CN109306374A

CN109306374A - 用于检测人类pik3ca基因e545k突变的引物、检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN109306374A
Application number: CN201811044875.6A
Authority: CN
Inventors: 陈渊能; 何浪平; 陈韵姿
Original assignee: Guangzhou Kin Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kin Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2019-02-05

Abstract

本发明提供了用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与PIK3CA基因E545K的特异序列结合，扩增突变序列。本发明提供的检测方法采用检测荧光信号基团能与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，建立基于实时荧光PCR的试剂盒，可准确检测PIK3CA基因E545K突变。本发明方法操作简单，结果易读；灵敏度高，能检出含0.001％PIK3CA基因E545K突变的样本,实现对PIK3CA基因E545K突变的超灵敏检测。

Description

用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法及试剂盒

本申请要求了2017年09月08日提交中国专利局的，申请号为201710805686.5，发明名称为“用于超灵敏检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

点突变与许多肿瘤有着密切的关系，已有研究表明，某些基团位点的点突变会使肿瘤的发生率大幅提高。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是催化肌醇基团磷酸化的激酶，由催化亚基和调节亚基组成的异二聚体；根据其底物结构不同分I、II和III型。PI3K是EGFR下游信号分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使丝/苏氨酸激酶(AKT)磷酸化而上调该通路的活性并产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。

已发现在多种癌症中(如乳腺癌、非小细胞肺癌等)存在PIK3CA基因突变，PIK3CA基因突变导致PI3K/Akt信号通路持续性活化。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患者对 EGFR-TKI等药物的耐药性。

目前基因突变检测可以从两个层次入手：一是蛋白质层次的间接检测，主要借助一些蛋白质分析技术，分析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他改变；二是对遗传物质(主要是脱氧核糖核酸DNA)的直接检测，主要以聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction， PCR)技术为代表，该技术的检测准确度与组织标本的结果符合率较高；测序法能够直接得出目的DNA片段的碱基序列，但相对于众多的突变检测方法显得费时费力。

若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗，另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA分子的要求，因此，快速准确灵敏地检测这些PIK3CA基因突变，就成为人们亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于检测PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法。本发明还提供了含有该引物和检测方法的试剂盒，通过特异性扩增技术，在抑制正常背景的情况下，把微量的异常DNA分子指数扩增，能从十万个正常DNA分子的背景之下，检测到一个异常 DNA分子，其灵敏度达到0.001％，实现了PIK3CA基因突变的超灵敏检测。

本发明第一方面提供用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，包括如下步骤：将用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量PCR，获得检测结果；

其中，所述引物序列包括突变上游引物和突变下游引物，其中，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，与待测PIK3CA基因E545K突变型的一条链互补；所述突变下游引物长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测PIK3CA基因E545K突变型的另一条链互补；

所述阻断剂能与PIK3CA基因E545K突变位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增。

所述检测荧光信号基团能与PCR扩增片段结合并发出荧光信号。

在本发明一实施例中，所述突变上游引物，其长度为32个碱基，与待测PIK3CA基因E545K突变型的一条链互补。

在本发明一实施例中，所述突变下游引物其长度为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测PIK3CA基因E545K突变型的另一条链互补。

在本发明一实施例中，所述突变上游引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列，所述突变下游引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的序列。

在本发明一实施例中，所述阻断剂包括：匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；

其中，所述阻断剂中匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。

在本发明一实施例中，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO 9、SYBR MIX中的一种或多种。

本发明第二方面提供用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，其中，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，与待测PIK3CA基因E545K突变型的一条链互补；所述突变下游引物长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测PIK3CA基因E545K突变型的另一条链互补。

在本发明一实施例中，所述阻断剂包括匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；

其中，所述阻断剂中匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列；所述化学修饰基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。

本发明第三方面提供用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的试剂盒，包括本发明第二方面所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物，还包括阻断剂以及检测荧光信号基团。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法、如本发明第二方面所述用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、如本发明第三方面所述用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的试剂盒在检测人类PIK3CA基因E545K突变中的应用。

在本发明一实施例中，所述应用中，所述被检测样品中，所述突变型基因的浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％。

进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占野生型基因数量或摩尔浓度的比例。

进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占样品总基因数量或摩尔浓度的比例。

本发明提供的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法能在10万个正常野生型DNA分子中，检测出存在的1个异常突变型DNA分子，即能检出含0.001％PIK3CA基因E545K突变的样本，并且通过基因测序，进一步确认人类PIK3CA基因E545K突变的存在。

附图说明

图1为本发明实施例提供的原理示意图；

图2为本发明实施例提供的加阻断剂体系与不加阻断剂体系扩增效果对比图，其中 A1为不加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B1为不加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线、A2为加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B2为加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线；

图3为本发明实施例提供的突变型基因PIK3CA基因E545K突变分子的产物的测序结果；

图4为本发明实施例提供的试剂盒的灵敏度检测，其中A、B、C、D分别为突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％的扩增曲线；

图5为本发明实施例提供的试剂盒的特异性检测，其中A为突变基因，其中A为对突变异常基因扩增、B为对正常基因扩增、C为对BRAF基因扩增、D为KIT基因扩增、E为对非目标基因混合物扩增。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下面将结合图1，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1

1、用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物及阻断剂

根据NCBI数据库公布的PIK3CA基因(NCBI Reference Sequence:NM_006218.2)野生型序列，以E545K突变位点为参考，设计特异性E545K突变引物。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对PIK3CA基因E545K突变的高灵敏度和高特异性检测。

用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物序列：

突变上游引物的序列包括：

5’-CAGACTAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA-3’(SEQ ID NO.1)

突变下游引物的序列包括：

5’-CATAGAAAATCTTTCTCCTGCTTAG-3’(SEQ ID NO.2)。

其中，突变上游引物，其长度为32个碱基，与PIK3CA基因保守序列结合。突变下游引物其长度为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与E545K(c.1633G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列。

为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了阻断剂，包括匹配PIK3CA 野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；

其中，所述阻断剂中匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列为：

5’-TCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

所述化学修饰基团为C3-spacer磷酸胺。

上述阻断剂能与E545K位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增，在 PCR扩增过程中不可延伸。

2、使用PIK3CA基因E545K突变的检测试剂盒，操作步骤如下：

2.1提取DNA样本，备用：

2.2按下表中组份的用量配制qRT-PCR反应体系：

试剂	用量
		SYBR MIX	10μl
突变上游引物(4μM)	1.0μl
		突变下游引物(4μM)	1.0μl
ddH2O	4.0μl
		阻断剂(1μM)	2.0μl
DNA	2.0μl

2.3qRT-PCR反应

qRT-PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃延伸1min(收集荧光)，进行40个循环。

3、试剂盒的性能验证

3.1检测模板的制备：

取含有PIK3CA基因E545K突变质粒的基因工程菌以及对应的野生型质粒基因工程菌分别培养，使用质粒纯化试剂盒(Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司)制备纯化的质粒作为检测模板。

3.2阻断剂的作用：

由于本试剂检测的目标基因片段PIK3CA基因E545K突变只有一个碱基的点突变，本发明提供的检测引物在不加阻断剂的体系中在检测野生型基因时可能会出现假阳性，如图2 (横坐标为qPCR的CT值，纵坐标为所检测到的萤光增量)中扩增曲线B1所示，而在加入阻断剂的体系中由于阻断剂的存在，抑制了野生型基因的扩增，如图2扩增曲线B2(不扩增)所示，结果表明加入阻断剂可抑制野生型基因的扩增；而加入阻断剂的体系与不加阻断剂的体系，两者对检测突变型基因的灵敏性相近，扩增曲线A1(不加阻断剂)其CT值与扩增曲线 A2(加阻断剂)的CT值相接近，结果表明扩增突变基因时，加与不加阻断剂对突变基因的扩增影响很小，但加阻断剂可以明显抑制野生型基因的扩增，大大减少大量野生型基因对突变型基因检测的干扰，更利于突变型基因的检出。对A2扩增所得产物进行测序，结果证实突变型基因存在E545K(c.1633G>A)位点突变，如图3所示。

3.3试剂盒的灵敏度

制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，10倍梯度稀释，取10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL的突变型质粒加入10¹⁰拷贝/μL的野生型质粒中得到突变型基因占野生型基因的比例为1％、0.1％、0.01％、0.001％的样品，分别取2μL各稀释度的质粒 DNA作为模板，对试剂盒的灵敏度进行检测，结果如图4所示，本发明提供的用于检测人类 PIK3CA基因E545K突变的试剂盒在突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％时均能有效扩增，检测灵敏度可达到0.001％。

3.4试剂盒的特异性

分别以突变异常基因、正常基因、其他较为常见序列相似的突变非目标基因作为检测模板进行检测，以检测试剂盒的特异性。结果如图5所示，其中A为对突变异常基因扩增、B 为对正常基因扩增、C为对BRAF基因扩增、D为KIT基因扩增、E为对非目标基因混合物扩增。结果表明本发明提供的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的试剂盒可特异检测PIK3CA基因E545K(c.1633G>A)位点突变。

综上所述，本发明提供的检测人类PIK3CA基因E545K突变的试剂盒可检测

E545K(c.1633G>A)位点突变，且试剂盒具有较高的灵敏度及特异性，是检测人类PIK3CA基因E545K突变的一种理想选择。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州健天基因技术有限公司

<120> 用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、检测方法及试剂盒

<150> 2017108056865

<151> 2017-09-08

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagactagct agagacaatg aattaaggga aa 32

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catagaaaat ctttctcctg cttag 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctctgaaat cactgagcag gag 23

Claims

1.用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量PCR，获得检测结果；

所述阻断剂能与PIK3CA基因E545K突变位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。

2.如权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，所述突变上游引物，其长度为32个碱基，与待测PIK3CA基因E545K突变型的一条链互补。

3.如权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，所述突变下游引物其长度为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测PIK3CA基因E545K突变型的另一条链互补。

4.如权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，所述突变上游引物的序列包括：

CAGACTAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(SEQ ID NO.1)，

所述突变下游引物的序列包括：

CATAGAAAATCTTTCTCCTGCTTAG(SEQ ID NO.2)。

5.如权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，所述阻断剂包括：匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；

其中，所述阻断剂中匹配PIK3CA野生型基因的核酸序列包括：TCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG(SEQ ID NO.3)；

所述化学修饰基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的检测方法，其特征在于，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO9、SYBRMIX中的一种或多种。

7.用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括突变上游引物和突变下游引物，其中，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，与待测PIK3CA基因E545K突变型的一条链互补；所述突变下游引物长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测PIK3CA基因E545K突变型的另一条链互补。

8.用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，包括如权利要求7所述的用于检测人类PIK3CA基因E545K突变的引物，还包括阻断剂以及检测荧光信号基团。

9.如权利要求1所述的方法、权利要求7所述的引物、和/或权利要求8所述的试剂盒在检测人类PIK3CA基因E545K突变中的应用。

10.如权利要求1所述的方法、权利要求7所述的引物、和/或权利要求8所述的试剂盒在突变型基因的浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的样品中检测人类PIK3CA基因E545K突变中的应用。