CN103014147A - 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒 - Google Patents

多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。具体地，本发明提供能够以高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针。所述多态性检测用探针为作为选自P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸的、用于检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针。

Description

多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒
技术领域
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。
背景技术
PIK3CA基因编码PI3激酶，该PI3激酶调节对肿瘤形成起着重要功能的信号通路。已知肿瘤组织中常见PIK3CA基因的突变，其中尤其是G1624A(E542K)突变、G1633A(E545K)突变以及A3140G(H1047R)突变被高频率被发现(例如参见Science.(2004)Apr23；304(5670)：554(非专利文献1)以及Oncogene.(2005)Feb17；24(8)：1477-80(非专利文献2))。
在上述三处存在突变的情况下，报告了不能获得以西妥昔单抗(其被用作不能切除的大肠癌的治疗药)为代表的抗EGFR抗体药的效果(例如，Cancer Res.(2009)；69：(5).March1，2009(非专利文献3)、BMC Cancer.(2011)Mar25；11：107(非专利文献4))。
西妥昔单抗之类的分子靶向药非常昂贵，而且有可能产生间质性肺炎等严重的副作用。因此，在给药前测定与药效相关的基因突变，对能够期待药效的患者选择性施与药剂是极为重要的。这种准确且短时间、低成本、简便地测定基因突变的方法备受期待。
目前，作为测定基因的多态性的方法，已知通过PCR法扩增含有突变的区域之后，使荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料的发光的减少量，基于熔解曲线分析结果来分析碱基序列的突变的方法(参见日本专利文献特开2002-119291号公报(专利文献1))。
发明内容
发明要解決的课题
在非专利文献1和非专利文献3中，通过直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是，直接测序法中，在进行PCR之后，必须进行测序反应，通过测序仪进行电泳等，需要工夫和成本。另外，由于要处理扩增产物，因此扩增产物有可能混入下一反应体系中。
在非专利文献2中，结合PCR-SSCP(单链构象多态性，Single StrandConformation Polymorphism)法和直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是，在PCR-SSCP法中，在进行PCR之后需要对扩增产物进行电泳，需要工夫和成本。另外，由于需要处理扩增产物，扩增产物有可能混入下一反应体系中。
在非专利文献4中，使用QIAGEN的试剂盒通过Scorpion ARMS法来检测PIK3CA的突变。但是，Scorpion ARMS法需要购买试剂盒。另外，除试剂盒之外，还需要另外的实时PCR装置，需要成本。而且，对每个突变都需要不同的试剂和反应管，需要工夫和成本。
专利文献1中通过使用核酸探针的方法来检测多态性。但是专利文献1中，关于核酸探针的设计，仅给出如下启示：将核酸探针设计为末端部用荧光染料标记的淬灭探针在与靶标序列杂交时，末端部分中形成的核酸探针和靶标序列的杂交体的多个碱基对至少形成一个G和C的对。因此，在专利文献1中记载的方法中，需要使用具有对每个突变型都适当的序列的核酸探针。
另外，通过本发明者的研究，弄清了在核酸探针的序列中，如果GC含量过高，则淬灭探针不会充分起作用。
由于这些现状，人们期待着用于检测PIK3CA基因多态性的进一步的技术开发。
本发明的课题在于，提供能够高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针、使用其的多态性检测方法。另外，本发明的课题在于，提供使用该多态性检测方法的药效判定方法。而且，本发明课题在于，提供使用该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。
用于解决课题的手段
本发明者获得了如下见解：通过基于含有PIK3CA基因的多态性的特定区域来设计淬灭探针，通过使用淬灭探针进行熔解曲线分析能够检测PIK3CA基因的多态性。本发明是基于相关见解而实现的。
本发明如下所述。
<1>一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸，
(P1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(Pl’)寡核苷酸，其与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P11)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；以及
(P11’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。
<2>根据<1>所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针为选自下述P1-1～P11’-1的至少一种荧光标记寡核苷酸，
(P1-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的、碱基的碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种的多态性；
(P1’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性；
(P2-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P2’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P3-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P3’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P4-1)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P4’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P5-1)寡核苷酸，其相对于和序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P5’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P6-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P6’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P7-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P7’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P8-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P8’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P9-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P9’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P10-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P10’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P11-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P11’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
<3>根据<1>或<2>所述的多态性检测用探针，其中，
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第226位的碱基对应的碱基；
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第139位的碱基对应的碱基；
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第165位的碱基对应的碱基；
所述P4或P4’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第167位的碱基对应的碱基；
所述P5或P5’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第164位的碱基对应的碱基；
所述P6或P6’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第163位的碱基对应的碱基；
所述P7或P7’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第161位的碱基对应的碱基：
所述P8或P8’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第160位的碱基对应的碱基；
所述P9或P9’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第144位的碱基对应的碱基；
所述P10或P10’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第148位的碱基对应的碱基；或者
所述P11或P11’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第151位的碱基对应的碱基。
<4>根据<1>～<3>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第226位的碱基对应的碱基；
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第139位的碱基对应的碱基；
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第165位的碱基对应的碱基；
所述P4或P4’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第167位的碱基对应的碱基；
所述P5或P5’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第164位的碱基对应的碱基；
所述P6或P6’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第163位的碱基对应的碱基；
所述P7或P7’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第161位的碱基对应的碱基；
所述P8或P8’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第160位的碱基对应的碱基；
所述P9或P9’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第144位的碱基对应的碱基；
所述P10或P10’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第148位的碱基对应的碱基；或者
所述P11或P11’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第151位的碱基对应的碱基。
<5>根据<1>～<4>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，且与未杂交时的荧光强度相比，在与靶标序列杂交时的荧光强度减少或增加。
<6>根据<1>～<5>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述探针为用于熔解曲线分析的探针。
<7>根据<1>～<6>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述探针具有选自由序列编号6、序列编号7、序列编号8、序列编号9、序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15、序列编号16、序列编号17、序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21和序列编号22组成的组的至少一种碱基序列。
<8>一种多态性检测方法，其通过使用<1>～<7>中任一项所述的探针来检测PIK3CA基因的多态性。
<9>根据<8>所述的多态性检测方法，包括：
(I)使<1>～<7>中任一项所述的探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的PIK3CA基因中的多态性的存在。
<10>根据<9>所述的多态性检测方法，还包括：
(V)基于所述多态性的存在，来检测所述试样中的单链核酸中的、具有多态性的单链核酸的丰度比。
<11>根据权利要求<9>或<10>所述的多态性检测方法，还包括：
在所述(I)的获得杂交体之前或者与(I)的获得杂交体的同时扩增核酸。
<12>一种抗癌药的药效的判定方法，其包括通过<8>～<11>中任一项所述的多态性检测方法，来检测PIK3CA基因中的多态性；以及基于所检测的多态性的有无来判定抗癌药的药效。
<13>一种多态性检测用试剂盒，其用于检测PIK3CA基因中的多态性，包含<1>～<7>中任一项所述的探针。
<14>根据<13>所述的多态性检测用试剂盒，还包含用于扩增与所述探针杂交的区域的碱基序列的引物。
发明的效果
根据本发明，能够提供能够高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针，使用其的多态性检测方法。另外，本发明能够提供使用该多态性检测方法的药效判定方法。而且，本发明能够提供使用该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。
附图说明
图1的(A)是核酸混合物的熔解曲线的一个例子，图1的(B)是微分熔解曲线的一个例子；
图2的(A)～(N)是本发明的实施例1涉及的试样的微分熔解曲线；
图3是本发明的实施例2涉及的试样的微分熔解曲线；
图4的(A)～(H)是本发明的比较例1涉及的试样的微分熔解曲线。
具体实施方式
本发明涉及的PIK3CA基因的多态性检测用探针(以下，有时简称“多态性检测用探针”)用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸，
(P1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P1’)寡核苷酸，其与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P11)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；以及
(p11’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。
本发明涉及的PIK3CA基因多态性检测方法为如下方法，包括：使用至少一种所述用于检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针来检测PIK3CA基因的多态性。
本发明涉及的药效的判定方法如下方法：其包括通过所述PIK3CA基因多态性检测方法，来检测PIK3CA基因中的多态性；以及基于所检测的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或药剂的药效。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒包含用于检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针。
本发明中的“PIK3CA基因”已经是公知的，其碱基序列表示NCBI的登录号No.NG012113的50001～91190的序列。
PIK3CA基因编码PI3激酶-Akt信号通路的PI3激酶，PI3激酶-Akt信号通路对调节细胞的分化、发育、增殖、维持起着重要的作用。
序列编号1的碱基序列为NCBI的dbSNP的登录号No.NG012113的74541～74960的碱基序列，相当于对应于PIK3CA基因的外显子9的核酸的碱基序列的一部分。
序列编号2的碱基序列为序列编号1所示的第232位的碱基G(鸟嘌呤)突变为A(腺嘌呤)的碱基序列(以下也称“G1624A”)。
序列编号3的碱基序列为序列编号1所示的第241位的碱基G突变为A的碱基序列(以下，也称“G1633A”)。
序列编号4的碱基序列为NCBI的dbSNP的登录号No.NG012113的90621～90920的碱基序列，相当于与PIK3CA基因的外显子20对应的核酸的碱基序列的一部分。
序列编号5的碱基序列为序列编号4所示的第155位的碱基A突变为G的碱基序列(以下也称“A3140G”)。
本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，在本领域技术人员的技术常识的范围内，由该互补的序列识别的序列视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。
在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。在本发明中的Tm值只要不作特别限定，是吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。
在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第1～3位”时，是以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。同样地，当称为“从5’末端起数的第1～3位”时，是以寡核苷酸链的5’末端为第1位起数的。
在本说明书中，“步骤”一词不仅包含独立的步骤，即使在不能与其他的步骤明确区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果，则都包含在本术语之内。
另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围为将“～”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值所包含的范围。
另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量的意思。
本说明书中，突变是指由于野生型的碱基序列的一部分碱基被取代、缺失、重复或者插入而产生的新的碱基序列。另外，多态性是指由于突变而产生的碱基序列的多态性。
下面说明本发明。
<PIK3CA基因多态性检测用探针>
本发明的PIK3CA基因的多态性检测用探针(以下，也简称“多态性检测用探针”)是用于检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针，所述多态性检测用探针为选自P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸。
作为本发明中的所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸，被确认与所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸具有同源性的荧光标记寡核苷酸也包含在本发明的荧光标记寡核苷酸中。
具体而言，本发明中确认了同源性的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，优选显示80％以上的同一性。
另外，从检测灵敏度的观点来看，也可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。通过显示80％以上的同一性，具有针对含有突变型的PIK3CA基因的试样核酸的检测灵敏度高等优点。
另外，作为本发明的所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸，只要显示与所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用，与所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸的互补链在严格条件下杂交的荧光标记寡核苷酸也包含在本发明的荧光标记寡核苷酸中。
杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如MolecularCloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。
严格条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严格条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2下进行杂交的条件，但不限于此。此外，严格条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。
另外，作为本发明中的所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸，包括在所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。
该插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或取代的碱基的数量可以举出1个碱基或2个碱基以上，该数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出1个碱基～10个碱基，优选为1个碱基～5个碱基。
作为所述荧光标记寡核苷酸中的寡核苷酸，除了寡核苷酸之外，还包括经修饰的寡核苷酸。
作为所述寡核苷酸的构成单位，可举出核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、人工核酸等。作为所述人工核酸，可举出DNA、RNA、作为RNA类似物的LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)；作为肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid)作为桥联化核酸的BNA(Bridged NucleicAcid)等。
所述寡核苷酸可以是所述构成单位中的一种构成的，也可以是多种构成的。
在所述P1～P11’荧光标记寡核苷酸中，被荧光标记的碱基优选存在于从寡核苷酸的末端起数第1～3位的任一位置，更优选存在于寡核苷酸的末端。由此，例如，多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产率良好地获得P1～P11’荧光标记寡核苷酸。
以下，从所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸开始，依次对本发明涉及的荧光标记寡核苷酸的详细进行说明。
本发明中的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸为能够检测选自由序列编号1所示的碱基序列的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性的探针。
PIK3CA基因的野生型中，与序列编号1所示的序列中的第232位对应的碱基为G(鸟嘌呤)，在突变型中突变成A(腺嘌呤)(以下也称“G1624A”)，该碱基对应于PIK3CA基因的第1624位的碱基。
PIK3CA基因的野生型中，与序列编号1所示的序列中的第241位对应的碱基为G(鸟嘌呤)，在突变型中突变成A(腺嘌呤)(以下也称“G1633A”)，该碱基对应于PIK3CA基因的第1633位的碱基。
本发明中的所述P1荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号1～序列编号3所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的碱基长7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。另外，需要与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
另外，从检测灵敏度的观点来说，本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号1～序列编号3所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的碱基长7～50的碱基序列，可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。在同一性低于80％的情况下，针对含有突变型的PIK3CA基因的试样核酸的检测灵敏度变低。
另外，从检测序列编号1所示的碱基序列的第241位的碱基的多态性的观点来看，可以举出P1荧光标记寡核苷酸为如下碱基序列的方式，所述碱基序列相对于序列编号1～序列编号3所示碱基序列中的第226位～第241位的碱基的碱基长16～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。
从检测灵敏度的观点来说，P1荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号1～序列编号3所示的碱基序列中的第226位～第241位的碱基的碱基长16～50的碱基序列，可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。通过显示80％以上的同一性，具有针对含有突变型的PIK3CA基因的试样核酸的检测灵敏度高等的优点。
本发明的所述P1’荧光标记寡核苷酸与含有序列编号1～序列编号3所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。需要与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
杂交、严格条件使用已经说明的事项。以下相同。
另外，从检测序列编号1所示的碱基序列的第241位的碱基的多态性的观点来看，优选如下方式，P1’荧光标记寡核苷酸为与含有序列编号1～序列编号3所示的碱基序列中的第226位～第241位的碱基的、碱基长16～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交的碱基序列。
作为本发明的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是7mer～50mer。在所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的长度小于7mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低。
另外，作为本发明的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为10mer～40mer、14mer～30mer或16mer～25mer。通过使之为10mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
通过改变所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长，能够将荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节到期望的值。
表1中示出本发明中的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的一个例子，但是本发明不限于此。此外，在表中，大写字母表示显示多态性的碱基。以下相同。
另外，表1中，带下划线的胞嘧啶表示序列编号1～3所示的碱基序列中的第226位的胞嘧啶。
表1
  序列编号
  P1   5T-PIK3CA G1633A F1-19   (TAMRA)-ctctctGaaatcactAagc-P   6
  P1   5FL-PIK3CA-G1624A-F1   (BODIPY FL)-ctctctAaaatcactGagc-P   7
另外，本发明的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸需要第226位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以设为与未杂交时的荧光强度相比，在与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以为与未与靶标序列杂交时的荧光强度相比，与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。
利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知所谓Q Probe(注册商标)。其中可以举出如下的寡核苷酸：其被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并用荧光染料标记该末端的C使其靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这样的探针，则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。
此外，除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。
作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料的市售产品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。
所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在波长445～480nm下检测，TAMRA能够在波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520～555nm下检测。
如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。
另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液中。
另外，通过在3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。
所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸能够作为检测PIK3CA基因的多态性、尤其是选自G1624A和G1633A构成的组的多态性的至少一者的多态性PIK3CA基因多态性检测用探针使用。
另外，PIK3CA基因多态性检测用探针能够用作用于熔解曲线分析的探针。
本发明涉及的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸除了在序列编号1所示的碱基序列中与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，并且与第226位的碱基对应的胞嘧啶使用通过荧光染料标记了的碱基之外，能够按照被已知为寡核苷酸的合成方法的公知方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。
作为所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的更优选的方式，可以举出下面的P1-1和P1’-1荧光标记寡核苷酸。
(P1-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的、碱基的碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种的多态性；以及
(P1’-1)寡核苷酸，其为与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性。
此外，“识别选自序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性”与“和显示选自序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性的碱基结合”同义。
以下，对所述P2～所述P11’荧光标记寡核苷酸进行说明，对于与关于上述的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的说明重复的部分，引用上述的说明。
本发明的所述P2、P2’、P3和P3’荧光标记寡核苷酸为能够检测序列编号4所示的碱基序列的第155位的碱基的多态性的探针。
在PIK3CA基因的野生型中，与序列编号4所示的序列中的第155位对应的碱基为A，在突变型中突变成G(以下也称“A3140G”)，该碱基对应于PIK3CA基因的第3140位的碱基。
本发明中的所述P2荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的碱基长17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。关于同一性，引用所述P1荧光标记寡核苷酸的说明。
本发明的所述P2’荧光标记寡核苷酸与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的碱基长17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的碱基长11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。关于同一性，引用所述P1荧光标记寡核苷酸的说明。
本发明的所述P3’荧光标记寡核苷酸与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的碱基长11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
作为本发明的所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的长度，需要为17mer～50mer。在所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的长度小于17mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的长度，可以设为17mer～40mer、17mer～30mer、18mer～25mer。通过使之为17mer～40mer的范围，例如具有检测灵敏度进一步变高等的倾向。
作为本发明的所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的长度，需要为11mer～50mer。在所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的长度小于11mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度变低，不优选。
另外，作为本发明的所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的长度，可以设为11mer～40mer、12mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为11mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等倾向。
通过改变所述P2、P2’、P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长，能够将荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节到期望的值。
表2中示出本发明中所述P2、P2’、P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基序列的例子，但是本发明不限于这些。
另外，表2的序列编号8中，带下划线的胞嘧啶表示序列编号4或5所示的碱基序列中的第139位的胞嘧啶。表2的序列编号9和10中，带下划线的胞嘧啶表示序列编号4或5所示的碱基序列中的第165位的胞嘧啶。
表2
  序列编号
  P1   5T-PIK3CA G1633A F1-19  (TAMRA)-ctctctGaaatcactAagc-P   6
  P1   5FL-PIK3CA-G1624A-F1  (BODIPY FL)-ctctctAaaatcactGagc-P   7
本发明的所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸需要第139位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸需要第165位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
所述P2、P2’、P3和P3’荧光标记寡核苷酸能够作为检测PIK3CA基因的多态性、尤其是检测A3140G突变的PIK3CA基因多态性检测用探针使用。
另外，PIK3CA基因多态性检测用探针能够作为用于熔解曲线分析的探针使用。
作为所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的更优选的方式，可以举出以下的P2-1和P2’-1荧光标记寡核苷酸。
(P2-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P2’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的更优选的方式，可以举出以下P3-1和P3’-1荧光标记寡核苷酸。
(P3-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P3’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
本发明中的所述P4～所述P11’荧光标记寡核苷酸为能够检测与序列编号4所示的碱基序列互补的碱基序列的多态性的探针，尤其是能够检测序列编号4所示的碱基序列的第155位的碱基的多态性。
本发明中的所述P4荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的碱基长13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。关于同一性，引用所述P1的荧光标记寡核苷酸中的说明。以下相同。
本发明中所述P4’荧光标记寡核苷酸与和含有序列编号4或序列编号5所示碱基序列中的第155位～第167位的碱基的碱基长13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明中的所述P5荧光标记寡核苷酸为相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的碱基长10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明中的所述P5’荧光标记寡核苷酸为与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的碱基长10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P6荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P6’荧光标记寡核苷酸与序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P7荧光标记寡核苷酸相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的、第155位～第161位的碱基的碱基长7～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。
本发明的所述P7’荧光标记寡核苷酸为与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P8荧光标记寡核苷酸相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长6～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P8’荧光标记寡核苷酸与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P9荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的碱基长12～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P9’荧光标记寡核苷酸与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的碱基长12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P10荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长8～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。
本发明的所述P10’荧光标记寡核苷酸寡核苷酸与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，需要与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P11荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长5～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性。此外，需要与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
本发明的所述P11’荧光标记寡核苷酸寡核苷酸与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交。此外，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。
作为本发明的所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是13mer～50mer。在所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的长度小于13mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为13mer～40mer、13mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为13mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是10mer～50mer。在所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的长度小于10mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为10mer～40mer、12mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为10mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P6和P6’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是9mer～50mer。在所述P6和P6’荧光标记寡核苷酸的长度小于9mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P6和P6’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为9mer～40mer、11mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为9mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P7和P7’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是7mer～50mer。在所述P7和P7’荧光标记寡核苷酸的长度小于7mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P7和P7’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为7mer～40mer、10mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为7mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P8和P8’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是6mer～50mer。在所述P8和P8’荧光标记寡核苷酸的长度小于6mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P8和P8’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为7mer～40mer、10mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为7mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P9和P9’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是12mer～50mer。在所述P9和P9’荧光标记寡核苷酸的长度小于12mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P9和P9’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为12mer～40mer、12mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为12mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P10和P10’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是8mer～50mer。在所述P10和P10’荧光标记寡核苷酸的长度小于8mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P10和P10’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为8mer～40mer、11mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为8mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
作为本发明的所述P11和P11’荧光标记寡核苷酸的长度，需要是5mer～50mer。在所述P11和P11’荧光标记寡核苷酸的长度小于5mer或大于50mer的情况下，PIK3CA基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。
另外，作为本发明的所述P11和P11’荧光标记寡核苷酸的长度，可以为7mer～40mer、10mer～30mer、13mer～25mer。通过使之为7mer～40mer的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。
通过改变所述P4～P11’荧光标记寡核苷酸的碱基长，能够将荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节到期望的值。
本发明的P1～P11’荧光标记寡核苷酸与野生型的试样核酸杂交时的Tm值和与突变型的试样核酸杂交时的Tm值可以设为1.5℃以上、2.0℃以上、5.0℃以上、9.0℃以上。
作为增大所述Tm值之差的方法，例如可以举出针对与探针杂交的区域对应的的碱基序列，使该探针中含有错配的碱基的方法。具体而言，可以举出NatureBiotech(1997)voll5 p.331-335等中记载的方法。
表3中示出本发明的所述P4～所述P11’荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的一个例子，但是本发明不限于此。
另外，在表3中，带下划线的胞嘧啶表示序列编号4或5所示的碱基序列中、对应于以下所示的碱基的胞嘧啶。序列编号11表示第167位的胞嘧啶、序列编号12表示第164位的胞嘧啶、序列编号13表示第163位的胞嘧啶、序列编号14表示第161位的胞嘧啶、序列编号15表示第161位的胞嘧啶、序列编号16表示第160位的胞嘧啶、序列编号17表示第144位的胞嘧啶、序列编号18表示第148位的胞嘧啶、序列编号19表示第151位的胞嘧啶、序列编号20表示第144位和第161位的胞嘧啶、序列编号21表示第148位和第164位的胞嘧啶、序列编号22表示第163位的胞嘧啶。
表3
  序列编号
  P4   5T-PIK3CA3140-Mt-R9   (TAMRA)-cagccaccatgaCgtgc-P   11
  P5   5T-PIK3CA3140-Mt-R10   (TAMRA)-ccaccatgaCgtgcatca-P   12
  P6   5T-PIK3CA3140-Mt-R11   (TAMRA)-caccatgaCgtgcatca-P   13
  P7   5T-PIK3CA A3140G R1-17   (TAMRA)-ccatgaCgtgcatcatt-P   14
  P7   5PB-PIC3CA A3140G R1   (Pacific Blue)-ccatgaCgtgcatcatt-P   15
  P8   5T-PIK3CA3140-Mt-R12   (TAMRA)-catgaCgtgcatcattcat-P   16
  P9   3T-PIK3CA3140-Mt-R16   accatgaCgtgcatcattc-(TAMRA)   17
  P10   3T-PIK3CA3140-Mt-R17   ccaccatgaCgtgcatc-(TAMRA)   18
  P11   3T-PIK3CA3140-Mt-R18   cagccaccatgaCgtgc-(TAMRA)   19
  P7～P9   35T-PIK3CA-3140-R19   (TAMRA)-ccatgaCgtgcatcattc-(TAMRA)   20
  P5～P11   35T-PIK3CA-3140-R20   (TAMRA)-ccaccatgaCgtgcatc-(TAMRA)   21
  P6   T-PIK3CA-3140-R21   c(c-(TAMRA))atgaCgtgcatcattc-P   22
本发明的所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸需要第167位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸需要第164位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P6和P6’荧光标记寡核苷酸需要第163位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P7和P7’荧光标记寡核苷酸需要第161位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P8和P8’荧光标记寡核苷酸需要第160位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P9和P9’荧光标记寡核苷酸需要第144位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P10和P10’荧光标记寡核苷酸需要第148位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
本发明的所述P11和P11’荧光标记寡核苷酸需要第151位的碱基(胞嘧啶)用荧光染料标记。
所述P4～所述P11’荧光标记寡核苷酸能够作为检测PIK3CA基因的多态性、尤其是检测A3140G突变的PIK3CA基因多态性检测用探针使用。
另外，PIK3CA基因多态性检测用探针能够作为用于熔解曲线分析的探针使用。
作为所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P4-1和P4’-1荧光标记寡核苷酸。
(P4-1)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P4’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P5-1和P5’-1荧光标记寡核苷酸。
(P5-1)寡核苷酸，其相对于和序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P5’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P6和P6’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P6-1和P6’-1荧光标记寡核苷酸。
(P6-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P6’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P7和P7’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P7-1和P7’-1荧光标记寡核苷酸。
(P7-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P7’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P8和P8’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P8-1和P8’-1荧光标记寡核苷酸。
(P8-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P8’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P9和P9’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P9-1和P9’-1荧光标记寡核苷酸。
(P9-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P9’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P10和P10’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可以举出以下的P10-1和P10’-1荧光标记寡核苷酸。
(P10-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P10’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
作为所述P11和P11’荧光标记寡核苷酸的更为优选的方式，可举出以下的P11-1和P11’-1荧光标记寡核苷酸。
(P11-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P11’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
<引物>
在后述的PIK3CA基因多态性检测方法中，在通过PCR法扩增含有作为检测对象的PIK3CA基因多态性的序列时，使用引物。
可在本发明中使用的引物只要是能够扩增含有如下碱基的核酸则无特别限制，所述碱基显示选自作为目标检测对象的PIK3CA基因的多态性的位点的、G1624A突变、G1633A突变和A3140G突变构成的组的多态性的至少一者的多态性。
PCR法中应用的引物只要能够扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列则无特别限制，本领域技术人员能够基于序列编号1～序列编号5所示的碱基序列而适当设计。引物的长度及Tm值可以设为12mer～40mer和40℃～70℃、或16mer～30mer和55℃～60℃。
另外，引物对的各引物的长度可以不相同，但是两条引物的Tm值优选大致相同(或者，两条引物之间的Tm值之差为5℃以内)。
以下示出能够用于扩增含有与本发明的多态性检测方法中本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的例。此外，这些仅为示例而已，并不限制本发明。在表4中，Y表示C或T。
表4
  序列(5′→3′)   mer   序列编号
  PIK3CA ex9 F   gaacagctcaaagcaatttctacacgag   28   23
  PIK3CA ex9 R   cagagaatYtccattttagcacttacYtgtgac   33   24
  PIK3CA A3140G F   gaggctttggagtatttcatgaaacaaatg   30   25
  PIK3CA A3140G R   gcatgctgtttaattgtgtggaagatccaatc   32   26
在扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列时，从灵敏度和效率的观点出发，可以举出表4所示的各寡核苷酸中将PIK3CA ex9F和PIK3CA ex9R、PIK3CA A3140G F和PIK3CA A3140G R分别作为一对引物对使用。
多态性的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸作为探针使用的方法则无特别限制。作为将所述荧光标记核苷酸用作探针的多态性检测方法的一个例子，下面针对利用Tm分析的多态性检测方法进行说明。
<多态性检测方法>
本发明涉及的PIK3CA基因多态性检测方法为包括使用至少一种所述PIK3CA基因多态性检测用探针、来检测PIK3CA基因的多态性的PIK3CA基因多态性检测方法。
根据本发明涉及的多态性检测方法，通过包括至少一种所述多态性检测用探针，能够简便地、高灵敏度地检测PIK3CA基因的多态性。
另外，本发明的多态性检测方法为PIK3CA基因的多态性的检测方法能够包括下述步骤(I)～步骤(IV)，也可以包括下述步骤(V)。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的构成和条件不限于以下的记载。
(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的PIK3CA基因中的多态性的存在；
(V)基于所述多态性的存在，来检测所述试样中的单链核酸中的、具有多态性的单链核酸的丰度比。
另外，在本发明中，除了上述步骤(I)～(IV)或上述步骤(I)～(V)之外，还可以在所述(I)的获得杂交体之前或者与(I)的获得杂交体的同时扩增核酸。
此外，在(III)中测定Tm值时，可以不仅仅包括测定杂交体的解离温度，而且还可以包括在杂交体形成体熔解时测定随着温度而变动的荧光信号的微分值的大小。
在本发明中，试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。在所述核酸为双链核酸的情况下，例如能够在与所述荧光标记寡核苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。
在本发明中，作为检测对象的试样中包含的核酸，例如可以是生物试样中本来含有的核酸，但是从能够提高检测精度的角度，可以举出以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增法扩增含有PIK3CA基因的突变了的位点的区域而得到的扩增产物。所述扩增产物的长度无特别限制，例如可以设为50～1000mer或者80～200mer。另外，试样中的核酸例如可以是从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。
在本发明中，本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以举出1倍以下。另外，从充分确保检测信号的观点来说，可以将本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。
这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为10倍以下。另外，相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为5倍以下或3倍以下。另外，其下限无特别限制，例如可以设为0.001倍以上，0.01倍以上或0.1倍以上。
本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。
在本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以基于前述那样的原理，通过260nm的吸光度测定来进行，可以举出测定如下信号：所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动。因此，作为所述多态性检测用探针可以举出使用荧光标记寡核苷酸。作为所述荧光标记寡核苷酸，例如可以举出和未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度相比，与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸，或者和未与靶标序列杂交时的荧光强度相比，未与靶标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。
如果是前者那样的探针，则在该探针和检测对象序列形成了杂交体(双链DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热而探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。
另外，如果是后者的探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示荧光信号，通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在所述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行熔解的发生以及Tm值的确定。
接着，关于本发明的多态性检测方法，举出检测基于荧光染料的信号的变化的方法的具体例来进行说明。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的步骤和条件没有任何限制。
作为含有进行核酸扩增时的模板的试样，只要是含有核酸尤其是PIK3CA基因即可，无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。
例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。
接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。
所述多态性检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制，例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。
所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中，也可以在扩增处理前添加。
如此，在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检测用探针的情况下，例如，如前所述，可以举出在所述检测用探针的3’末端添加荧光染料，或者添加磷酸基。
作为核酸扩增的方法，例如可以举出利用聚合酶的方法等。作为其示例，可以举出PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过利用聚合酶的方法进行扩增的情况下，可以举出在本发明探针存在的情况下进行扩增。根据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等对本领域技术人员来说是容易的。由此，在核酸扩增后仅通过分析探针的Tm值就能够评价多态性的有无，因此在反应结束之后不需要处理扩增产物。由此，不用担心所述扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。
另外，作为使用PCR法的DNA聚合酶，可以使用通常所用的DNA聚合酶，无特别限制。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。
作为聚合酶的使用量，只要是采用通常使用的浓度即可，无特别限制。例如在使用Taq聚合酶的情况下，例如相对于反应溶液量50μl，可以为0.01U～100U的浓度。由此，具有PIK3CA基因多态性的检测灵敏度变高等的倾向。
另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。
此外，在扩增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视，能够检测试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变DNA)的拷贝数和丰度比。
在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触，由此使两者杂交。试样中的单链核酸例如能够通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。
所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度则无特别限制。例如为85～95℃。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为1秒～10分钟，或1秒～5分钟。
另外，解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40～50℃。
杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μM～1μM，或0.1μM～0.5μM。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围，例如可以为0.001μM～10μM，或0.001μM～1μM。
然后，将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体慢慢加热，测定随温度上升的荧光信号的变动。例如当使用了Q Probe时，在其与单链DNA杂交的状态下，与解离状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如将荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热并测定随温度上升的荧光强度的增加即可。
对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。
接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度来计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。
另外，在本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加)，但替代该方法，例如也可以测定杂交体形成时的信号变动。即，也可以对降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体时随所述温度下降的荧光信号变动进行测定。
作为具体例，在使用Q Probe的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。
另一方面，在使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但是在由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。
<药效判定方法>
本发明的药效判定方法包括：通过上述的多态性检测方法来检测PIK3CA基因的多态性；以及基于所述检测结果来判定对抗癌药的耐受性或者抗癌药的药效。
在上述的多态性检测方法中，使用本发明的多态性检测用探针来灵敏度良好且简便地检测PIK3CA基因的多态性，因此能够基于PIK3CA基因中的该多态性来灵敏度良好且简便地进行抗癌药的判定。
另外，能够基于多态性的有无或者突变序列和正常序列的丰度比来判定对抗癌药的耐受性或抗癌药的药效。并且，本发明的抗癌药的药效判定方法在基于有无突变、突变序列的丰度比来确定疾病的治疗方针中有用，例如增加药剂施与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。
另外，作为判定对象的抗癌药，具体可举出西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)等。
<多态性检测用试剂盒>
本发明的用于检测PIK3CA基因的多态性的PIK3CA基因多态性检测用试剂盒包含上述的多态性检测用探针。
该多态性检测用试剂盒中包含至少一种上述能够简便且高灵敏度地检测选自PIK3CA基因中的、由G1624A突变、G1633A突变和A3140G突变所组成的组的多态性中的至少一种多态性的多态性检测用探针，由此例如由能够更简便地进行PIK3CA基因的多态性的检测等的倾向。
另外，本发明的多态性检测用试剂盒还可以包含用于扩增上述包含检测对象的PIK3CA基因多态性的碱基序列的引物。由此，本发明的多态性检测用试剂盒能够高精度地进行PIK3CA基因的多态性的检测。
此外，关于多态性检测用试剂盒中可包含的探针以及引物，能够直接适用前述的部分。
在含有两种以上的荧光标记寡核苷酸作为多态性检测用探针的情况下，各个荧光标记寡核苷酸既可以以混合的状态被包含，也可以单独被包含。
两种以上的所述多态性检测用探针可以通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。
如此通过改变荧光物质的种类，即使在相同的反应体系中也能够同时进行针对各个荧光标记寡核苷酸的检测。
另外，本发明中的检测用试剂盒除了所述探针和所述引物之外，也可以还含有进行本发明检测方法中的核酸扩增所需要的试剂类。另外，所述探针、所述引物和其他试剂类可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成为混合物。
此外，“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。
通过包含用于扩增含有多态性位点的序列(与探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测多态性。
另外，本发明的多态性检测用试剂盒可以含有记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测PIK3CA基因中的多态性的使用说明书，或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。
实施例
下面说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。
[实施例1]
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表5记载的处方的检查用试剂，进行了PCR和Tm分析。确认了表6中记载的各荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针的性能。此外，探针中的3’末端的括号内示出荧光染料的种类。另外，大写字母表示示出多态性的碱基。以下相同。
作为模板，使用了表7中记载的模板(寡聚DNA)。
表5
在50μL的Tm分析用反应液中：
1×Gene Taq通用缓冲液(Nippon Gene公司制)
lOμM探针   0.2μM
 5μM寡聚DNA   0.2μM
表6
正向探针(Forward probe)
Figure BSA00000786572000461
反向探针(Reverse probe)
Figure BSA00000786572000462
Tm值为实测值
表7
针对正向探针的寡聚DNA(模板)
 名称   序列(5′→3′)   序列编号
 PIK3CAA3140G Wt R(野生型)   tccatttttgttgtccagccaccatgaTgtgcatcattcatttgtttcatgaaatactcc   35
 PIK3CAA3140G Mt R(突变型)   tccatttttgttgtccagccaccatgaCgtgcatcattcatttgtttcatgaaatactcc   36
针对反向探针的寡聚DNA(模板)
名称   序列(5′→3′)
PIK3CA A3140G Wt F(野生型)   ggagtatttcatgaaacaaatgaatgatgcacAtcatggtggctggacaacaaaaatgga   37
PIK3CA A3140G Mt F(突变型)   ggagtatttcatgaaacaaatgaatgatgcacGtcatggtggctggacaacaaaaatgga   38
Tm分析中，以95℃处理1秒、40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度上升至40℃～80℃，测定其间随时间的荧光强度的变化。作为荧光染料使用TAMRA，因此激发波长为520nm～555nm，检测波长为585nm～700nm。通过各个波长，分别测定源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
通过Tm分析，获得了示出探针的荧光值的变化量的图2。图中，纵轴表示每单位时间当的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。图中，用菱形表示的图案为作为模板使用了序列编号4所示的碱基序列中的第155位的碱基(Y)为T的序列编号35所示的人工寡聚序列时的结果和使用序列编号37中第155位的碱基(Y)为与T互补的A的序列编号37所示的人工寡聚序列时的结果。图中，用方形表示的图案为作为模板使用第155位的碱基(Y)为C的序列编号36所示的人工寡聚序列时的结果和使用第155位碱基(Y)为与C互补的G的序列编号38所示的人工寡聚序列的结果。
另外，图2中(A)示出使用了序列编号8所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(B)示出使用了序列编号9所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(C)示出了使用了序列编号10所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(D)示出了使用了序列编号14所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(E)示出使用了序列编号11所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(F)示出了使用了序列编号12所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(G)示出了使用了序列编号13所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(H)示出了使用了序列编号16所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(I)示出了使用了序列编号17所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(J)示出了使用了序列编号18所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(K)示出了使用了序列编号19所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(L)示出了使用了序列编号20所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(M)示出了使用了序列编号21所示的本发明涉及的探针时的结果，图2的(N)示出了序列编号22所示的本发明涉及的探针时的结果。
从图2的结果可知，通过将本发明涉及的荧光标记寡核苷酸用作探针，能够检测序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位的碱基的多态性。
[实施例2]
作为样品使用表8所示的核酸混合液(4μl/反应液)或精制人基因组(100拷贝/反应液)，使用自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)进行了PCR和Tm分析。PCR反应液的处方示于表9。
表8
样品：
4μL的核酸混合液中的各质粒的拷贝数：
  质粒名   Wt样品   Mt样品(1)   Mt样品(2)
  exon9Wt DNA   1000   14000   18940
  G1624A mt DNA   0   1000   60
  G1633A mt DNA   0   5000   1000
  exon20Wt DNA   1000   9700   9970
  A3140G mt DNA   0   300   30
表9
PCR反应液
50μL的PCR反应液中：
Figure BSA00000786572000491
PCR中，以95℃处理60秒之后，以95℃下1秒以及58℃下30秒为一个循环，反复进行50个循环。
Tm分析中，在PCR之后，在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着以温度的上升速度1℃/3秒将温度上升至40℃～75℃，测定其间随时间的荧光强度的变化。
多态性检测用探针和引物示于表10。
表10
  名称   序列(5′→3′)   mer   序列编号
  引物
  PIK3CA ex9F   gaacagctcaaagcaatttctacacgag   28   23
  PIK3CA ex9R   cagagaatYtccattttagcacttacYtgtgac   33   24
  PIK3CA A3140G F   gaggctttggagtatttcatgaaacaaatg   30   25
  PIK3CA A3140G R   gcatgctgtttaattgtgtggaagatccaatc   32   26
  探针
  5T-PIK3CA G1633A F1-19   (TAMRA)-ctctctGaaatcactAagc-P   19   6
  5FL-PIK3CA-G1624A-F1   (BODIPY FL)-ctctctAaaatcactGagc-P   19   7
  5PB-PIC3CA A3140G R1   (Pacific Blue)-ccatgaCgtgcatcatt-P   17   14
Y＝C/T
荧光染料Pacific Blue的激发波长为365nm～415nm，检测波长为445nm～480nm。荧光染料BODIPY FL的激发波长为420nm～485nm，检测波长为520～555nm。荧光染料TAMRA的激发波长为520nm～555nm，检测波长为585nm～700nm。通过各自的波长，来分别测定源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
通过Tm分析，获得示出探针的荧光值的变化量的图3。
在图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。
A3140G中，在野生型时(Wt样品)在45℃附近可见到一个峰，在含有突变型时(Mt样品(1)和Mt样品(2))在57℃处也可见到峰。G1624A和G1633A为野生型时(Wt样品)在48℃附近可见到一个峰，在含有突变型时(Mt样品(1)和Mt样品(2))在55℃附近也可见到峰。
通过以上的结果可知，通过使用本发明的探针，能够检测PIK3CA基因的多态性。
[比较例1]
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表11所记载的处方的检查用试剂来进行Tm分析，确认了表12所记载的各荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针的性能。此外，探针中的3’末端的括号内示出荧光染料的种类。
作为模板使用了表13所记载的模板(寡聚DNA)。
表11
50μL的Tm分析用反应液中：
  1×Gene Taq通用缓冲液(Nippon Gene公司制)
  10μM探针   0.2μM
  5μM寡聚DNA   0.2μM
表12
正向探针
Figure BSA00000786572000511
反向探针
Figure BSA00000786572000512
Tm值为实测值
表13
针对正向探针的寡聚DNA(模板)
Figure BSA00000786572000513
针对反向探针的寡聚DNA(模板)
Figure BSA00000786572000514
Tm分析中，在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度上升至40℃～80℃，测定其间随时间的荧光强度的变化。作为荧光染料使用了TAMRA，因此激发波长为520nm～555nm，检测波长为585nm～700nm。通过各自的波长，分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
通过Tm分析，获得示出探针的荧光值的变化量的图4。图中，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。
图中，用菱形表示的图案表示作为模板使用了序列编号4所示的碱基序列中第155位的碱基(Y)为T的序列编号35所示的人工寡聚序列时的结果，和使用了第155位的碱基(Y)为与T互补的A的序列编号37所示的人工寡聚序列时的结果。
图中，用方形表示的图案为作为模板使用第155位的碱基(Y)为C的序列编号36所示的人工寡聚序列时的结果和使用第155位的碱基(Y)为与C互补的G的序列编号38所示的人工寡聚序列时的结果。
另外，图4的(A)示出使用了序列编号27所示的探针时的结果，图4的(B)示出使用了序列编号28所示的探针时的结果，图4的(C)示出使用了序列编号29所示的探针时的结果，图4的(D)示出使用了序列编号30所示的探针时的结果，图4的(E)示出使用了序列编号31所示的探针时的结果，图4的(F)示出使用了序列编号32所示的探针时的结果，图4的(G)示出使用了序列编号33所示的探针时的结果，图4的(H)示出使用了序列编号34所示的探针时的结果。
从图4结果可知，在未使用本发明的多态性检测用探针的情况下，至少一者的峰不清楚，或者由于峰之间的温度差小而难以区分野生型和突变型等理由，不能够检测PIK3CA基因的多态性。此外，比较例1中使用的荧光标记寡核苷酸仅仅示出大量存在的不能够检测的探针的代表例而已。
由此可知，由于结果如上所述，因此根据本发明，能够高灵敏度且简便地检测PIK3CA基因的多态性。
产业应用性
基于以上描述和结果，本领域技术人员可以理解：根据本发明的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒，在医疗或诊断领域具有实用性，但也有可能用于非医疗或诊断目的，例如用于学术研究领域的基因多态性检测。
Figure ISA00000786572200021
Figure ISA00000786572200041
Figure ISA00000786572200051
Figure ISA00000786572200061
Figure ISA00000786572200071

Claims (14)

1.一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸，
(P1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P1’)寡核苷酸，其与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P2’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P3’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P6’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P7’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P8’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P9’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P10’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记；
(P11)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；以及
(P11’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针为选自下述P1-1～P11’-1的至少一种荧光标记寡核苷酸，
(P1-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的、碱基的碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种的多态性；
(P1’-1)寡核苷酸，其为与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号1中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性；
(P2-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P2’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P3-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P3’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P4-1)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P4’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P5-1)寡核苷酸，其相对于和序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P5’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P6-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P6’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P7-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P7’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P8-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P8’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P9-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P9’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位～第155位的碱基的、碱基长为12～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P10-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P10’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位～第155位的碱基的、碱基长为8～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；
(P11-1)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性；以及
(P11’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位～第155位的碱基的、碱基长为5～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性。
3.根据权利要求1或2所述的多态性检测用探针，其中，
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第226位的碱基对应的碱基；
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第139位的碱基对应的碱基；
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第165位的碱基对应的碱基；
所述P4或P4’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第167位的碱基对应的碱基；
所述P5或P5’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第164位的碱基对应的碱基；
所述P6或P6’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第163位的碱基对应的碱基；
所述P7或P7’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第161位的碱基对应的碱基；
所述P8或P8’荧光标记寡核苷酸在从5’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第160位的碱基对应的碱基：
所述P9或P9’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第144位的碱基对应的碱基；
所述P10或P10’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第148位的碱基对应的碱基；或者
所述P11或P11’荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中任一位置具有用荧光染料标记的与所述第151位的碱基对应的碱基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第226位的碱基对应的碱基；
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第139位的碱基对应的碱基；
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第165位的碱基对应的碱基；
所述P4或P4’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第167位的碱基对应的碱基；
所述P5或P5’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第164位的碱基对应的碱基；
所述P6或P6’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第163位的碱基对应的碱基；
所述P7或P7’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第161位的碱基对应的碱基；
所述P8或P8’荧光标记寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的与所述第160位的碱基对应的碱基；
所述P9或P9’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第144位的碱基对应的碱基；
所述P10或P10’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第148位的碱基对应的碱基；或者
所述P11或P11’荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与所述第151位的碱基对应的碱基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，且与未杂交时的荧光强度相比，在与靶标序列杂交时的荧光强度减少或增加。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述探针为用于熔解曲线分析的探针。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的多态性检测用探针，其中，
所述探针具有选自由序列编号6、序列编号7、序列编号8、序列编号9、序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15、序列编号16、序列编号17、序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21和序列编号22组成的组的至少一种碱基序列。
8.一种多态性检测方法，其通过使用权利要求1～7中任一项所述的探针来检测PIK3CA基因的多态性。
9.根据权利要求8所述的多态性检测方法，包括：
(I)使权利要求1至7中任一项所述的探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的PIK3CA基因中的多态性的存在。
10.根据权利要求9所述的多态性检测方法，还包括：(V)基于所述多态性的存在，来检测所述试样中的单链核酸中的、具有多态性的单链核酸的丰度比。
11.根据权利要求9或10所述的多态性检测方法，还包括：
在所述(I)的获得杂交体之前或者与(I)的获得杂交体的同时扩增核酸。
12.一种抗癌药的药效的判定方法，其包括通过权利要求8～11中任一项所述的多态性检测方法，来检测PIK3CA基因中的多态性；以及基于所检测的多态性的有无来判定抗癌药的药效。
13.一种多态性检测用试剂盒，其用于检测PIK3CA基因中的多态性，包含权利要求1～7中任一项所述的探针。
14.根据权利要求13所述的多态性检测用试剂盒，还包含用于扩增与所述探针杂交的区域的碱基序列的引物。
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