CN108315427A - 一种检测肿瘤kras基因g12d的引物探针组合物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测KRAS基因G12D的引物探针组合物及其检测方法，所述引物探针组合物包括针对KRAS基因G12D位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对KRAS基因G12D位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对KRAS基因G12D位点的特异性引物SEQ ID NO.3‑4，通过针对G12D位点特定区域进行设计引物并修饰探针，二者相互匹配，并将ddPCR与高特异性的引物探针组合物相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，各步骤协同增效，最终提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种检测肿瘤KRAS基因G12D的引物探针组合物及其检测方法

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种检测肿瘤KRAS基因G12D的引物探针组合物及其检测方法。

背景技术

KRAS基因是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，该基因编码的蛋白质与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系。KRAS基因在各种肿瘤中突变概率很高，常见突变位点为KRAS基因2号外显子的12号密码子和13号密码子。研究表明，KRAS基因的突变导致细胞逃逸凋亡，无限增殖。在正常情况下，当细胞受到外界刺激后，生长因子等信号通路被激活，KRAS被激活的生长因子磷酸化后短暂活化，进而激活该信号通路中的下游信号蛋白，调控细胞生长增殖，而后KRAS基因失活；当KRAS基因发生异常时，则不受上游生长因子的调控，从而导致下游细胞持续增殖，并阻止细胞凋亡。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30％，在结直肠癌患者中为20-50％。KRAS基因突变状态直接影响EGFR(表皮生长因子)靶向治疗药物的疗效。KRAS基因野生型患者能从此类药物治疗中获益，而KRAS基因突变的结直肠癌患者治疗效果较差。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物治疗转移性大肠癌患者前必须检测KRAS基因的基因型。中国卫生部公布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也规定转移性结直肠癌患者在接受EGFR靶向药物之前须进行KRAS突变检测。

在肿瘤治疗中，传统化疗主要针对细胞的DNA，这种作用往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也错杀了很多正常细胞。一种新兴治疗手段，靶向治疗则和以前的化疗完全不同，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。肿瘤的发病有多种机制参与，而这些机制往往是肿瘤细胞所特有的。靶向治疗就是针对肿瘤发病机制中某特有的信号传导通路或者某一发病机制，采用单克隆抗体、小分子物质将它打断，从而达到治疗肿瘤的目的，而对正常细胞作用却很轻微。而靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；而肿瘤细胞是有多样性的，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点(因人而异)，因此对于某些特定的靶向药物，在使用前检测患者体内是否有符合条件的基因，判断其肿瘤细胞上是否有符合条件的位点，就可以预知该药物是否会奏效，这从临床上节省了金钱和时间。这样的诊断模式被称为“个体化诊断”。对于靶向药物来说，使用前进行“个体化诊断”是保证安全、有效用药的必要步骤。

目前，KRAS基因突变检测技术主要有测序技术和定量PCR技术两大类：测序技术中包含一代测序即sanger测序技术和新一代测序技术也称为二代测序技术。其中一代测序技术一般一次只能检测一个位点一个样本，检测通量低且耗时长，并且一代测序只能准确检测某个基因位点纯合(100％)或杂合突变(50％)的突变比例；而二代测序技术，检测通量高，但是检测前有复杂的样本处理及测序文库建立过程，检测后有复杂的生物信息学分析过程，整个检测周期很长，且一般5％-10％以下的突变比例检测如果测序深度不够，会影响检测结果准确性，如果加大测序深度，则二代测序成本会提高很多。近几年来，液体活检出现在公众的视野之中，《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一，可以实现稀有变异和拷贝数变异的检出，灵敏度高。

循环肿瘤DNA(ctDNA)，是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于基因分型和肿瘤发展状态及预后的无创检测。ctDNA是游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的一种，最早应用于产前胎儿性别的判断和筛查唐氏综合征等发育性疾病。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓慢，原因是ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。随着癌症的疾病进展，ctDNA在血液中的含量也随之升高，液体活检技术在超早期就能对血液中含有的极微量的ctDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断及相关突变提供参考依据，这对癌症的早期发现是一次革命性的进步。

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术作为第三代PCR技术，是在传统PCR方法基础上采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与实时荧光定量PCR相比，无需构建标准曲线，不受扩增效率的影响，其结果具有更高的精确度、准确性和灵敏度。微滴数字PCR的核心是能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，其中每个微滴中含有或不含一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度和拷贝数，以绝对定量的方式直接计算出靶分子的个数。

CN105838778A提供了一种ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法，及其在监控帕尼单抗/西妥昔单抗治疗结直肠癌过程中的应用，该发明首先对结直肠癌患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中KRAS的耐药突变位点G13D的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。CN107488727A提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。该引物探针组合物包括：检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。但上述技术灵敏度低，操作步骤复杂繁琐，费时费力，检测效率较差。

据美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(V1.2015)明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也明确指出：确定为复发或转移性结直肠癌时，检测肿瘤组织KRAS基因状态，以确定合适的治疗方案。目前市场上针对癌症的基因检测技术主要是FISH、ARMS、一代测序技术或者是二代高通量测序技术。这些检测手段都存在很多弊端，例如：全基因组或者全外显子组的检测，虽然检测内容丰富，但是成本高，而且检测出来的绝大多数信息与患者对应的癌症无关；FISH检测结果的准确性高度依赖于检测人员的经验和技能；二代高通量测序检测步骤繁琐，工作量较大，检测周期较长，仅用于检测1-2个基因位点的突变信息费用较高。因此迫切需要针对肿瘤一个或两个位点进行分析，检测开发一种快速、便捷、准确、经济的检测技术，以便实现靶向治疗动态实时监测。

综上，现有技术检测KRAS基因存在诸多问题，而基于循环肿瘤DNA检测技术现已成为焦点，ddPCR技术可以实现低投入、高灵敏度、高准确性的突变DNA检测，研发一种检测KRAS基因G12D位点突变的ddPCR检测方法及检测探针引物组合物，能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险，具有广阔的应用前景和市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测肿瘤KRAS基因G12D的引物探针组合物及其检测方法，所述引物探针组合物针对KRAS基因G12D位点特定区域进行设计并修饰，引物和探针相互匹配，并优化检测方法，各步骤协同增效，提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测KRAS基因G12D的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括针对KRAS基因G12D位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对KRAS基因G12D位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对KRAS基因G12D位点的特异性引物SEQ ID NO.3-4。

SEQ ID NO.1为5’-TGGAGCTGATGGCGTAGGCA-3’；

SEQ ID NO.2为5’-AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA-3’；

SEQ ID NO:3为5’-TGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCA-3’；

SEQ ID NO:4为5’-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’。

优选地，所述探针的3’端带有小沟结合物-非荧光性淬灭基团修饰；

优选地，所述探针的5’端带有荧光基团修饰；

优选地，所述野生型探针的荧光基团与突变型探针的荧光基团不同。

本发明中，小沟结合物为Minor Groove Binders，简称为MGB。

本发明中，所述非荧光性淬灭基团为Non-Fluorescent Quencher，所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。

本发明中，所述荧光基团包括FAM基团、TEX基团、TET基团或JOE基团，优选为FAM基团和HEX基团，FAM基团即羟基荧光素，绿色荧光，是荧光素衍生物的一种，和其他荧光素衍生物相比，FAM与氨基反应更快，产物更稳定，使用更加普遍；HEX基团即六氯6甲基荧光素，是在FAM基团上加以改进的，减弱了pH敏感性，FAM和HEX荧光基团配合使用常被用于DNA测序，PCR产物定量和核酸探针等。

本发明中，针对KRAS基因G12D突变位点上下游的特定区域，设计了PCR上下游引物和高特异性的突变型检测探针和野生型检测探针，通过选择KRAS基因的特定区域作为设计模板，优化对探针的修饰，在探针3’端采用非荧光性的淬灭基团，并在3’端连接小沟结合物，筛选与探针匹配性更高的引物，引物和探针相片匹配，协同增效，最终提高了检测的灵敏度和准确性，可以对KRAS基因G12D位点突变进行准确检测，并能检测出低频突变。

第二方面，本发明提供一种检测KRAS基因G12D的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品的cfDNA；

(2)配制包含第一方面所述的引物探针组合物的反应体系后加入步骤(1)得到的cfDNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果。

本发明采用针对肿瘤KRAS基因G12D位点设计的1对引物和2条荧光探针对微量cfDNA进行PCR扩增和检测，然后对探针荧光信号值进行数据分析，获得准确的KRAS基因G12D位点信息，其检测结果用于分析和判断靶标基因的突变信息，并为患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。

优选地，步骤(1)所述样品包括石蜡包埋病理切片组织或外周血浆，优选为外周血浆。

优选地，步骤(3)所述ddPCR的条件为：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

外周血中的ctDNA含量很低，比例约为1/1000，因此保证血浆cfDNA提取质量至关重要。

优选地，步骤(1)所述提取样品cfDNA的具体步骤如下：

(1’)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离；

(2’)采用两步纯化法对步骤(1)分离得到的血浆抽提cfDNA。

优选地，在cfDNA提取过程中不加入carrier RNA。

优选地，步骤(1’)所述分离的步骤为：将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心转速为1200-1800g，例如可以是1200g、1400g、1600g或1800g。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心温度为0-4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min或12min。

优选地，步骤(2’)所述两步纯化法的步骤为：首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA。

优选地，步骤(3)所述分析的步骤包括使用微滴分析仪专用分析软件QuantaSoft，根据实验样本和对照样本所生成微滴荧光信号进行分析。在微滴分析仪运行完毕后进行结果分析，根据双通道和单通道检测微滴散点图所显示的微滴所在区域和微滴个数来确定荧光阈值、检测阈值以及阴、阳性结果判读和分析。

作为优选技术方案，一种检测KRAS基因G12D的方法，具体包括如下步骤:

(1)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离，将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃，其中，离心的条件为1200-1800g，0-4℃离心8-12min；

采用两步纯化法对二次离心后得到的血浆抽提cfDNA，首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cf DNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析所述检测结果，PCR反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

本发明通过对大量方法和试剂的筛选，改进血浆中cfDNA的提取方法，不需加入carrier RNA，采用两步醇沉的方法进行提取DNA，并将微滴数字PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，创造性的提出了一种实时、无创、精准、快速的肿瘤KRAS基因G12D位点的检测方法。

本发明中，优化后的KRAS基因G12D位点检测PCR反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

本发明的检测方法以外周血中极其微量的ctDNA为检测对象，通过微滴乳化技术，降低抑制剂的影响，从而降低背景噪声，使得检测方法的灵敏度和准确性大幅度提升，可为靶向用药提供关键的靶标突变位点信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间。

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面所述的引物探针组合物。

优选地，所述试剂盒还包括野生型标准品、阳性标准品和不含dUTP的ddPCR预混液。

本发明提供的试剂盒能应用于肿瘤检测试剂盒或癌症基因检测设备中，获得实时、准确的KRAS基因G12D位点的突变信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间，可用于肺癌、结直肠癌、胰腺癌等患者石蜡包埋病理切片组织或外周血浆cfDNA(cell-free DNA,游离DNA)中的KRAS基因G12D位点突变状态进行检测，为临床医生选择肿瘤靶向分子药物治疗和监测提供参考，具有绝对定量、检测周期短、高特异性、高准确性和高灵敏度等特点。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的引物探针组合物通过选择KRAS基因的特定区域作为设计模板，优化对探针的修饰，筛选与探针匹配性更高的引物，引物和探针相片匹配，协同增效，最终提高了检测的灵敏度和准确性，可以对KRAS基因G12D位点突变进行准确检测，可以定量分析低至0.001％的突变频率；在癌症靶向治疗过程中，为患者提供基因位点突变信息，为肿瘤个体化精准用药指导、药效评估以及疗效监测提供了重要的参考依据。

(2)本发明提供的检测方法，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，只需少量的外周血，并将微滴数字PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合，该方法具有无可比拟的精确性，并且可以做到绝对定量，不再需要标准曲线，检测周期短，检测方法的灵敏度和准确性大幅度提升，具有10,000×以上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.1％，可为靶向用药提供关键的靶标突变位点信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案。

附图说明

图1是本发明实施例2中20170726008-8样本提取的cfDNA的质控检测结果图；

图2是本发明实施例4中cfDNA样本G12D突变型位点检测一维结果图；

图3是本发明实施例4中cfDNA样本G12D野生型位点检测一维结果图；

图4是本发明实施例4中cfDNA样本G12D突变型、野生型位点检测二维结果图；

图5是本发明实施例4中cfDNA KRAS基因G12D位点突变阴性检测结果图，其中图5(A)为突变型检测结果图；图5(B)为野生型检测结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

本发明中涉及的名词解释如下：

荧光检测探针，是指针对癌症KRAS基因G12D的野生型位点和突变型位点设计的2条带有荧光基团、MGB基团和NFQ猝灭基团的探针，这2条捕获探针确保了G12D位点的野生型和突变型位点能够被准确的检测，不遗漏，也没有其它基因的干扰，保障了检测的精准。

“Carrier RNA”为一种是协助分离RNA的试剂，carrier RNA能特异吸附低浓度RNA，并且有助于降低提取过程中RNase对RNA的降解作用。然而，carrier RNA对于常规双链DNA的提取并无促进作用。

本文所用“血液”和“外周血”为相同概念。

PCR特异性扩增，是指利用PCR扩增的方法，对外周血中提取的极其微量的cfDNA进行癌症KRAS基因特定区域G12D位点的扩增。

实施例1试剂盒的组装

(1)探针和引物的设计：本发明针对KRAS基因G12D目标区域的上下游设计特异性引物；采用Taqman探针法进行设计，针对KRAS基因G12D突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针，具体如下：

针对KRAS基因G12D位点特异性引物具体如下：

SEQ ID NO:3为TGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCA；

SEQ ID NO:4为GGCCTGCTGAAAATGACTGAA；

突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与KRAS基因G12D突变型位点结合；

突变型探针具体序列如下所示：

G12D-TT：

SEQ ID NO.1为5’-FAM-TGGAGCTGATGGCGTAGGCA-MGB-NFQ；

野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与KRAS基因G12D野生型位点结合；

野生型探针具体序列如下所示：

G12D-WT：

SEQ ID NO.2为5’-FAM-AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA-MGB-NFQ；

所用的上下游引物和野生型、突变型检测探针由苏州泓迅生物科技有限公司合成；

(2)将上述引物探针组合物与阳性标准品(包含突变率为5％的强阳性标准品和突变率为0.1％的弱阳性标准品)、阴性对照(野生型标准品)、不含dUTP的ddPCR预混液、超纯水等组装成试剂盒。

实施例2提取cfDNA

1.取外周血2mL，并在获得血液的4h内进行处理，包括以下步骤：

(1)将外周血于1600g的转速下4℃离心10min，分离为血细胞和血浆(上清液)，血细胞于-80℃保存；

(2)将血浆样本进行第二次离心，16000g离心4℃10min，移取上清液转并移至保存管中，置于-80℃保存；

2.采用核酸提取或纯化(重鼎，ZD-YL-Midi-40)进行cfDNA提取，提取步骤如下：

(1)取洁净的10mL离心管，加入10μL蛋白酶K，再加入2mL步骤1收集的血浆和2mL溶液GH，漩涡混合15s，然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min；

(2)上述混合液中加入2mL异丙醇(血浆：GH：异丙醇＝1:1:1)，充分漩涡混合(此步骤需在生物安全柜中进行)，置于4℃冰箱中孵育10min，将混合液移入套有收集管的中量离心柱后10000rpm离心1min，弃去收集管中废液(此步骤需在生物安全柜中进行)；

(3)向离心柱中加入2.5mL溶液W1A(按照要求加入无水乙醇)，然后10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回；

(4)向离心柱中加入4mL溶液W2(按照要求加入无水乙醇)，10000rpm离心3min，去除废液；

(5)向离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，挥发残余乙醇；

(6)向离心柱中加入提前预热的450μL TE溶液，室温静置5min后，10000rpm离心3min；

(7)弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5-10min；

(8)取微量离心柱(套有收集管)，将700μL混匀液移入微量离心柱中，封盖离心，转速13000rpm离心30s，弃废液，重复操作，直至混匀液全部过柱；

(9)12000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇；

(10)将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入溶液纳滤水(50～60℃预热，提高洗脱效率)43μL，室温静置5min后离心，转速13000rpm离心2min；

(11)将离心下来的溶液重新移入离心柱内，将离心柱放在离心管中，开盖室温静置2min，13000rpm离心3min；

3.采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200 TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小，质控结果见图1，图中可以清晰看见，样本cfDNA片段大小主要集中在140-250bp之间，符合cfDNA质控标准。。

实施例3 KRAS基因G12D位点检测

配制反应体系：

(1)探针和引物的设计：本发明针对KRAS基因G12D目标区域的上下游设计特异性引物；采用Taqman探针法进行设计，针对KRAS基因G12D突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针，具体如下：

针对KRAS基因G12D位点特异性引物具体如下：

SEQ ID NO:3为TGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCA；

SEQ ID NO:4为GGCCTGCTGAAAATGACTGAA；

突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与KRAS基因G12D突变型位点结合；

突变型探针具体序列如下所示：

G12D-TT：

SEQ ID NO.1为5’-FAM-TGGAGCTGATGGCGTAGGCA-MGB-NFQ；

野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与KRAS基因G12D野生型位点结合；

野生型探针具体序列如下所示：

G12D-WT：

SEQ ID NO.2为5’-FAM-AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA-MGB-NFQ；

所用的上下游引物和野生型、突变型检测探针由苏州泓迅生物科技有限公司合成；

本实施例的检测采用的KRAS基因G12D位点突变型荧光检测探针和野生型荧光检测探针属于深圳市海普洛斯生物科技有限公司自主研发设计。突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团；这种探针在退火时与KRAS基因G12D突变型位点结合；野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团；这种探针在退火时与KRAS基因G12D野生型位点结合；因为FAM基团和HEX基团的所用激发波长不一样，检测系统可以很好的区分两者的荧光信号值，从而计算出检测样本KRAS基因G12D位点的突变率。

(2)按照表1配置PCR反应体系(先不加DNA模板)，12μL/管进行分装。该阶段在试剂准备区完成，将配制好的反应体系转移至样本制备区；

表1 PCR反应体系的配制

(3)向分装好的PCR反应体系中加入DNA模板，反应体系共20μL，该阶段在样本制备区完成，模板添加顺序依次为：空白对照、阴性对照、受检验样本、弱阳性对照、强阳性对照；

空白对照组：8μL无菌水，封闭PCR管；

阴性对照组：4μL野生型标准品(1.25ng/μL)和4μL无菌水；

弱阳性对照组：4μL(5ng/μL，0.1％突变率)弱阳性标准品和4μL无菌水；

样本检测组：无菌水稀释的受检样本，8μL；

强阳性对照组：4μL强阳性标准品(0.25ng/μL，5％突变率)和4μL无菌水。

(4)各体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区；

2.ddPCR检测阶段(在ddPCR检测区完成)

(1)制备微滴

A.取出微滴生成卡，按操作要求组装，在Oil加样孔中加入油，70μL/孔；

B.在Sample加样孔中加入20μL上述反应体系，盖上封条，于微滴生成器中反应。由于微滴生成时，Oil孔与sample孔不能为空，故空白的Oil孔加入70μL油，Sample孔用25μL水代替；

(2)PCR扩增

A.用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内(吸取和转移微滴时需缓慢操作，防止产生气泡，单次操作用时约5s)；

B.用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s。

C.完成封膜后，将96孔板置于梯度扩增仪(T100 Thermal Cycler)进行PCR反应，PCR条件如下：

KRAS基因G12D位点检测PCR反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存；

(3)微滴检测

将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测；微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析。

实施例4 KRAS基因G12D位点检测荧光信号的读取和数值分析

1.KRAS基因G12D位点荧光信号的读取

(1)打开QuantaSoft软件，导入样本检测数据，选择Analyze模块开始对数据进行分析；

(2)首先需要确认所有样本类型的微滴生成数要在10000以上，只有在这个范围内检出的数据的CV值能控制在1.6％以内，然后选择1D Amplitude，确定突变型探针和野生型探针的荧光阈值，以空白对照组和野生型对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值，结果见图2和图3所示；

图2、图3说明本发明设计的KRAS基因G12D位点探针具备良好的特异性，能明显区分出野生型微滴和突变型微滴；

(3)QuantaSoft软件会根据泊松分布计算每个样本20μL反应体系所含的模板拷贝数。利用FAM拷贝数/(FAM拷贝数+HEX拷贝数)计算出G12D突变率，结果见表2；

表2结直肠癌样本20170726008-8 KRAS G12D检测结果

本实施例对结直肠癌患者的样本的ctDNA进行检测，模板投入量均约为10ng，检测结果显示，20170726008-8样本中KRAS基因2号外显子G12D位点发生了突变，突变率为1.1％，突变检测结果见图4，阴性检测结果如图5所示，检测重复次数大于三次，结果完全一致，表明本发明提供的检测方法真实有效；根据所划定探针阈值，将2D强度图分为四个区域，左上区显示的是G12D位点突变的阳性微滴，左下区域显示的是阴性微滴，右上区显示的是野生型和突变型的微滴，右下区显示的是野生型DNA阳性微滴，存在KRAS基因G12D位点突变的癌症患者，不能从EGFR靶点的靶向治疗中受益，这其中包括西妥昔单抗、帕尼单抗(EGFR单抗)和厄洛替尼、吉非替尼等(EGFR-TKI)等。目前还没有批准针对KRAS基因突变的靶向药，阻断其下游的信号通路MEK是目前策略之一，可联合使用靶向MAPK和PI3K信号通路的多个基因的多种治疗药物。

综上所述，本发明提供的引物探针组合物和肿瘤KRAS基因G12D位点检测方法，通过针对G12D位点特定区域进行设计引物并修饰探针，二者相互匹配，并将ddPCR与高特异性的引物探针组合物相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，各步骤协同增效，最终提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度，可以从微量的cfDNA中检测出ctDNA；采用本发明提供的技术方案，抽取5-10mL外周血液，通过对ctDNA的检测分析，动态评估癌症发展变化，制定精准医疗方案，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响；并且，本发明的检测优化方法可以准确的检测出靶向药物相关的KRAS基因G12D位点，具有10,000×以上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.1％；并且能够检测点突变、插入缺失、基因融合，基因拷贝数变化等基因变异信息，给出最精准的用药指导信息，这为个体化精准用药指导提供了重要的参考依据，具有广阔的应用前景和市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司

<120> 一种检测肿瘤KRAS基因G12D的引物探针组合物及其检测方法

<130> 2018年

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tggagctgat ggcgtaggca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agctggtggc gtaggcaaga 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgattctgaa ttagctgtat cgtca 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggcctgctga aaatgactga a 21

Claims (10)

1.一种检测KRAS基因G12D的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括针对KRAS基因G12D位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对KRAS基因G12D位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对KRAS基因G12D位点的特异性引物SEQ ID NO.3-4。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的3’端带有小沟结合物-非荧光性淬灭基团修饰；

优选地，所述探针的5’端带有荧光基团修饰；

优选地，所述野生型探针的荧光基团与突变型探针的荧光基团不同。

3.一种检测KRAS基因G12D的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样品的cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cfDNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品包括括石蜡包埋病理切片组织或外周血浆，优选为外周血浆；

优选地，步骤(3)所述ddPCR的条件为：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取样品cfDNA的具体步骤如下：

(1’)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离；

(2’)采用两步纯化法对步骤(1)分离得到的血浆抽提cfDNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的步骤为：将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的离心转速为1200-1800g；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心温度为0-4℃；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心时间为8-12min。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2’)所述两步纯化法的步骤为：首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离，将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃，其中，离心的条件为1200-1800g，0-4℃离心8-12min；

采用两步纯化法对二次离心后得到的血浆抽提cfDNA，首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cf DNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果，其中，ddPCR的条件为：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的引物探针组合物；

优选地，所述试剂盒还包括野生型标准品、阳性标准品和不含dUTP的ddPCR预混液。