制备得到的准确性参考品重复实验3次,得到的实验结果如表10所示:
表10
本申请的试剂盒检测包括含BCR-ABL-210阳性外周血细胞裂解物和质粒的准确性质控品样本,其阳性符合率为100%。
实施例3:本申请试剂盒的分析特异性检测
采用实施例1的试剂盒对特异性参考品进行检测:
其中,特异性参考品的配制方法如表11所示:
表11
编号 | 配制方法 |
N1 | BCR-ABL阴性外周血细胞裂解物,用Trizol稀释至5×10<sup>4</sup>cells/ml |
N2 | HL60细胞株裂解物,用Trizol稀释至5×10<sup>4</sup>cells/ml |
N3 | Jurket细胞株裂解物,用Trizol稀释至5×10<sup>4</sup>cells/ml |
将制备得到的分析特异性参考品重复实验3次,得到的实验结果如表12所示:
表12
本申请的试剂盒检测包括BCR-ABL-210阴性外周血细胞裂解物,BCR-ABL-210阴性细胞株裂解物特异性工作参考品样本,其阴性符合率为100%。
实施例4:本申请试剂盒的精密度检测
采用实施例1的试剂盒对精密度参考品进行检测:
其中,精密度参考品的配制方法如表13所示:
表13
编号 | 配制方法 |
JK1-10 | K562细胞株裂解物(浓度为3×10<sup>4</sup>cells/ml) |
将制备得到精密度参考品的每一批做10个孔,重复实验3次;得到的实验结果如表14所示:
表14
本申请的试剂盒对各精密度质控品,在相应的反应液中重复做10次,均能检出,且其实验数据CV值≤5%。
实施例5:本申请试剂盒的最低检出量检测
采用实施例1的试剂盒对最低检出量参考品进行检测:
其中,最低检出量参考品的配制方法如表15所示:
表15
编号 | 配制方法 |
BCR-ABL-LK | BCR-ABL质粒DNA(相当于100拷贝/反应的RNA量) |
将制备得到的最低检出量重复实验3次,得到的实验结果如表16所示:
表16
编号 | 第一批 | 第二批 | 第三批 |
BCR-ABL PCR反应液 | 34.37 | 33.99 | 32.06 |
本申请的试剂盒对最低检出量参考品进行检测,证实本申请试剂盒的最低检出量为100拷贝/反应。
本申请虽然以较佳实施例公开如上,但并不是用来限定权利要求,任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下,都可以做出若干可能的变动和修改,因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒及其使用方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
<210> 7
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
<210> 8
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
<210> 9
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
<210> 10
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
<210> 11
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Claims (10)
1.一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括核酸扩增试剂,所述核酸扩增试剂包括BCR-ABL PCR反应液、内参PCR反应液和混合酶液;
其中,所述BCR-ABL PCR反应液、所述内参PCR反应液和所述混合酶液分别包括以下组分:
其中,所述用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:1所示的上游引物;由SEQ ID NO:2所示的下游引物;由SEQ ID NO:3所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
所述内参PCR反应液用于控制检测的有效性,所述用于检测内参基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:4所示的上游引物;由SEQ ID NO:5所示的下游引物;由SEQ ID NO:6所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA;SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸扩增试剂中还包括以下组分:
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸扩增试剂中还包括以下组分:
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括对照品,所述对照品包括:
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括参考品,所述参考品用于对目的基因和内参基因进行定量,所述参考品包括:
其中,BCR-ABL-210-b2a2质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,BCR-ABL-210-b3a2质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,BCR-ABL-190质粒DNA的核苷酸序列如SEQID NO:9所示,BCR-ABL-230质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;
内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒所适用的样本选自外周血标本或骨髓标本。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述混合酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份,RT酶0.25~0.45体积份,Rnasin 0.2~0.3体积份;所述对照酶液中含有Taq酶0.6~0.9体积份,UNG酶0.1~0.3体积份;
优选的,所述混合酶液中含有Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份,RT酶0.375体积份,Rnasin 0.25体积份;所述对照酶液中含有Taq酶0.8体积份,UNG酶0.2体积份;
其中,UNG酶的活性单位为1U/μl,Taq酶的活性单位为5U/μl,RT酶的活性单位为200U/μl。
9.一种检测人BCR-ABL融合基因的引物和探针,其特征在于,包括用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针和用于检测内参基因的引物和探针:
所述用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:1所示的上游引物;由SEQ ID NO:2所示的下游引物;由SEQ ID NO:3所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
所述用于检测内参基因的引物和探针为:含有由SEQ ID NO:4所示的上游引物;由SEQID NO:5所示的下游引物;由SEQ ID NO:6所示的探针,所述探针的两端标记有荧光基团;
优选的,SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA;SEQ IDNO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。
10.一种如权利要求1~8任一项所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,至少包括以下步骤:
(1)样本处理:
提取RNA,得到样本;
(2)扩增试剂配制:
将BCR-ABL PCR反应液与混合酶液混合、将内参PCR反应液与混合酶液混合、将BCR-ABLPCR参考品反应液与对照酶液混合、将内参参考品反应液与对照酶液混合,得到相应的PCR预混液;
(3)加样:
从样本、阴性对照、阳性对照、BCR-ABL PCR参考品1~BCR-ABL PCR参考品4、内参参考品1~内参参考品4中分别取样,加入到相应的PCR预混液中,
(4)PCR扩增;
(5)检测。
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