CN106811517A - 一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人类c‑MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒，包括下列16条引物和探针：SEQ.ID NO 01‑SEQ.ID NO 16。所述引物和探针包括正向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针，以及反向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针，可以特异性的检测c‑MET基因外显子14跳读突变。本发明检测人类c‑MET基因外显子14跳读突变，特异性强，灵敏度高，可以检测低至10拷贝的突变，检测便捷，操作简单，检测速度快，临床应用范围广。

Description

一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及检测c-MET基因14外显子跳读突变的组合物及试剂盒。
背景技术
c-MET原癌基因位于人类第7号染色体上，大小超过120kb，包含21个外显子和20个内含子。c-MET原癌基因编码一种肝细胞生长因子(HGF)受体，属于受体型络氨酸蛋白激酶，在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达，其持续激活是组织细胞癌变或癌细胞增殖亢进的重要原因。c-MET与HGF结合之后，靠近胞内的4个磷酸化位点的络氨酸残基发生自生磷酸化，激活PI-3K、ERK1/2、PLC-Y、STAT和FAK等重要的细胞信号通路，促进细胞增殖、扩散、迁移及侵袭能力。在非肿瘤细胞中，c-MET/HGF信号通路是受到严密调控的，c-MET通过泛素化作用在多泡小体内被降解。基因突变、基因扩增和基因拷贝数增高等c-MET/HGF变异会导致下游信号通路延长，促进肿瘤发生及生长。
c-MET外显子14剪接位点的突变会导致基于RNA剪接的外显子14跳读，外显子14编码膜旁区域和与E3泛素连接酶CBL结合部位——Y1003残基。外显子14跳读将导致CBL无法与之结合，从而c-MET泛素化程度降低，延迟c-MET的降解过程。此外，外显子14跳读还会延长c-MET/HGF下游信号通路MAPK等，促进肿瘤发生和生长。
肺癌，作为全球头号癌症杀手，近年来其发病率在全球范围内仍呈持续上升的趋势，而这一趋势在中国尤其明显。据统计，目前我国每年大约有超过60万人死于肺癌。肺癌的发生、发展过程受遗传和环境两方面的影响，其中，基因变异是产生疾病的内因和基础。在我国，肺癌患者5年的生存率仅为13％，主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之配套的科学的治疗方案，从而使患者错失了最佳的治疗时机。
目前肺癌的主要治疗手段是化疗，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，且不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展及生物标志物的发现，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生的首选治疗方式。c-MET外显子14跳读突变为肺癌患者提供了新的治疗靶点。c-MET外显子14跳读突变主要发生在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中，突变率约为3％-4％(Nature，2014；Genome Res，2012；Nat Commun，2014)，尤其在肺肉瘤样癌(Pulmonary sarcomatoidcarcinoma，PSC)中突变率高达22％。
以c-MET为靶标的靶向治疗药物已有十多种，包括Crizotinib(Pfizer)，Cabozantinib(Exelixis)等小分子抑制剂，通过抑制c-MET络氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明，小分子抑制剂Crizotinib等对c-MET外显子14跳读突变患者疗效显著，肿瘤缩小60％之多，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测c-MET外显子14跳读突变情况是指导Crizotinib等c-MET靶向药物使用的前提和基础，通过高灵敏的检测方法检测c-MET外显子14跳读突变对于提高肺癌患者的生存率，延长生存期，避免过度化疗，提高生存质量有着重大意义。
目前，c-MET外显子14跳读突变的检测方法主要为直接测序法，然而，测序法从样本准备到测序结果解读，操作复杂，效率低，耗时长，需2天左右时间。且直接测序法检测灵敏度低，灵敏度只有20-30％，特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序几乎难以实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。c-MET外显子14跳读突变属于体细胞稀有突变，具有稀少性、不稳定性、异质性等特点，而多数突变检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，亟需开发一种高特异性和高灵敏度的c-MET外显子14跳读突变检测组合物，以实现对c-MET外显子14跳读突变的高灵敏检测，从而为临床个体化用药指导提供参考依据。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种用于c-MET外显子14跳读突变检测的引物和探针组合物，灵敏度高，特异性好，检测时间短，样本检测范围广，可以满足临床快速检测的实际需求。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种用于检测c-MET外显子14跳读突变的组合物，包括下列16条引物和探针：SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 16；其中，SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 06、SEQ.ID NO 09～SEQ.ID NO 12、SEQ.ID NO 14、SEQ.ID NO 15是引物；
SEQ.ID NO 07、SEQ.ID NO 08、SEQ.ID NO 13、SEQ.ID NO 16是探针。
所述序列SEQ.ID NO 01-SEQ.ID NO 08为正向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针；序列SEQ.ID NO 09-SEQ.ID NO 13为反向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针。
SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 16引物和探针序列如下：
表1 c-MET外显子14跳读突变特异性引物和探针核苷酸序列
本发明还提供一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的试剂盒，其包括如SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 16的16条引物和探针，其中，SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 06、SEQ.ID NO 09～SEQ.ID NO 12、SEQ.ID NO 14、SEQ.ID NO 15是引物；
SEQ.ID NO 07、SEQ.ID NO 08、SEQ.ID NO 13、SEQ.ID NO 16是探针；
还包括如下的实时荧光PCR反应体系：
本发明组合物以如下方法步骤进行应用：
(1)根据COSMIC数据公布的人类c-MET为野生型基因序列，针对c-MET外显子14跳读突变来设计ARMS引物和探针；
(2)提取检测样本的RNA，并反转录成cDNA；
(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系；反应体系如下：
(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。
本发明设计运用新型ARMS技术，利用引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，从而特异性扩增突变基因。本发明的引物设计原理如图1所示：WT为野生型序列，即exon14存在；Mutation为exon14跳读突变；设计正向跨exon14的ARMS引物F1或者反向跨exon14的ARMS引物F2，引物F13’末端落点在exon15上，避开起始与exon14重复的三个碱基ATC，直到exon15第四个碱基A做为引物的3’末端。这样，它就可以特异性的扩增exon14跳读突变，而不会扩增野生型。
因此，本发明有着优秀的特异性和灵敏度，对于人类c-MET外显子14跳读突变，灵敏度可以检测低至10拷贝的突变。
本发明组合物和试剂盒灵敏度高，特异性好，检测时间短，操作简单，样本检测范围广，可以满足临床快速检测的实际需求。
附图说明
图1是本发明引物设计原理示意图。
图2为本发明检测阳性质粒和野生型质粒PCR图。通过检测阳性质粒和野生型质粒，确定本发明的特异性。其中上扬的曲线为阳性质粒扩增曲线，没有上扬的曲线(在设定阈值以下)为野生型质粒扩增曲线。
图3为本发明灵敏度测试结果PCR图。通过对不同浓度的质粒进行检测，确定本发明的检测灵敏度。
图4为细胞系样本检测结果PCR图。检测阳性样本细胞系H596和野生型样本细胞系Calu-3，确定本发明检测的特异性。
图5为检测野生型临床样本PCR图。检测肺腺癌临床样本，确定本发明检测具体样本中的准确性。
图6为检测模拟阳性突变临床样本PCR图。检测由阳性细胞系H596与阴性临床样本混合所模拟的阳性突变样本，确定本发明在检测具体样本中的准确性。
具体实施方式
本发明以质粒pUC57为模板，通过基因工程构建突变质粒和野生型质粒。以此工程质粒作为反应模板，建立c-MET基因外显子14突变实时荧光PCR扩增反应体系，以FAM为信号检测通道，针对c-MET外显子14跳读突变来设计ARMS引物和探针，通过引物及检测体系的优化实现高度灵敏和高度特异的检测。检测c-MET外显子14跳读突变的方法包括以下步骤：
(1)针对跳读位点设计合成ARMS引物和探针：
根据COSMIC数据公布的人类c-MET为野生型基因序列，针对c-MET外显子14跳读突变来设计ARMS引物和探针。通过特异性ARMS引物和探针的优化，实现c-MET外显子14跳读突变高度灵敏和高度特异的检测。
基本原理：
本发明设计引物的基本原理是运用一种新型ARMS技术，利用引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，从而特异性扩增突变基因。如序列SEQ.ID NO02，即MET-F2：GAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAGATgA，其中3’端末位碱基A，是c-MET外显子14跳读后，外显子13与外显子15结合位点，利用Taq酶缺少3’-5’外切酶活性无法切除A进行校正，从而在野生型模板上无法扩增；只有c-MET外显子14跳读突变时，此引物才会有扩增，随着引物开始扩增延伸后，利用Taq酶的5′-3’外切酶活性切断探针上的FAM荧光基团，使得FAM荧光产生并被检测。另外，为了提高扩增特异性，在引物3’端额外引入一个错配碱基g，可以阻止非特异性扩增，并提高检测突变的灵敏度和准确性。
运用上述基本原理，设计c-MET外显子14跳读突变的ARMS引物和探针。应用primer3.0引物设计软件设计多对引物和多条探针，并用PrimerSelect软件优化引物和探针，引物和探针序列如表1所示。
(2)样本处理与RNA提取：
样本使用范围包括：冷冻或新鲜病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织以及细胞系。冷冻或新鲜病理组织，取10-20mg，用QIAGEN试剂盒RNeasy mini kit提取RNA。福尔马林固定石蜡包埋组织，切片5um厚，取2-3片组织，用QIAGEN试剂盒RNeasy FFEP kit提取RNA。细胞系使用用QIAGEN试剂盒RNeasy mini kit提取RNA。上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作。
(3)建立PCR扩增反应体系：
将上述所提RNA溶于RNase-free水中，经过微量分光光度计NanoDrop 8000测定其浓度，并进行质控，A260/A280在1.8-2.0之间。取2-7μl RNA作为模板，采用TAKARA试剂盒PrimeScript 1ststrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，包括如反转录反应体系及操作步骤：
(a)变性反应体系包括如下成分：
(b)反转录cDNA反应体系包括如下成分：
(c)变性反应混合液10μl，65℃保温5分钟后，迅速冰浴1分钟以上。将反转录cDNA反应混合液10μl加到变性反应混合液之中，用枪头吹打混匀，并30℃保温10分钟，42℃保温30-60分钟，95℃保温5分钟后，冰上冷却，加入RNase-free water稀释5倍，得到cDNA模板。
将上述所得cDNA模板，作为实时荧光PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增：
其PCR扩增体系如下：
其PCR扩增程序如下：37℃2min；95℃3min；95℃30s；62℃30s；72℃30s 15Cycles(不检测FAM荧光)；95℃30s；58℃30s；72℃30s 31Cycles(检测FAM荧光)。
(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判定的标准：
根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。
以下结合具体实施例，进一步对本发明进行阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本发明所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
本实施例以质粒检测本发明体系，通过基因工程构建的突变质粒模板(缺失c-MET外显子14)和野生型质粒模板(含c-MET外显子14)各1株。利用本发明实施荧光PCR检测c-MET外显子14跳读突变方法如下：
(1)质粒构建与处理：
根据COSMIC数据公布的人类c-MET为野生型基因序列，以缺失外显子14的c-MET序列作为突变序列，分别构建突变质粒和野生型质粒。两种质粒分别溶于超纯水中，用微量分光光度计NanoDrop 8000进行质控，并测定其浓度，然后调整质粒浓度到0.01pg/μl，即5000拷贝/μl，取2μl作为PCR模板进行PCR扩增。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得cDNA模板，作为实时荧光PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增：
其PCR扩增体系如下：
其PCR扩增程序如下：37℃2min，95℃3min，95℃30s，62℃30s，72℃30s 15Cycles(不检测FAM荧光)，95℃30s，58℃30s，72℃30s 31Cycles(检测FAM荧光)。
(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判定的标准：
采用Rotor-Gene Q实时荧光PCR仪进行扩增，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。质粒检测结果如图2。
灵敏度分析：取经过定量后浓度为5000拷贝的质粒样品，进行10倍梯度稀释，最低浓度为5拷贝/μl，然后分别取2μl质粒样品，以绝对数量10000、1000、100、10个拷贝作为模板进行PCR扩增。结果表明，本发明的ARMS荧光引物和探针的灵敏度高，10个拷贝DNA基因组即可检出，结果如图3。
重复性试验：每个反应分别加入10000、1000、100、10个拷贝质粒，设置3个重复，高于LOD的重复实验之间检测Ct值相差小于1。
检测结果表明，本发明的检测体系可以特异性检测质粒c-MET外显子14跳读突变，且检测灵敏度可达5-10拷贝。
实施例2
运用本发明检测细胞系，包括人肺鳞癌细胞系H596和人肺腺癌细胞系Calu-3。利用本发明特异ARMS引物和探针实施荧光PCR检测c-MET外显子14跳读突变方法如下：
(1)样本处理与RNA提取：
(a)取培养好的细胞系H596和Calu-3细胞数约3X106，分别加入1ml 1×PBS洗涤，1000rpm室温离心4min，弃上清液，手指轻轻敲散细胞团，加350μl RLT Buffer，震荡混匀，加350μl 70％乙醇，枪头吹打混匀，迅速将700μl混合液加到RNA Mini Spin column柱子上，12000rpm，室温离心15s，弃过滤液；
(b)加350μl RW1 Buffer到柱子上，12000rpm，室温离心15s，弃过滤液，加80μlDNaseI混合液到柱子膜上，20-30℃静置15min，加入350μl RW1Buffer，12000rpm，室温离心15s，弃过滤液；
(c)加500μl RPE Buffer，12000rpm，室温离心15s，弃过滤液；
(d)加500μl RPE Buffer，12000rpm，室温离心2min，弃过滤液，将柱子放到新的2ml管中，空转1min；
(e)将柱子置于1.5ml离心管中，加30-50μl RNase-free water，12000rpm，室温离心1min，收集RNA。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所提RNA溶于RNase-free水中，经过微量分光光度计NanoDrop 8000测定其浓度，并进行质控，A260/A280在1.8-2.0之间。
取2-7μl RNA作为模板，采用TAKARA试剂盒PrimeScript 1ststrand cDNASynthesis Kit合成cDNA，包括如反转录反应体系及操作步骤：
(a)变性反应体系包括如下成分：
(b)反转录cDNA反应体系包括如下成分：
(c)变性反应混合液10μl，65℃保温5分钟后，迅速冰浴1分钟以上。将反转录cDNA反应混合液10μl加到变性反应混合液之中，用枪头吹打混匀，并30℃保温10分钟，42℃保温30-60分钟，95℃保温5分钟后，冰上冷却，加入RNase-free water稀释5倍，得到cDNA模板。
将上述所得cDNA模板，作为实时荧光PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增：
其PCR扩增体系如下：
其PCR扩增程序如下：37℃2min，95℃3min，95℃30s，62℃30s，72℃30s 15Cycles(不检测FAM荧光)，95℃30s，58℃30s，72℃30s 31Cycles(检测FAM荧光)。
(3)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判定的标准：
采用Rotor-Gene Q实时荧光PCR仪进行扩增，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。
检测结果表明，所测细胞系H596为c-MET外显子14跳读阳性突变，细胞系Calu-3为阴性，检测结果见图4。同时对两细胞系进行直接测序，测序结果与本发明结果符合率为100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性。
实施例3
运用本发明检测临床样本，取送本公司待测的临床肺腺癌石蜡包埋组织(FFPE)样本20例，男性10例，女性10例，年龄为48-77岁，平均年龄62岁。利用本发明特异ARMS引物和探针实施荧光PCR检测c-MET外显子14跳读突变方法如下：
(1)样本处理与RNA提取：
(a)取上述各肺腺癌样本，切片5um厚，每个样本取2片迅速置于1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，涡旋震荡10s，室温全速离心2min。用移液枪小心吸尽上清，注意不要碰到沉淀，加1ml无水乙醇，涡旋震荡，全速离心2min。小心吸掉上清，换小枪头将所有残留液体去除干净。室温开盖静置10min，直到所有残留的乙醇挥发完全。
(b)加150ul Buffer PKD，涡旋混匀。加10ul蛋白酶K，用枪头吹打轻轻混匀。
(c)56℃水浴15min，再80℃水浴15min，再冰浴3min。13500rpm室温离心15min，转移上清液到新的1.5ml离心管中。
(d)加16ul DNase Booster Buffer和10ul DNase I，翻转离心管混匀，简短离心，收集液体，室温静置15min。加320ul Buffer RBC，充分混匀，加720ul无水乙醇，混匀。
(e)吸取700ul样本液至2ml RNeasy MinElute离心柱上，关盖，12000rpm室温离心15s，倒掉过滤液。
(f)重复步骤(e)，直到所有样本液全部过柱完毕。加500ul Buffer RPE到离心柱上，12000rpm室温离心15s，倒掉过滤液。加500ul Buffer RPE到离心柱上，12000rpm室温离心2min，倒掉过滤液。将离心柱置于新的2ml收集管中，开盖全速离心15min。将离心柱置于新的1.5ml离心管中，加14-30ul RNase-free H2O于离心柱膜中央，室温全速离心1min，收集RNA。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所提RNA溶于RNase-free水中，经过微量分光光度计NanoDrop 8000测定其浓度，并进行质控，A260/A280在1.8-2.0之间。
取2-7μl RNA作为模板，采用TAKARA试剂盒PrimeScript 1ststrandcDNASynthesis Kit合成cDNA，包括如反转录反应体系及操作步骤：
(a)变性反应体系包括如下成分：
(b)反转录cDNA反应体系包括如下成分：
(c)变性反应混合液10μl，65℃保温5分钟后，迅速冰浴1分钟以上。将反转录cDNA反应混合液10μl加到变性反应混合液之中，用枪头吹打混匀，并30℃保温10分钟，42℃保温30-60分钟，95℃保温5分钟后，冰上冷却，加入RNase-free water稀释5倍，得到cDNA模板。
将上述所得cDNA模板，作为实时荧光PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增：
其PCR扩增体系如下：
其PCR扩增程序如下：37℃2min，95℃3min，95℃30s，62℃30s，72℃30s 15Cycles(不检测FAM荧光)，95℃30s，58℃30s，72℃30s 31Cycles(检测FAM荧光)。
(3)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判定的标准：
采用Rotor-Gene Q实时荧光PCR仪进行扩增，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。
检测结果表明，所测20例临床肺腺癌石蜡包埋组织样本全部为c-MET野生型，即c-MET外显子14没有发生跳读，样本检测结果见图5。同时对20例样本进行直接测序，测序结果与本发明结果符合率为100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性。
实施例4
运用本发明检测模拟的阳性临床样本，取实施例2中阳性突变细胞系H596 RNA与实施例3中肺腺癌FFPE样本RNA按比例混合，模拟阳性临床样本。利用本发明特异ARMS引物和探针组合物实施荧光PCR检测c-MET外显子14跳读突变方法如下：
(1)模拟阳性样本的设计：
设计H596 RNA三个梯度浓度的模拟阳性样本，取2ul H596 RNA(lug)加入到5ul肺腺癌样本RNA(lug)中，混匀，作为阳性样本1；取1ul样本1加入到5ul肺腺癌样本RNA(lug)中，混匀，作为阳性样本2；取1ul样本2加入到5ul肺腺癌样本RNA(lug)中，混匀，作为阳性样本3。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述RNA作为模板，采用TAKARA试剂盒PrimeScript 1ststrand cDNA SynthesisKit合成cDNA，包括如反转录反应体系及操作步骤：
(a)变性反应体系包括如下成分：
(b)反转录cDNA反应体系包括如下成分：
(c)变性反应混合液10μl，65℃保温5分钟后，迅速冰浴1分钟以上。将反转录cDNA反应混合液10μl加到变性反应混合液之中，用枪头吹打混匀，并30℃保温10分钟，42℃保温30-60分钟，95℃保温5分钟后，冰上冷却，加入RNase-free water稀释5倍，得到cDNA模板。
将上述所得cDNA模板，作为实时荧光PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增：
其PCR扩增体系如下：
其PCR扩增程序如下：37℃2min，95℃3min，95℃30s，62℃30s，72℃30s 15Cycles(不检测FAM荧光)，95℃30s，58℃30s，72℃30s 31Cycles(检测FAM荧光)。
(3)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判定的标准：
采用Rotor-Gene Q实时荧光PCR仪进行扩增，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值来判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30为阳性；Ct值大于等于30为阴性。
模拟阳性样本检测结果如图6。检测结果表明，模拟阳性样本均检测到c-MET外显子14跳读阳性突变。在FFPE样本大环境中，即使阳性突变RNA输入量极少(样本3)的情况下，运用本发明体系也能够准确检测出阳性突变，进一步证明了本发明体系能够准确检测临床样本，确定本发明在检测具体样本中具有优秀的特异性。
本发明：(a)提供了检测C-MET外显子14跳读突变的引物和探针组合物，建立了ARMS实时荧光PCR体系，可以特异性检测人类c-MET基因外显子14跳读突变；(b)灵敏度高，可以检测低至10拷贝的突变；(c)样本检测范围广，包括新鲜或冷冻病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织以及细胞系。(d)检测便捷，操作简单，检测速度快，临床应用范围广。

Claims (5)

1.一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物，其特征在于，所述用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物包括下列16条引物和探针：SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO16；
其中，SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 06、SEQ.ID NO 09～SEQ.ID NO 12、SEQ.ID NO 14、SEQ.ID NO 15是引物；
SEQ.ID NO 07、SEQ.ID NO 08、SEQ.ID NO 13、SEQ.ID NO 16是探针。
2.根据权利要求1所述的用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物，其特征在于，所述序列SEQ.ID NO 01-SEQ.ID NO 08为正向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针；序列SEQ.ID NO 09-SEQ.ID NO 13为反向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针。
3.一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括序列如SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO 16的16条引物和探针，其中，SEQ.ID NO 01～SEQ.ID NO06、SEQ.ID NO 09～SEQ.ID NO 12、SEQ.ID NO 14、SEQ.ID NO 15是引物；
SEQ.ID NO 07、SEQ.ID NO 08、SEQ.ID NO 13、SEQ.ID NO 16是探针；
还包括如下的实时荧光PCR反应体系：
4.根据权利要求3所述的用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的试剂盒，其特征在于，所述序列SEQ.ID NO 01-SEQ.ID NO 08为正向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针；序列SEQ.ID NO 09-SEQ.ID NO 13为反向特异性扩增突变靶序列ARMS引物及相应TAQMAN探针。
5.一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)提供权利要求1所述的16条引物和探针；
(2)待测样品RNA的提取，待测样本包括：冷冻或新鲜病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织以及细胞系等；
(3)cDNA的合成；
(4)配制荧光PCR扩增反应体系；
(5)用步骤(1)的引物和探针特异性扩增待测基因突变靶序列；
(6)利用Taq酶缺少3’到5’外切酶活性，ARMS引物可以特异性地与突变靶序列退火，并延伸，在延伸过程中Taq酶的5’到3’外切酶活性将探针切断，产生荧光信号；以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于30：阳性；Ct值大于等于30：阴性。
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