CN105463111B - 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人类PIK3CA基因5种突变的探针、引物及试剂盒，其中PIM1～PIM5的5组引物和探针，每组中突变引物能与PIK3CA基因保守序列结合，突变ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测PIK3CA基因5种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对PIK3CA基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

Description

用于检测人类PIK3CA基因5种突变的探针、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类PIK3CA基因5种突变的探针、引物及试剂盒。
背景技术
PIK3CA基因定位于3q26.3，长34kb，包含20个外显子，它为一个癌基因，该基因编码的蛋白磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)在细胞生长、凋亡及肿瘤的形成过程中起重要的作用。PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B)信号通路是调节细胞功能的重要信号途径，当PIK3CA基因以基因扩增或者点突变的形式激活时，其转录与翻译水平升高，通过PI3K/AKT途径使AKT过度激活，无节制地促进细胞的生长和繁殖，并且会抑制细胞的凋亡，最终将导致肿瘤的发生。
在多种人类实体瘤中都存在PIK3CA基因的突变。PIK3CA基因的突变包括基因的扩增、缺失和体细胞性的错义突变等，PIK3CA基因在人体生理情况下一般多以非激活态形式存在，通常不易被检测到，但作为癌基因，其突变后可高度表达。近来多篇报道指出PIK3CA基因在包括结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤中发生高频体细胞突变。有研究发现PIK3CA基因的突变，近80％发生在螺旋区和激酶区，说明这些突变的位点并不是随机产生的，而正是这种非随机高频率突变表明PIK3CA基因确实在肿瘤的发生中扮演着重要的角色。
EGFR是表皮生长因子家族中的一个，在肿瘤细胞的分化、增殖和抗凋亡过程中发挥着重要的作用。EGFR-TKI类药物通过与细胞内酪氨酸激酶结构域上的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)位点竞争性结合，进而抑制其下游的信号转导通路，诱导细胞凋亡。而临床使用中只有75％-90％的EGFR药物敏感突变的患者能够从EGFR-TKI治疗中获益，而其余的患者会有原发性耐药。EGFR-TKI的耐药机制复杂，相关因素较多，PI3K作为EGFR下游信号分子，该基因被激活后可导致肿瘤细胞对EGFR-TKI药物的耐药，例如在结肠癌治疗中，个体化靶向药物西妥昔单抗(爱必妥)，帕尼单抗(维克替比)在PIK3CA基因发生突变的患者中治疗无效，野生型治疗全部有效。PI3K-Akt通路的活化可导致化疗药物耐药，而抑制该通路则可以有效地改善化疗耐药，提高化疗效果。有研究表明，PI3K通路抑制剂联合包括EGFR-TKI在内的靶向药物较单药效果更好。因此，研究EGFR与PI3K通路的关系可以进一步了解肿瘤的发生发展及EGFR-TKI耐药机制，为进一步解决EGFR-TKI耐药问题奠定基础，为指导临床用药给出治疗策略。
目前基因突变检测可以从两个层次入手：一是蛋白质层次的间接检测，主要借助一些蛋白质分析技术，分析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他改变；二是对遗传物质(主要是脱氧核糖核酸DNA)的直接检测，主要以聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)技术为代表，该技术的检测准确度与组织标本的结果符合率较高；测序法能够直接得出目的DNA片段的碱基序列，但相对于众多的突变检测方法显得费时费力。
发明内容
为了解决现有的PIK3CA基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。
本发明提供的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：
PIM1：E542K突变
突变上游ARMS引物PIM1-F：SEQ ID NO:2，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B1：SEQ ID NO:6；
PIM2：E545K突变
突变上游ARMS引物PIM2-F：SEQ ID NO:3，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B2：SEQ ID NO:7；
PIM3：E545D突变
突变上游ARMS引物PIM3-F：SEQ ID NO:4，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B2：SEQ ID NO:7；
PIM4：H1047R突变
突变上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，
突变下游ARMS引物PIM4-R：SEQ ID NO:9，
检测探针PIW2-P：SEQ ID NO:11，
阻断探针PIW2-B：SEQ ID NO:12；
PIM5：H1047L突变
突变上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，
突变下游ARMS引物PIM5-R：SEQ ID NO:10，
检测探针PIW2-P：SEQ ID NO:11，
阻断探针PIW2-B：SEQ ID NO:12；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
优选地，上述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(Minor Groove Binder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
表1人类PIK3CA基因5种热点突变
突变名称 氨基酸变化 碱基变化 CosmicID
PIM1 E542K c.1624G>A 760
PIM2 E545K c.1633G>A 763
PIM3 E545D c.1635G>T 765
PIM4 H1047R c.3140A>G 775
PIM5 H1047L c.3140A>T 776
上述引物是针对表1所列的5种突变进行检测的特异性引物，其中，ARMS引物，能够与其相应的突变位点序列特异性结合，选择性扩增突变序列；与其对应的另一引物能够与PIK3CA基因保守序列结合；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。
本发明提供的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针。
优选地，上述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物PIR-F：SEQ ID NO:13，
外控下游引物PIR-R：SEQ ID NO:14，
外控检测探针PIR-P：SEQ ID NO:15，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。其中，PIR-F和PIR-R用于扩增PIK3CA基因的保守序列(此段保守序列不同于以上任一突变引物结合扩增的保守序列)；PIR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQ ID NO:16，
内控下游引物IC-R：SEQ ID NO:17，
内控检测探针IC-P：SEQ ID NO:18，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有5种突变序列基因的质粒PIM1质粒～PIM5质粒、含有PIK3CA基因保守序列>gi|224589815:178951951-178952350段碱基的外控质粒(即PIR质粒)和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒(即IC质粒)；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒(即IC质粒)。
其中，PIM1质粒含有发生E542K(c.1624G>A)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)。
PIM2质粒含有发生E545K(c.1633G>A)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)。
PIM3质粒含有发生E545D(c.1635G>T)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)。
PIM4质粒含有发生H1047R(c.3140A>G)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178951951-178952350)。
PIM5质粒含有发生H1047L(c.3140A>T)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178951951-178952350)。
优选地，上述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为6个：
5个检测反应体系，每1个检测反应体系中包括用于检测人类PIK3CA基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
1个质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
所述AB premix为美国应用生物系统公司产品Fast Advanced MasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
本发明还提供了以上所述用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒的使用方法，首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到各检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和各突变相应的阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：
首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；9<Ct质控≤18；然后按照△Ct＝Ct检测-Ct质控判定：
含有PIK3CA：E542K(c.1624G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9.6为野生型，小于等于9.6为E542K(c.1624G>A)突变型；
含有PIK3CA：E545K(c.1633G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9.1为野生型，小于等于9.1为E545K(c.1633G>A)突变型；
含有PIK3CA：E545D(c.1635G>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于10.8为野生型，小于等于10.8为E545D(c.1635G>T)突变型；
含有PIK3CA：H1047R(c.3140A>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于10.2为野生型，小于等于10.2为H1047R(c.3140A>G)突变型；
含有PIK3CA：H1047L(c.3140A>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于11.2为野生型，小于等于11.2为H1047L(c.3140A>T)突变型；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在上述5种检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
优选地，以上所述的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒的使用方法，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以检测人类PIK3CA基因5种突变类型。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)本发明建立了实时荧光PCR扩增反应体系实现对PIK3CA基因突变的快速检测；且操作简单，结果易读。其JOE信号Ct值反映了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。
附图说明
图1为实施例1中内控(IC)实验结果；
图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；
图3为实施例1中阳性对照(STD)样本结果；
图4为实施例1中灵敏度(H1047L检测孔)实验结果；
图5为实施例1中精密度(E542K检测孔)实验结果；
图6为实施例2中阴性(野生型)样本实验结果；
图7为实施例2中阳性(E545D突变)样本实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、用于检测人类PIK3CA基因7种突变的检测试剂盒的引物和探针：
根据NCBI数据库公布的PIK3CA基因(NCBI Reference Sequence:NM_006218.2)野生型序列，以10号外显子E542K(PIM1)、E545K(PIM2)和E545D(PIM3)突变位点，21号外显子H1047R(PIM4)和H1047L(PIM5)突变位点为参考，设计特异性E542K突变引物和探针(见表2)、特异性E545K突变引物和探针(见表3)、特异性E545D突变引物和探针(见表4)、特异性H1047R突变引物和探针(见表5)和特异性H1047L突变引物和探针(见表6)。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对PIK3CA基因突变的高灵敏度和高特异性检测。
(1)用于人类PIK3CA基因E542K(PIM1)突变检测的特异性引物和探针序列：
表2用于检测E542K位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 PIW1-R TGCTCAGATCAGCCAAATTCAGT 无
2 PIM1-F TTTCTACACGACATCCGCTCACTA 无
5 PIW1-P CAGGAGAAAGATTTTC 5’端FAM，3’端MGB
6 PIW1-B1 ATCCTCTCTCTGAAATC 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，PIM1-F为突变上游ARMS引物，与E542K(c.1624G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PIW1-R为突变下游引物，与PIK3CA基因保守序列结合；PIW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PIW1-B1为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与E542K位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(2)用于人类PIK3CA基因E545K(PIM2)突变检测的特异性引物和探针序列：
表3用于检测E545K位点的特异性引物和探针组合
其中，PIM2-F为突变上游ARMS引物，与E545K(c.1633G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PIW1-R为突变下游引物，与PIK3CA基因保守序列结合；PIW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PIW1-B2为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与E545K位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(3)用于人类PIK3CA基因E545D(PIM3)突变检测的特异性引物和探针序列：
表4用于检测E545D位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 PIW1-R TGCTCAGATCAGCCAAATTCAGT 无
4 PIM3-F ATCCTCTCTCCGAAACCATTGA 无
5 PIW1-P CAGGAGAAAGATTTTC 5’端FAM，3’端MGB
7 PIW1-B2 AATCACTGAGCAGGAGAA 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，PIM3-F为突变上游ARMS引物，与E545D(c.1635G>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PIW1-R为突变下游引物，与PIK3CA基因保守序列结合；PIW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PIW1-B2为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与E545D位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(4)用于人类PIK3CA基因H1047R(PIM4)突变检测的特异性引物和探针序列：
表5用于检测H1047R位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
8 PIW2-F ATGATGCTTGGCTCTGGAATG 无
9 PIM4-R TTTGTTGACCAGGCACGATTAC 无
11 PIW2-P ATGAAATACTCCAAAGCC 5’端FAM，3’端MGB
12 PIW2-B AGCCACCATGATGTGCAT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，PIW2-F为突变上游引物，与PIK3CA基因保守序列结合；PIM4-R为突变下游ARMS引物，与H1047R(c.3140A>G)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PIW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PIW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与H1047R位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(5)用于人类PIK3CA基因H1047L(PIM5)突变检测的特异性引物和探针序列：
表6用于检测H1047L位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
8 PIW2-F ATGATGCTTGGCTCTGGAATG 无
10 PIM5-R CTTGTTGTCCACCCACCATAAA 无
11 PIW2-P ATGAAATACTCCAAAGCC 5’端FAM，3’端MGB
12 PIW2-B AGCCACCATGATGTGCAT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，PIW2-F为突变上游引物，与PIK3CA基因保守序列结合；PIM5-R为突变下游ARMS引物，与H1047L(c.3140A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PIW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PIW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与H1047L位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
2、质控引物(外控和内控)引物和探针
(1)用于人类PIK3CA基因突变检测样本质控的外控引物和探针序列：
根据NCBI数据库公布的PIK3CA基因(NCBI Reference Sequence:NM_006218.2)21号外显子保守序列，设计外控引物和探针(见表7)。以基因工程构建的外控质粒为模板，建立了实时荧光PCR外控(External Control)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。
表7用于样本质控的外控引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
13 PIR-F TCTCAGAAGGCAAAGACCGATT 无
14 PIR-R AACCCTGCTTGCGTTTACATTA 无
15 PIR-P CATAGGAATTGCACAATC 5’端FAM，3’端MGB
其中，PIR-F和PIR-R为外控上下游引物，扩增PIK3CA基因保守序列(>gi|224589815:178951951-178952350段碱基序列)；PIR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
(2)用于实时荧光PCR扩增反应体系内部质控的内控引物和探针序列：
根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBI Reference Sequence:NC_001666.2)保守序列(non-human DNA)，设计内控引物和探针(见表8)。以基因工程构建的内控质粒为模板，建立了实时荧光PCR内控(Internal Control)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表8用于内部质控的内控引物、探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
16 IC-F TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG 无
17 IC-R CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC 无
18 IC-P TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC 5’端JOE，3’端BHQ1
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列(位于>gi|11994090:c2400-2001)；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
3、本发明的检测人类PIK3CA基因5种突变的检测试剂盒
实时荧光PCR扩增反应体系设置：本发明方法用6孔实时荧光PCR扩增反应进行PIK3CA基因5种突变的检测。反应体系1～5(见表10)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系6(见表10)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
表9试剂盒组成
其中，PIM1质粒含有发生E542K(c.1624G>A)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)；PIM2质粒含有发生E545K(c.1633G>A)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)；PIM3质粒含有发生E545D(c.1635G>T)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178935883-178936282)；PIM4质粒含有发生H1047R(c.3140A>G)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178951951-178952350)；PIM5质粒含有发生H1047L(c.3140A>T)碱基变化的PIK3CA基因片段(>gi|224589815:178951951-178952350)。PIR质粒(即外控质粒)含有PIK3CA基因保守序列>gi|224589815:178951951-178952350段碱基。IC质粒(即内控质粒)含有matK基因保守序列(>gi|11994090:c2400-2001)。
试剂盒各管内组成成分如下：
表10试剂盒组成成分
注：AB premix全称Fast Advanced Master Mix，购自美国应用生物系统公司；10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。
反应体系1用于人类PIK3CA基因E542K(PIM1)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
反应体系2用于人类PIK3CA基因E545K(PIM2)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
反应体系3用于人类PIK3CA基因E545D(PIM3)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表4)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
反应体系4用于人类PIK3CA基因H1047R(PIM4)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表5)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
反应体系5用于人类PIK3CA基因H1047L(PIM5)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表6)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
反应体系6用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表7)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。
4、试剂盒检测方法：
(1)获取待测样本基因组DNA
石蜡包埋样本的提取使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(CatNo.56404)。按照说明书提取乳腺癌患者组织标本基因组DNA，操作步骤简述如下：
取临床采集的石蜡包埋组织切片(10μm，5～7片)放入1.5ml的离心管中，加入1000μL的二甲苯，剧烈涡旋10sec，12000rpm室温离心5min，弃上清，注意不要倒掉沉淀；加入1000μL无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋，12000rpm室温离心5min，弃上清；打开离心管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发；分别加入180μL bufferATL和20μL蛋白酶K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以偶尔涡旋)；加入200μLbufferAL，涡旋后加入200μL无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡；将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW1，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液；12000rpm离心1min；将离心柱放置在新的1.5mL离心管中，加入50-200μLbufferAE，室温放置5min，12000rpm离心1min。收集滤液，-20℃保存。
将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。
(2)实时荧光PCR扩增反应：
实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)，3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(Minor GrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
该试剂盒的优势：(1)在本发明试剂盒实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
实时荧光PCR扩增反应：
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表10)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置：
表11实时荧光PCR扩增反应条件
最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
(3)检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤20，体系性能良好，结果有效)；以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct质控≤18，Ct质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释后重新检测该样本；Ct质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)；以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表12)。
表12样本判结果判定
5、本发明试剂盒性能分析实验(灵敏度和精密度)
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果，Ct内控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～6FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～6FAM信号均起线且Ct≤20，符合要求。
(1)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有PIK3CA基因突变序列的5种质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。取1×103拷贝/μL的5种突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。
(2)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有PIK3CA基因突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×101拷贝/μL的5种突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。
实施例2
用本发明中人类PIK3CA基因5种突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。
本实施例中收集临床病理诊断为乳腺癌的患者组织样本，并从中提取基因组DNA。用PIK3CA基因5种突变检测试剂盒检测待测样本中PIK3CA基因突变状态。具体步骤如下：
(1)样本基因组DNA提取
石蜡包埋组织样本的提取使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(CatNo.56404)，按说明书提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L，PH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表11，按照人类PIK3CA基因5种突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值Ct≤20，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表12)。
图6中，Ct质控＝13.6，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。
图7中，Ct质控＝12.9，符合要求；PIM3突变检测孔FAM信号起线而PIM1、PIM2、PIM4和PIM5突变检测孔FAM信号均未起线，且Ct检测(PIM3)＝18，△Ct＝5.1，显示样本检测结果为PIM3(E545D)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 用于检测人类PIK3CA基因5种突变的探针、引物及试剂盒
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgctcagatc agccaaattc agt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttctacacg acatccgctc acta 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgacatcctc tctctcaaat cagta 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcctctctc cgaaaccatt ga 22
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caggagaaag attttc 16
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atcctctctc tgaaatc 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatcactgag caggagaa 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgatgcttg gctctggaat g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttgttgacc aggcacgatt ac 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttgttgtcc acccaccata aa 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgaaatact ccaaagcc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agccaccatg atgtgcat 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tctcagaagg caaagaccga tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaccctgctt gcgtttacat ta 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cataggaatt gcacaatc 18
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcgtaaggaa tcaaatgctg gag 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caacgggttt actaatagga tgcc 24
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcgataccac agtccttgca actcccc 27

Claims (4)

1.用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，其特征在于，包括用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针，外控引物和探针，以及内控引物和探针；
用于检测人类PIK3CA基因5种突变的引物和探针的核苷酸序列如下：
PIM1：E542K突变
突变上游ARMS引物PIM1-F：SEQ ID NO:2，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B1：SEQ ID NO:6；
PIM2：E545K突变
突变上游ARMS引物PIM2-F：SEQ ID NO:3，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B2：SEQ ID NO:7；
PIM3：E545D突变
突变上游ARMS引物PIM3-F：SEQ ID NO:4，
突变下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，
检测探针PIW1-P：SEQ ID NO:5，
阻断探针PIW1-B2：SEQ ID NO:7；
PIM4：H1047R突变
突变上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，
突变下游ARMS引物PIM4-R：SEQ ID NO:9，
检测探针PIW2-P：SEQ ID NO:11，
阻断探针PIW2-B：SEQ ID NO:12；
PIM5：H1047L突变
突变上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，
突变下游ARMS引物PIM5-R：SEQ ID NO:10，
检测探针PIW2-P：SEQ ID NO:11，
阻断探针PIW2-B：SEQ ID NO:12；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团；
外控引物和探针的核苷酸序列如下：
外控上游引物PIR-F：SEQ ID NO:13，
外控下游引物PIR-R：SEQ ID NO:14，
外控检测探针PIR-P：SEQ ID NO:15，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；
内控引物和探针的核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQ ID NO:16，
内控下游引物IC-R：SEQ ID NO:17，
内控检测探针IC-P：SEQ ID NO:18，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有5种突变序列基因的质粒PIM1质粒～PIM5质粒、含有PIK3CA基因保守序列>gi|224589815:178951951-178952350段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒，其中PIM1质粒～PIM3质粒均含有PIK3CA基因>gi|224589815:178935883-178936282段碱基序列，PIM4质粒～PIM5质粒含有PIK3CA基因>gi|224589815:178951951-178952350段碱基序列；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
4.根据权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因5种突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为6个：
5个检测反应体系：每1个检测反应体系中包括用于检测人类PIK3CA基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
1个质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，AB premix，10×buffer和ddH2O；
所述AB premix为美国应用生物系统公司产品Fast Advanced Master Mix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
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