CN104372102A - 一种用于检测pik3ca基因突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术以及医学领域，涉及一种PIK3CA基因突变检测试剂盒。本发明的第1-5号试剂依次针对PIK3CA基因的E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L突变，第6号试剂针对PIK3CA基因的保守区，用作质控，检测方法利用上述检测试剂盒通过荧光定量PCR反应进行。本发明实施例提供的检测试剂盒灵敏度高，特异性好，是一种性能优良的人类PIK3CA基因突变检测试剂盒。本发明采用荧光定量PCR方法对PIK3CA基因突变区域序列进行特异性扩增检测，同时利用MGB阻断核酸与待测样品中野生型DNA模板特异结合，抑制该野生型DNA模板与引物探针的结合。采用了降低引物Tm值、5’端加尾和在引物中间加入插入碱基等方法设计正向引物，提高试剂盒特异性，再引入45个以上的循环数，从而达到提高试剂盒灵敏度的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术以及医学领域，尤其涉及一种人类PIK3CA基因突变检测试剂盒及检测方法。
背景技术
PI3K(Phosphatidylinositol-3-Kinase，磷脂酰肌醇3激酶)是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，由一个110k Da的催化亚基p110和一个85k Da的调节亚基p85构成。其中PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinase,catalytic subunit alpha，磷脂酰肌醇3’-激酶催化亚基α)是PI3K家族IA型PI3K的p110α催化亚基。PI3K在人体正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈和卵巢等组织中均有表达，具有调控机体细胞增殖、存活、死亡和分化等重要生理功能。正常情况下，PI3K可产生3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP2和PIP3可作为第二信使抑制/激活下游AKT(Protein kinase B)通路中的各种靶蛋白分子，控制信号的传导和级联放大，从而调节细胞的增殖、分化和迁移。
有研究证实，在肿瘤患者中，PIK3CA基因突变可以激活PI3K通路的下游AKT通路，增加细胞浸润和转移，促进体细胞癌变，加速肿瘤患者病情恶化。该基因的突变可发生于乳腺癌、结直肠癌和肺癌等多种癌症中，在乳腺癌和结直肠癌中的突变率分别为26％和25％。突变主要集中在9号外显子和20号外显子上，最常见的5个突变为：E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L，约占总突变的90％以上。
表1：人类PIK3CA基因5种突变
其中，Cosmic ID为突变数据库Cosmic中记录的突变类型编号。
PIK3CA基因突变状态直接或间接影响到结直肠癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症的用药和预后。研究发现曲妥珠单抗对PI3K/AKT通路PIK3CA基因突变的Her2阳性乳腺癌患者的疗效欠佳；另有研究表明，PIK3CA基因突变的结直肠癌患者对西妥昔单抗产生耐药性；该基因的突变也成为肺癌个性化治疗另一潜在的生物标记。有研究发现4％的肺癌患者伴随PIK3CA突变，且突变患者与TKIs类药物耐药相关。
鉴于PI3K信号通路在细胞信号转导的重要性，国内外众多知名药企以PI3K为靶点开发PI3K抑制剂。临床药物NVP-BEZ235(Genetech)、GDC-0941(Novartis)、BYL719(Novartis)、CAL-101(Amgen)和PX-866(ProlX)等，分别针对PI3K/mTOR、PI3Kα、PI3Kδ、PI3K等靶点。已有的靶向药物使用经验表明，药物靶点附近的基因突变往往与该药物的疗效和预后存在较大的关联性，因此，在针对PI3K通路的靶向抑制剂药物上市后，将会有越来越多的实验室研究和临床研究聚焦PI3K通路抑制剂药物的基因组学和临床应用。
目前针对基因突变的检测方法很多，如直接测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)、荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测微量突变灵敏度不高。因此，需要建立一种较高灵敏度的检测PIK3CA基因突变检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PIK3CA基因突变检测试剂盒及其检测方法，旨在解决现有技术中灵敏度偏低的问题。
在本发明的一个方面，提供了一种用于检测受试者中PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括分开设置的第1-6号试剂，并且：a.第1号试剂包含序列为SEQ ID NO:1的正向引物、序列为SEQ IDNO:2的反向引物和探针A；b.第2号试剂包含序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物和探针A；c.第3号试剂包含序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物、探针A和MGB阻断核酸C；d.第4号试剂包含序列为SEQ ID NO:7的正向引物、序列为SEQ ID NO:8的反向引物和探针B；e.第5号试剂包含序列为SEQ ID NO:10的正向引物、序列为SEQ ID NO:8的反向引物和探针B；f.第6号试剂包含序列为SEQ ID NO:11的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物和探针A；其中探针A由序列为SEQ ID NO:3的核酸、该核酸的5’端连接的荧光报告基团和该核酸的3’端连接的荧光淬灭基团组成；探针B由序列为SEQ ID NO:9的核酸、该核酸的5’端连接的荧光报告基团和该核酸的3’端连接的荧光淬灭基团组成；所述的MGB阻断核酸C的核酸序列为SEQ ID NO:6，其包括MGB基团修饰，且3’端脱氧核糖核苷酸骨架上的3’羟基被封闭；优选地，所述的受试者是人类癌症患者；进一步优选地，所述的受试者是采用了PI3K抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)等PI3K通路相关靶向药物治疗的人类癌症患者。
在本发明一个优选的方面，所述的第1号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；所述的第2号试剂中，序列为SEQID NO:4的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；所述的第3号试剂中，序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物、探针A和MGB阻断核酸C的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM：0.8μM-4μM；所述的第4号试剂中，序列为SEQ ID NO:7的正向引物、序列为SEQ ID NO:8的反向引物和探针B的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；所述的第5号试剂中，序列为SEQID NO:10的正向引物、序列为SEQ ID NO:8的反向引物和探针B的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；所述的第6号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的正向引物、序列为SEQ ID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM。
在本发明的实施方案中，第6号试剂也称作质控试剂，其中的正向引物也称作质控正向引物，反向引物也称作质控反向引物，探针也称作质控探针。
在本发明一个优选的方面，在所述探针A和探针B中，所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、HEX、CY3、CY5和波长范围相似的其它荧光报告基团；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ，并且荧光报告基团与荧光报告基团的搭配根据荧光能量共振转移原理来选择；优选地，所述的探针A和探针B的3’端荧光淬灭基团是MGB-NFQ。
在本发明一个优选的方面，所述第1-6号试剂中还分别包含PCR缓冲液、ROX参比染料和Taq酶的一种或多种；优选地，所述的PCR缓冲液包含Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs；进一步优选地，所述的Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs的量分别为50-100mM、5-30mM、1-8mM、5％-15％、和100-200μM。
在本发明一个优选的方面，所述PCR缓冲液包含PCR添加剂；优选地，所述的PCR添加剂为DMSO、甜菜碱、BSA、甲酰胺或甘油。
在本发明一个优选的方面，所述第1-6号试剂中包含由dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶形成的抗污染系统；优选地，所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP物质的量的比例为0.1mM-0.5mM：0.2mM-1mM：0.1mM-0.5mM：0.1mM-0.5mM。
在本发明一个优选的方面，所述第1-5号试剂中分别包含根据特定基因序列设计的内标正向引物、内标反向引物和探针；优选地，所述内标正向引物、反向引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；进一步优选地，核酸序列为SEQ ID NO:14的内标探针的5’端连接有荧光报告基团、3’端连接有荧光淬灭基团；更优选地，核酸序列为SEQ ID NO:14的内标探针的荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
在本发明一个优选的方面，所述第1-5号试剂中的MGB阻断核酸C的3’羟基封闭是MGB-NFQ封闭。
在本发明一个优选的方面，所述第1-5号试剂中的MGB阻断核酸C中的MGB修饰可以存在于不同位置；优选地，所述的MGB修饰是5’端修饰、3’端修饰或其位于核酸的中间部位等对试剂性能无较大改善的修饰位置。
在本发明一个优选的方面，所述第1-5号试剂中的MGB阻断核酸C还包括增加并变换修饰基团但对试剂性能无较大改善的其它修饰；优选地，所述的其他修饰选自磷酸化修饰、荧光报告基团修饰和荧光淬灭基团修饰。
在本发明一个优选的方面，所述试剂盒还包括酶混合液、空白对照、弱阳性质控、强阳性质控、点样指示剂或样品稀释液的一种或多种。
在本发明一个优选的方面，所述试剂盒还包括核酸提取试剂。
在本发明一个优选的方面，所述试剂盒还包括第7号试剂，该第7号试剂是Taq酶。
在本发明一个优选的方面，所述试剂盒还包括第8号试剂，该第8号试剂是空白对照；优选地，所述的空白对照是pH为8.0的10mM Tris-HCl。
在本发明一个优选的方面，所述试剂盒还包括第9号试剂，该第9号试剂是弱阳性对照试剂；优选地，该弱阳性对照试剂是含有PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L5种突变类型质粒和内标质粒的混合液。
在本发明优选的方面，本发明是这样实现的，一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括分开设置的第1-6号试剂：其中第1号试剂包含引物对SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3；第2号试剂包含引物对SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3；第3号试剂包含引物对SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3，MGB阻断核酸SEQ ID NO:6；第4号试剂包含引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，探针SEQ ID NO:9；第5号试剂包含引物对SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8，探针SEQ ID NO:9；第6号试剂包含引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3。其中所述探针SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；其中所述的MGB阻断核酸SEQ ID NO:6进行了MGB修饰且3’端脱氧核糖核苷酸骨架上的3’羟基被封闭。
本发明的另一目的在于提供一种PIK3CA基因突变的检测方法，该检测方法利用本发明的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)取本发明的检测试剂盒，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述第1-6号试剂中并同时进行PCR反应，根据第1-5号试剂和第6号试剂Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。
本发明的优点在于：
(1)采用荧光定量PCR方法对PIK3CA基因突变区域序列进行特异性扩增检测，同时利用MGB阻断核酸与待测样品中野生型DNA模板的特异结合，抑制该野生型DNA模板与引物探针的结合。
(2)采用了降低引物Tm值、5’端加尾和在引物中间加入插入碱基等方法设计正向引物，提高试剂盒特异性，再引入45个以上的循环数，从而达到提高试剂盒灵敏度的效果。
(3)本发明实施例提供的检测方法简单有效，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类PIK3CA基因突变的方法；本发明实施例提供的检测试剂盒灵敏度高，特异性好，是一种性能优良的人类PIK3CA基因突变检测试剂盒。
附图简要说明
图1是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阴性检测结果图；
图2是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阳性检测结果图；
图3是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阴性检测结果图；
图4是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阳性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的其他方面，还提供了以下的技术方案：
本发明的实施例提供了一种针对人类PIK3CA基因突变的检测试剂盒，包括分开设置的第1-6号试剂，第1-6号试剂依次用于检测PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L突变型和PIK3CA野生型：其中第1号试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3；第2号试剂包含引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3；第3号试剂包含引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3，MGB阻断核酸SEQ ID NO:6；第4号试剂包含引物对SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8，探针SEQ ID NO:9；第5号试剂包含引物对SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:8，探针SEQ ID NO:9；第6号试剂包含引物对SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:2，探针SEQ ID NO:3。其中所述探针SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有偶联MGB的荧光淬灭基团NFQ；其中所述的MGB阻断核酸SEQ ID NO:6进行了MGB修饰且3’端脱氧核糖核苷酸骨架上的3’羟基被封闭。
具体地，上述第1-6号试剂可与其他组分构成PCR反应体系，也可自身包含有PCR反应所必需的组分以进行荧光定量PCR检测。在第1-6号试剂单独作为PCR反应体系时，该第1-6号试剂除了各自包含其对应的引物探针SEQID NO:1-SEQ ID NO:14之外，还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、dNTPs、Taq酶，并可通过加水补充体积。如在第1-6号试剂作为一个整体形成一个试剂盒时，第1-6号试剂除了各自包含其对应的引物探针之外，还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、Taq酶，并可通过加水补充体积。
具体地，上述第1-6号试剂作为一个整体与其它试剂组合形成一个试剂盒时，第1-6号试剂可只含各自对应的引物探针、PCR缓冲液、ROX参比染料，第1-6号试剂中的Taq酶组分可分出来形成第7号试剂，以提高试剂盒稳定性。
具体地，上述试剂盒还可添加第8-9号试剂作为辅助试剂：第8号试剂为空白对照，组成为10mM Tris-HCl(PH 8.0)；第9号试剂为弱阳性对照，组成为含有PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L5种突变类型质粒和内标质粒的混合液，用于试剂的质量控制。
具体地，上述第1-6号试剂还包含抗污染系统，即由一定比例的dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶，结合UNG酶形成抗污染系统。
具体地，上述第1-6号试剂还包含内标系统，即在第1-5号试剂每个单管中加入内标系统引物探针SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:14，探针SEQ ID NO:14的荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
具体地，上述第1-6号试剂中的PCR缓冲液组成为Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20、dNTPs，还包含有PCR添加剂BSA、Betaine、DMSO、甲酰胺等。
具体地，上述引物、探针及阻断核酸序列分别为：
正向引物SEQ ID NO:1
5’-GCTCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTGTA-3’，
反向引物SEQ ID NO:2
5’-GGTATGGTAAAAACATGCTGAGATCAG-3’，
探针SEQ ID NO:3
5’-TTCTATGGAGTCACAGGTAAGTGC-3’MGB，
正向引物SEQ ID NO:4
5’-GCTCGAGATCCTCTCTCTGAAATCAGTA-3’
正向引物SEQ ID NO:5
5’-GCTACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTACT-3’
MGB阻断核酸序列SEQ ID NO:6
5’-GAAATCACTGAGCAGGAGAAAG-3’MGB
正向引物SEQ ID NO:7
5’-CGTCATGAAACAAATGAATGATGCTCG-3’
反向引物SEQ ID NO:8
5’-TGCAGTGTGGAATCCAGAGTGA-3’
探针SEQ ID NO:9
5’-ACAGCATGCATTGAACTG-3’MGB
正向引物SEQ ID NO:10
5’-CGATTCATGAAACACAATGAATGATGCACT-3’
正向引物SEQ ID NO:11
5’-CAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAG-3’
正向引物SEQ ID NO:12
5’-GGCAGCCGAGCCACATC-3’
反向引物SEQ ID NO:13
5’-CGGTCGCAGCCCAGG-3’
探针SEQ ID NO:14
5’-CAGACACCATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
具体地，上述探针序列5’端连接的荧光基团可以为FAM或VIC荧光基团，此外还可选用其他合适的荧光基团，例如ROX，HEX。该探针序列3’端连接的淬灭基团NFQ可为本领域技术人员熟知的淬灭基团。探针5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近的时候，荧光报告基团不能发出荧光，但随着PCR扩增反应的进行，5’端的荧光基团随着探针的水解而脱落下来，从而能发出荧光，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。该探针的3’端连接有MGB(Minor Groove Binder)基团，MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验效果。该MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此对于同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，特异性更强。
具体的，第1-5号试剂中包含的MGB阻断核酸3’端最后一个脱氧核糖核苷酸骨架3’羟基上偶联有一个MGB-NFQ基团，使得该序列在扩增时无法正常延伸，从而阻止了该阻断核酸序列结合DNA模板并扩增，同时MGB的加入使该阻断核酸维持合适Tm值的同时序列更短，结合野生型模板的能力更强，从而提高野生型模板的阻断效率，间接提高试剂的突变型检测的特异性。在本发明实施例中，该MGB阻断核酸序列与PIK3CA野生型序列结合，阻止正向引物SEQ ID NO:5与该DNA模板的结合扩增；另一方面，该MGB阻断核酸序列不与发生突变的PIK3CA基因序列结合，而正向引物SEQ ID NO:5可与该发生突变的模板结合，并在反向引物和探针的共同作用下完成突变DNA模板的特异性扩增，实现PIK3CA各突变位点的特异性检测，通过将该检测结果与第6号试剂的PCR反应体系检测结果进行比较以确定待检测样品中是否有突变发生。
具体地，上述第3号试剂中包含的MGB阻断核酸C在第3号试剂中的使用浓度为正向引物SEQ ID NO:5浓度的1-4倍。
具体地，上述第1-6号试剂中的正向引物采用了降低Tm值、5’端加尾或引物中间加入插入碱基等设计方法。降低Tm值能显著提高正向引物的特异性，但会轻微降低引物的灵敏度，针对这种情况，我们将反应的总循环数提高到45-50个循环，同时采用两种退火温度，退火温度一高于ARMS引物的Tm值，退火温度二与ARMS引物退火温度一致，从而能从整体上提高ARMS引物的灵敏度；5’端加尾是一种辅助方式，当正向引物降低Tm值灵敏度大幅下降时，在正向引物的5’端引入1-5个无关碱基能适当稳定正向引物的灵敏度并保持其特异性；引物中间加入插入碱基能一定程度上提高ARMS引物的特异性，但该方法不能与ARMS引物3’端非突变检测点错配合用；因此本发明实施例采用上述方法替代传统的3’端错配的ARMS引物设计方法。
所述第1-5号试剂中的正向引物的Tm值比退火温度低0-5度。
本发明实施例提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，检测周期短，实现了对于样品的准确、快速检测。
本发明实施例还提供一种针对PIK3CA基因突变的检测方法，该检测方法利用本发明实施例提供的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第1-6号试剂中，然后按一定条件进行PCR反应，根据第1-5号试剂和第6号试剂Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。
具体地，例如，含有第6号试剂的PCR反应体系对应的Ct值为质控值Ct0，而含有第1号试剂的PCR反应体系对应的Ct值为Ct1，△Ct＝Ct1-Ct0。首先根据质控值Ct0作为样本基因组DNA上样量是否适当的标准，Ct0<23则样本基因组DNA上样量过高，建议稀释后重新检测；23≤Ct0≤30则样本基因组DNA上样量适中，检测结果有效；30<Ct0<34则样本基因组DNA加入量较低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型；Ct0≥34则样本基因组含量过低，最好重新制备样本或增加使用量进行检测。在对上样量进行判定的同时可对PIK3CA基因E542K突变的结果进行判定：△Ct值依次大于或等于10时，则样品无PIK3CA基因E542K突变或突变丰度低于本试剂盒突变检测下限，如图1和3所示；△Ct依次小于10时，则样品存在PIK3CA基因E542K突变，如图2和4所示。
具体地，本发明实施例提供的检测方法的检测下限为0.1％，即突变丰度高于0.1％的样品可以被检测到。
本发明实施例中，还可以通过上调△Ct值来检测突变丰度低于0.1％的样品。
具体地，上述含有第1-5试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。本发明的优选实施例中上述含有第1-5试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：
第3号试剂按上述配方配制PCR反应体系，第1-2、4-5号试剂则需去掉MGB阻断核酸组分；上述PCR缓冲液中含有dNTPs、镁离子等进行PCR反应所必需的组分。
具体地，上述含有第6号试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。优选地，上述含有第6号试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：
上述PCR缓冲液中含有dNTPs、镁离子等进行PCR反应所必需的组分。
具体地，在进行PIK3CA基因突变检测时，上述第1-6号试剂在相同反应条件下进行。优选地，上述第1-6号试剂的PCR反应条件为：
37℃10min；
95℃5min；
95℃20s，63℃20s，72℃20s，15个循环；
95℃20s，60℃30s，72℃20s，30个循环；
在上述一共45个循环中，每个循环后收集荧光信号，该过程由反应仪器自动完成。
本发明实施例中采用了荧光定量PCR方法，对PIK3CA基因5种突变类型进行特异性扩增检测，利用MGB阻断核酸序列与样品中野生型DNA模板的结合抑制后者与引物探针的结合，同时对正向引物采用降低Tm值、5’端加尾或引物中间加入插入碱基等设计方法，实现5种突变的高特异性扩增，利用该结果与质控反应体系的检测结果的比较实现了在PIK3CA基因5种常见突变的检出。本发明建立的检测方法简单有效，检测特异性好、灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类PIK3CA基因突变的方法。
具体实施方案
以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
制备PIK3CA基因突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：
1.合成引物及探针序列
合成引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:13；合成特异性探针序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，其中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9在5’端标记FAM荧光基团，3’端标记淬灭基团NFQ-MGB修饰基团，SEQ ID NO:14在5’端标记VIC荧光基团，3’端标记淬灭基团TAMRA。
将上述引物序列分别配制成100μM的母液储存，将上述探针序列分别配制成100μM的母液储存。
2.合成阻断核酸序列
合成MGB阻断核酸序列SEQ ID NO:6，并在3’端进行MGB-NFQ修饰。
将阻断核酸配制成100μM的母液储存。
3.荧光定量PCR反应体系的制备
分别制备含有第1-5号试剂的突变检测反应体系和含有第6号试剂的质控检测反应体系，各组分如下表2所示：
表2第1-6号试剂的组分
上述PCR缓冲液含有dNTPs、镁离子等PCR反应所必需的组分。
实施例2
用实施例1制备的PIK3CA基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。
本实施例中收集50例临床病理诊断为结直肠癌患者的石蜡包埋组织切片，并从中提取基因组DNA，用实施例1中得到的PIK3CA基因突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L突变，同时采用传统测序的方法进行验证，具体操作步骤为：
1.样品基因组DNA的提取
使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,Cat No.56404)提取上述肺癌患者的组织标本的基因组DNA。DNA提取方法参照说明书进行，操作步骤简述如下：将临床采集的石蜡包埋组织(≤25mg)放置在1.5ml的离心管中，加入1200μl的二甲苯，剧烈涡旋10s，12000rpm室温离心5min。弃上清，注意不要倒掉沉淀。加入1200μl无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，再次加入1200μl无水乙醇，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，打开离心管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发。加入180μl buffer ATL。加入20μl蛋白酶K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以偶尔涡旋)，之后涡旋15s，加入200μl buffer AL，涡旋后加入200μl无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡。将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW1，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW2，12000rpm离心3min，弃废液后12000rpm离心1min，将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50-200μl buffer AE，室温放置1min,12000rpm离心1min。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl待用。
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取5μl分别加入实施例1的试剂盒的质控检测反应体系和突变检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
37℃10min；95℃5min；
95℃20s，63℃20s，72℃20s，15个循环；
95℃20s，60℃30s，72℃20s，30个循环；
每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，并设置ROX荧光校正。
3.样本的检测结果分析
本发明利用阻断核酸序列抑制野生型DNA模板序列的扩增，并通过收集FAM荧光信号检测发生突变DNA模板的扩增，通过质控检测反应体系的质控值Ct0判断样本是否有效，通过第1号试剂突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct判断是否发生PIK3CA基因突变。
具体的结果判读标准如下：
Ct0<23则样本基因组DNA上样量过高，建议稀释后重新检测；23≤Ct0≤30则样本基因组DNA上样量适中，检测结果有效；30<Ct0<34则样本基因组DNA加入量较低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型；Ct0≥34则样本基因组含量过低，最好重新制备样本或增加使用量进行检测。
以第1号试剂突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct作为PIK3CA基因是否发生E542K突变的判断标准，△Ct值≥10则检测结果为阴性，即样品无E542K突变或突变丰度低于0.1％，如图1所示；△Ct值＜10则检测结果为阳性，即样品存在E542K突变，如图2所示。第2-5号试剂判读参照第1号试剂，△Ct值界限分别为10、10、11和11。
本实施例中40例临床标本的检测结果如下：
PIK3CA基因E542、E545、E545、H1047和H1047位点野生型样本39例，其中34例样本突变检测无Ct值，如图1所示，5例样本突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct≥10或11，其中一个检测结果如图3所示；
PIK3CA基因突变样本11例，突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct＜10，其中一个检测结果如图4所示。
上述检测结果中有3例样本用本发明的检测方法检测为PIK3CA基因突变阳性，而测序结果为野生型，再次重复测序结果表明该样品发生PIK3CA基因突变，突变丰度较低。其余47例样本测序结果与荧光定量PCR检测结果一致，与直接测序的符合率≥94％。
实施例3
制备PIK3CA基因突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：
1.合成引物及探针序列(同实施例1)
2.合成阻断核酸序列(同实施例1)
3.荧光定量PCR反应体系的制备
分别制备含有第1-5号试剂的突变检测反应体系、含有第6号试剂的质控检测反应体系、含有酶混合液的第7号试剂、弱阳性对照和空白对照，各组分如下表3所示：
表3第1-9号试剂的组分
上述PCR缓冲液含有dNTPs、镁离子等PCR反应所必需的组分。
实施例4
用实施例3制备的PIK3CA基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。
本实施例中收集30例临床病理诊断为结直肠癌患者的石蜡包埋组织切片，并从中提取基因组DNA，用实施例3中得到的PIK3CA基因突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L突变，同时采用传统测序的方法进行验证，具体操作步骤为：
1.样品基因组DNA的提取(同实施例2)
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取5μl分别加入实施例3的试剂盒的质控检测反应体系和突变检测反应体系中，同时将实施例3中的第7号试剂依次取0.5μl分别加入上述6个检测反应体系中，使6个反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
37℃10min；95℃5min；
95℃20s，63℃20s，72℃20s，15个循环；
95℃20s，60℃30s，72℃20s，30个循环；
每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，并设置ROX荧光校正。
3.样本的检测结果分析
具体判读方法可参照实施例2中所述。
30例临床样本中，PIK3CA基因E542、E545、E545、H1047和H1047位点野生型样本25例，其中22例样本突变检测无Ct值，3例样本突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct≥10或11；PIK3CA基因突变样本5例，突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct＜10或11。
上述检测结果中有1例样本用本发明的检测方法检测为PIK3CA基因突变阳性，而测序结果为野生型，再次重复测序结果表明该样品发生PIK3CA基因突变，突变丰度较低。其余29例样本测序结果与荧光定量PCR检测结果一致，与直接测序的符合率≥96.7％。
以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类PIK3CA基因突变检测结果可靠，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种用于检测受试者中PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括分开设置的第1-6号试剂，并且：
a.第1号试剂包含序列为SEQ ID NO:1的正向引物、序列为SEQ IDNO:2的反向引物和探针A；
b.第2号试剂包含序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ IDNO:2的反向引物和探针A；
c.第3号试剂包含序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ IDNO:2的反向引物、探针A和MGB阻断核酸C；
d.第4号试剂包含序列为SEQ ID NO:7的正向引物、序列为SEQ IDNO:8的反向引物和探针B；
e.第5号试剂包含序列为SEQ ID NO:10的正向引物、序列为SEQ IDNO:8的反向引物和探针B；
f.第6号试剂包含序列为SEQ ID NO:11的正向引物、序列为SEQ IDNO:2的反向引物和探针A；
其中探针A由序列为SEQ ID NO:3的核酸、该核酸的5’端连接的荧光报告基团和该核酸的3’端连接的荧光淬灭基团组成；
探针B由序列为SEQ ID NO:9的核酸、该核酸的5’端连接的荧光报告基团和该核酸的3’端连接的荧光淬灭基团组成；
所述的MGB阻断核酸C的核酸序列为SEQ ID NO:6，其包括MGB基团修饰，且3’端脱氧核糖核苷酸骨架上的3’羟基被封闭；
优选地，所述的受试者是人类癌症患者；
进一步优选地，所述的受试者是采用了PI3K抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)等PI3K通路相关靶向药物治疗的人类癌症患者。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述的第1号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的正向引物、序列为SEQID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
所述的第2号试剂中，序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
所述的第3号试剂中，序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQID NO:2的反向引物、探针A和MGB阻断核酸C的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM：0.8μM-4μM；
所述的第4号试剂中，序列为SEQ ID NO:7的正向引物、序列为SEQID NO:8的反向引物和探针B的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
所述的第5号试剂中，序列为SEQ ID NO:10的正向引物、序列为SEQID NO:8的反向引物和探针B的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
所述的第6号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的正向引物、序列为SEQID NO:2的反向引物和探针A的摩尔比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM。
3.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，在所述探针A和探针B中，所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、HEX、CY3、CY5和波长范围相似的其它荧光报告基团；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ，并且荧光报告基团与荧光报告基团的搭配根据荧光能量共振转移原理来选择；
优选地，所述的探针A和探针B的3’端荧光淬灭基团是MGB-NFQ。
4.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第1-6号试剂中还分别包含PCR缓冲液、ROX参比染料和Taq酶的一种或多种；
优选地，所述的PCR缓冲液包含Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs；
进一步优选地，所述的Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs的浓度分别为50-100mM、5-30mM、1-8mM、5％-15％、和100-200μM。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含PCR添加剂；
优选地，所述的PCR添加剂为DMSO、甜菜碱、BSA、甲酰胺或甘油。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第1-6号试剂中包含由dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶形成的抗污染系统；
优选地，所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP物质的量的比例为0.1mM-0.5Mm；0.2mM-1mM；0.1mM-0.5mM；0.1mM-0.5mM。
7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第1-5号试剂中分别包含根据特定基因序列设计的内标引物探针；
优选地，所述内标引物探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14；
进一步优选地，核酸序列为SEQ ID NO:14的内标探针的5’端连接有荧光报告基团、3’端连接有荧光淬灭基团；
更优选地，核酸序列为SEQ ID NO:14的内标探针的荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第3号试剂中的MGB阻断核酸C的3’羟基采用的是MGB-NFQ封闭。
9.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第3号试剂中的MGB阻断核酸C中的MGB修饰可以存在于不同位置；优选地，所述的MGB修饰是5’端修饰、3’端修饰或其位于核酸的中间部位等对试剂性能无较大改善的修饰位置。
10.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第3号试剂中的MGB阻断核酸C还包括增加并变换修饰基团但对试剂性能无较大改善的其它修饰；
优选地，所述的其他修饰选自磷酸化修饰、荧光报告基团修饰、荧光淬灭基团修饰和锁核酸修饰。
11.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液、空白对照、弱阳性质控、强阳性质控、点样用指示剂或样品稀释液的一种或多种。
12.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂。
13.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第7号试剂，该第7号试剂是酶混合液；
优选的，所述的酶混合液由热启动Taq酶、UNG酶和甘油组成。
14.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第8号试剂，该第8号试剂是空白对照；
优选地，所述的空白对照是pH为8.0的10mM Tris-HCl。
15.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第9号试剂，该第9号试剂是弱阳性对照试剂；
优选地，该弱阳性对照试剂是含有PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L的5种突变类型质粒和内标质粒的混合液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Applicant after: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Applicant before: Wuhan YZY Biopharma Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430075 East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, 388, No. two, No., Wuhan Optics Valley international bio pharmaceutical enterprise accelerator, 1-2, 23, 1, 4, 5 Applicant after: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Applicant before: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150225 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |