CN108929908A - 一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法 - Google Patents

一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于数字PCR平台c‑MET基因Exon14跳读的检测方法。这一方法是基于ABI QuantStudio™3D数字PCR系统对c‑MET基因Exon14跳读进行突变检测，利用MGB探针特异性的区分样本在c‑MET基因Exon14是否发生跳读，能够同时在低丰度和低灵敏度的样本中得到很好的检测结果，实验可重复性能好，误差小，是检测低丰度地突变比例的优势技术。

Description

一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测方法技术领域，具体涉及一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法。
背景技术
在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应方法分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，与qPCR相比，ddPCR具有许多优点，比如灵敏性高，无需标准曲线以及不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，就能获得绝对定量。ddPCR可以检测到0．001％的突变，这较qPCR灵敏性增加了1000倍。qPCR耗费劳力和试剂，依赖于荧光信号，完全依赖标准曲线，并使用循环阈值(cycle threshold，Ct)作为衡量标准。然而许多因素会影响ct值，从而影响了QPCR的定量。更重要的是，qPCR最高分辨在1．5倍左右，因而不适合用于低丰度的拷贝数的检测。而目标miRNA，由于标准曲线难以制备，很难对其定量。已有研究揭示ddPCR在石蜡包埋样品中可以检测基因组扩增的独特临床应用潜力。样本在石蜡包埋固定的过程中会导致样品DNA不可逆的损坏，而且基质中的正常细胞可能会干扰肿瘤特异性基因组扩增是否存在的检测，使得DNA分析技术面临挑战。研究者对DNA高度降解的石蜡包埋样本应用了ddPCR检测，观察能否在石蜡包埋样本中检测HER 2的扩增 ，他们提取石蜡包埋乳腺癌组织DNA中的HER 2，10／39个样本被确定为阳性，其余29个样本被认为是阴性，这与HER 2荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH)及免疫组化结果完全一致。这意味着ddPCR可以更精确、更客观的在石蜡包埋样本的DNA水平检测HER一2的拷贝数。另一项研究显示 ，由于FGFR2抑制剂已在肿瘤治疗中进入了临床应用，因而FEFR2基因检测至关重要。研究者们证实了ddPCR在检测FGFR2扩增的准确性和灵敏度，在混入了1000倍的野生型分子的背景下检测石蜡包埋样本中FGFR2扩增数目，ddPCR测定FGFR2扩增为7倍，在qPCR测定为35倍，而实际上利用快速冷冻样品测定，证实是6倍的扩增。在肿瘤的进展或治疗过程中基因的扩增状态可能改变，这对个体化治疗是一个挑战. 随着肿瘤生物标记物的研究越来越深入，对基因状态精确和及时的探知也是人们越来越感兴趣的领域，对基因状态的准确获取有利于个体化治疗药物选用。数字PCR在低丰度目标基因检测较定量PCR更精确 ，在未来有更广泛的应用前景。
c-MET原癌基因位于人类第7号染色体上，大小超过120kb，包含21个外显子和20个内含子。c-MET原癌基因编码一种肝细胞生长因子(HGF)受体，属于受体型络氨酸蛋白激酶，在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达，其持续激活是组织细胞癌变或癌细胞增殖亢进的重要原因。c-MET与HGF结合之后，靠近胞内的4个磷酸化位点的络氨酸残基发生自生磷酸化，激活PI-3K、ERK1/2、PLC-Y、STAT和FAK等重要的细胞信号通路，促进细胞增殖、扩散、迁移及侵袭能力。在非肿瘤细胞中，c-MET/HGF信号通路是受到严密调控的，c-MET通过泛素化作用在多泡小体内被降解。基因突变、基因扩增和基因拷贝数增高等c-MET/HGF变异会导致下游信号通路延长，促进肿瘤发生及生长。c-MET外显子14剪接位点的突变会导致基于RNA剪接的外显子14跳读，外显子14编码膜旁区域和与E3泛素连接酶CBL结合部位——Y1003残基。外显子14跳读将导致CBL无法与之结合，从而c-MET泛素化程度降低，延迟c-MET的降解过程。此外，外显子14跳读还会延长c-MET/HGF下游信号通路MAPK等，促进肿瘤发生和生长。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，应用数字PCR平台的低丰度检出率、高灵敏度、高特异性的优势，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法：所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、c-MET基因Exon14跳读区域正向和反向扩增引物、c-MET基因Exon14跳读区域标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
优选地，所述步骤（1）中设计的c-MET基因Exon14跳读区域正向和反向扩增引物包括用于扩增c-MET基因Exon14跳读区域的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：1和一条反向引物SEQ ID Nos：2，正向引物SEQ ID Nos：1的序列为：CCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATC，反向引物SEQ ID Nos：2的序列为：TGCTCTTTAATTTGCTTTCTCTTTTTC。
优选地，所述步骤（1）中c-MET基因Exon14跳读区域标记TaqMan 探针包含一条可以特异性杂交c-MET基因Exon14跳读区域的探针SEQ ID Nos：3，探针SEQ ID Nos：3特异性杂交c-MET基因Exon14发生跳读后的扩增产物，即为突变型，SEQ ID Nos：3的序列为：TTCATGCCGACAAGT。
优选地，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：4和一条反向引物SEQ ID Nos：5，正向引物SEQ ID Nos：4的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQ ID Nos：5的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。
优选地，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQ ID Nos：6，探针SEQ ID Nos：6序列为：ATGGAGGTTTGAAGA。
优选地，其特征在于，c-MET基因Exon14跳读区域的探针SEQ ID Nos：3标记的荧光素为FAM。
优选地，内参基因B2M标记TaqMan 探针标记的荧光素为VIC。
优选地，所述步骤（3）的数字PCR扩增程序为：52℃反转录，45min；95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法在检测灵敏度方面较传统方法有显著的提高，以往传统的荧光定量PCR检测基因突变时最低可以检测到1%的突变比例，而本发明基于数字PCR平台开发的检测方法其最低检测比例可以达到0.1%，在突变比例低的检测需求中有很大的优势。
（2）本发明所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法具有绝对定量的优势，传统荧光定量PCR是属于相对定量的检测方法，需要根据标准曲线取计算出待测样本的浓度，而本法明基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法是一种绝对定量的检测方法，其检测结果中直接提示待检样本的浓度及对应的含有突变基因的样本的数量，从而统计出突变比例。
（3）本发明所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法操作简单，与传统荧光定量PCR技术的兼容性高，结果检测一致性好，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为sample-1的数字PCR检测结果图；
图2为sample-2的数字PCR检测结果图。
具体实施方式
以下通过结合下述具体实施方式进一步说明本发明。需要指出的是，以下具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于对本发明的内容进行限定。
一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、c-MET基因Exon14跳读区域正向和反向扩增引物、c-MET基因Exon14跳读区域标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
本发明所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法主要是基于数字PCR平台对c-MET基因Exon14跳读区域进行检测的方法。根据数字PCR的统计原理，本方法可以检测低丰度的样本量以及低突变比例的样本。首选是基于c-MET基因Exon14跳读区域的序列设计一对特异性扩增的引物对，这对引物特异性扩增发生了跳读的PCR产物，同时在该跳读区域设计一条15bp的TaqMan探针，分别通过与发生了跳读的区域的扩增产物进行杂交，得到荧光信号。进一步通过CCD成像技术对反应芯片进行信号收集，最终经过软件计算，利用泊松分布的统计原理对野生型探针信号和突变型探针信号进行数据统计计算，最终得到待检样本的浓度信息，突变比例信息。
本发明所涉及到的数字PCR平台为ABI QuantStudio™ 3D 数字PCR系统，所采用的实验试剂均为该平台配套的PCR扩增反应方法。
下面通过实施例进一步阐明本发明。需要指出的是，本发明并非仅局限于所述实施例。
实施例1
（1）病人样本RNA提取
在生物安全柜中对病人的肿瘤样本进行基因组RNA提取操作。采用miRNasy FFPE Kit(Qiagen Cat No: 217504)进行提取实验。
（2）引物设计
针对人c-MET基因Exon14跳读区域进行引物设计，分别针对这个位点设计一对特异性的PCR引物和一条FAM标记的杂交探针，用于杂交c-MET基因Exon14发生了跳读区域的扩增产物，同时根据内参基因B2M的序列设计一对扩增引物，同时用VIC标记杂交探针。所设计的PCR引物及探针序列如表1所示。
表1
引物名称 序列号 5'-3'
c-MET-F SEQ ID Nos 1 CCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATC
c-MET-R SEQ ID Nos 2 TGCTCTTTAATTTGCTTTCTCTTTTTC
c-MET-M SEQ ID Nos 3 FAM-TTCATGCCGACAAGT-MGB
B2M-F SEQ ID Nos 4 CACTGAATTCACCCCCACTG
B2M-R SEQ ID Nos 5 AAGCAGAATTTGGAATTCATCC
B2M-T SEQ ID Nos 6 VIC-ATGGAGGTTTGAAGA-MGB
（3）特异性PCR反应
利用特异性PCR技术扩增出包含c-MET基因Exon14跳读区域的目的片段，按照表2的反应方法配制扩增反应，反应方法配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。
表2
表3
（4）进行PCR芯片荧光信号读取：
PCR反应结束后，将芯片放入数据读取的卡槽，推入，仪器自动读取；屏幕显示读取时间结束后，可直接取出芯片，即可。若一次实验检测多个样本，则可以取出上一张芯片后直接放入下一张待读取的芯片，直至最后一张芯片读取结束后，一起分析之前读取的所有芯片。待所有芯片分析完全后，将数据导出至USB。
（5）数据分析和结果统计：
将PCR芯片检测数据导入至Thermo的云服务器上，利用云端处理软件，对检测数据进行分析。数据分析之前需要注册用户账号，完成注册流程后可以免费使用。
本实施例的分析结果如表4、表5和图1、图2所示。本实施例样本检测结果为突变比例1.175%(平均值)，分别进行两次重复实验，记为Sample-1和Sample-2，整张反应芯片的有效数据为14293/14160，其中突变型有效数据为33/29，野生型有效数据为2962/2838，与实际PCR上样量10 ng基本一致。
表4
Assay Sample Target/Total Copies/microliter (VIC) Copies/microliter (FAM)
FAMVIC Sample-1 1.21% 249.79 3.067
FAMVIC Sample-2 1.14% 242.43 2.802
表5
Sample #FAM #VIC #FAMVIC #Undetermined #NOAMP
Sample-1 33 2962 7 0 14293
Sample-2 29 2838 7 0 14160
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、c-MET基因Exon14跳读区域正向和反向扩增引物、c-MET基因Exon14跳读区域标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；
（2）制备数字PCR反应芯片；
（3）进行数字PCR扩增程序；
（4）进行PCR芯片荧光信号读取；
（5）数据分析和结果统计。
2. 根据权利要求1所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的c-MET基因Exon14跳读区域正向和反向扩增引物包括用于扩增c-MET基因Exon14跳读区域的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ IDNos：1和一条反向引物SEQ ID Nos：2，正向引物SEQ ID Nos：1的序列为：CCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATC，反向引物SEQ ID Nos：2的序列为：TGCTCTTTAATTTGCTTTCTCTTTTTC。
3. 根据权利要求1所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中c-MET基因Exon14跳读区域标记TaqMan 探针包含一条可以特异性杂交c-MET基因Exon14跳读区域的探针SEQ ID Nos：3，探针SEQ ID Nos：3特异性杂交c-MET基因Exon14发生跳读后的扩增产物，即为突变型，SEQ ID Nos：3的序列为：TTCATGCCGACAAGT。
4. 根据权利要求1所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID Nos：4和一条反向引物SEQ IDNos：5，正向引物SEQ ID Nos：4的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQ ID Nos：5的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。
5. 根据权利要求1所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQ ID Nos：6，探针SEQ ID Nos：6序列为：ATGGAGGTTTGAAGA。
6. 根据权利要求3所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，c-MET基因Exon14跳读区域的探针SEQ ID Nos：3标记的荧光素为FAM。
7. 根据权利要求5所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，内参基因B2M标记TaqMan 探针标记的荧光素为VIC。
8.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）的数字PCR扩增程序为：52℃反转录，45min；95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温。
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