CN107254529A - 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107254529A
CN107254529A CN201710499203.3A CN201710499203A CN107254529A CN 107254529 A CN107254529 A CN 107254529A CN 201710499203 A CN201710499203 A CN 201710499203A CN 107254529 A CN107254529 A CN 107254529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kit
pcr
30sec
gene mutations
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201710499203.3A
Other languages
English (en)
Inventor
罗迪贤
蒲汪旸
肖莉
罗伟濠
刑春根
刘璇
王凤娇
胡政
贺荣章
李佳
段丽丽
张佳
李凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHENZHOU FIRST PEOPLE'S HOSPITAL
Original Assignee
CHENZHOU FIRST PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHENZHOU FIRST PEOPLE'S HOSPITAL filed Critical CHENZHOU FIRST PEOPLE'S HOSPITAL
Priority to CN201710499203.3A priority Critical patent/CN107254529A/zh
Publication of CN107254529A publication Critical patent/CN107254529A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本发明一种检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒及方法，所述试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如SEQ ID NO.1所示的正义引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶TspRI内切酶。采用本发明所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒和检测方法检测PIK3CA基因突变，可提高突变检测的灵敏度，减少样本使用量，有利用临床使用和推广。

Description

一种检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测结合耐高温限制性内切酶处理检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒及方法。
背景技术
PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含21个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋白。PIK3CA编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinases,PI3Ks)的p110催化亚单位，即PI3K p110a。
研究发现PIK3CA是一种癌基因，生理情况下，基因PIK3CA在正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巢等组织中均有表达，具有调控体细胞增殖、分化、存活等许多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易检测到，而其突变后基因及其蛋白均可过度表达，可被检测到。研究表明，PIK3CA基因的突变不仅可以引起PI3Ks的催化活性增强，并且可促使细胞癌变。
循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测是近年来兴起且发展迅速的肿瘤诊断技术，称为“液体活检”。ctDNA是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统；随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。
由于ctDNA含量低(<1.0％总cfDNA)，片段短(180-200bp)，半衰期短(～2小时)，故其检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战。目前具备极微量核酸基因突变检测能力的技术主要有ARMS技术(包括Super-ARMS)、第二代测序(NGS)和数字PCR(ddPCR，包括BEAMing技术)等。NGS技术可检测未知突变且检测基因数量不受限，在肿瘤耐药突变的监测与研究等领域有很大的应用潜力。然而，NGS建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。数字PCR技术，具有极高的敏感性，可绝对定量，但该方法检测通量较低。由于，ctDNA含量极少，且肿瘤DNA分子存在的数量远远不及正常细胞的DNA，肿瘤相关DNA被来自正常细胞DNA严重稀释，单分子丰度仅0.01％，化验结果特别容易被干扰。因此，能够特异性的丰富样品靶序列的富集技术是液体活检技术发展的关键。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于富集技术的循环肿瘤DNA(ctDNA)PIK3CA基因E545K(G>A)突变的检测试剂盒及方法。通过靶向富集血浆游离DNA中PIK3CA基因E545K(G>A)突变基因片段，提高该突变的检测灵敏度。
为达到上述发明目的，本发明的技术方案为：
所述检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如SEQ ID NO.1(AATCCAGAGGGGAAAAATATG)所示的正义引物和序列如SEQ ID NO.2(ATTTTAGCACTTACCTGTGACTC)所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶TspRI内切酶。
所述试剂盒中还含有高保真DNA聚合酶和PCR常规组件。
优选地，所述高保真DNA聚合酶为HotStarTaq Plus DNA聚合酶。
所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。
基于试剂盒检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的方法包括如下步骤：
(1)按照血浆游离DNA常规提取方法提取血浆游离DNA；
(2)采用本发明所述试剂盒进行PCR反应；
(3)将步骤(2)获得的PCR产物送去一代测序，并通过与GeneBank中记录的序列做BLAST一致性分析，判断突变情况。即，利用Sanger测序法分析PCR产物中是否有突变存在。
其中，步骤(2)所述进行PCR反应的具体过程分为三步：a)采用试剂盒中的特异性引物对、高保真DNA聚合酶、PCR常规组件构成的PCR反应体系，进行PCR反应；b)在PCR反应过程中加入试剂盒中的耐高温的限制性内切酶，并于65℃酶切反应1h；c)酶切反应结束后继续进行PCR反应。
优选地，步骤a中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。步骤c中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。
下面对本发明作进一步说明：
利用本发明所述试剂盒检测时，PCR反应共分三步进行：
①配置不含限制性内切酶TspRI的PCR反应体系(25μL)，以步骤(1)获得的血浆游离DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec(15cycles)；
②在步骤①反应结束后，往PCR反应体系中加入0.8μL限制性内切酶TspRI；65℃反应1小时；
③在步骤②反应结束后，接着进行PCR反应；95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。
步骤①中，每25μL PCR反应体系中的组分如下：正义引物0.4μL，反义引物0.4μL，模板DNA 2μL，10×PCR Buffer(含硫酸镁)2.5μL，dNTP混合液(每种10mM)0.5μL，HotStarTaq Plus DNA聚合酶0.3μL，余量为去离子水；
步骤②中所使用的限制性内切酶TspRI是耐高温的，在PCR反应用不会出现热失活，且其特异性识别序列为NNCASTGNN(N＝A or T or C or G；S＝C or G)，正好能识别PIK3CA基因545位密码子的区域ATCACTGAG，当PIK3CA基因为野生型(ATCACTGAG)时，TspRI酶可将DNA双链切断；当545位密码子出现G>A突变时，基因序列突变成ATCACTAAG，TspRI将不能识别该序列，不能将DNA双链切断。
本发明利用耐高温的限制性内切酶(TspRI)，TspRI内切酶能特异性识别PIK3CA基因545位密码子的野生型序列，并将其DNA双链切断；而当545位密码子出现G>A突变时，基因序列突变成ATCACTAAG，TspRI将不能识别该序列，不能将DNA双链切断。通过在普通的PCR反应中，加入耐高温的限制性内切酶，可在反应过程中将野生型的DNA片段破坏，使得野生型的PCR产物越来越少，而突变型的DNA片段能在反应中不断的富集，提高了低丰度突变的检测灵敏性。
总之，采用本发明所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒和检测方法检测PIK3CA基因突变，可提高突变检测的灵敏度，减少样本使用量，有利用临床使用和推广。
附图说明
图1为联合一代测序可识别PIK3CA基因E545K(G>A)点突变中野生型：突变型拷贝数比例达到10000:1。
具体实施方式
PIK3CA基因E545K(G>A)点突变基因型转化
(1)在样品模板中采用PCR方法扩增E545K突变位点待识别片段，引物如下：
PIK3CA-F：5’-AATCCAGAGGGGAAAAATATG-3’(SEQ ID NO.1)
PIK3CA-R：5’-ATTTTAGCACTTACCTGTGACTC-3’(SEQ ID NO.2)。
(2)限制性内切酶TspRI识别位点PCR反应条件：
1)PCR体系如表1：
表1
HotStarTaq Plus DNA 0.3μL
10x PCR buffer 2.5μL
dNTP(各10mM) 0.5μL
上游引物(10μM) 0.4μL
下游引物(10μM) 0.4μL
DNA模板 2μL
ddH2O Up to 25μL
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles；
2)在PCR反应体系中加入限制性内切酶TspRI 0.8μL,65℃1小时
3)95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5分钟。
(3)PCR产物送去一代测序，测序结果与GeneBank中记录的序列做BLAST一致性分析。分析结果见图1。
SEQUENCE LISTING
<110> 郴州市第一人民医院
<120> 一种检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒及方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aatccagagg ggaaaaatat g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
attttagcac ttacctgtga ctc 23

Claims (8)

1.一种检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如SEQ ID NO.1所示的正义引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶TspRI内切酶。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有高保真DNA聚合酶和PCR常规组件。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶为HotStarTaq PlusDNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。
5.基于权利要求1至4任一项所述试剂盒检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取血浆游离DNA；
(2)采用权利要求1至4任一项所述试剂盒进行PCR反应；
(3)将步骤(2)获得的PCR产物送去一代测序，并通过与GeneBank中记录的序列做BLAST一致性分析，判断突变情况。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述进行PCR反应的具体过程为：a)采用试剂盒中的特异性引物对、高保真DNA聚合酶、PCR常规组件构成的PCR反应体系，进行PCR反应；b)在PCR反应过程中加入试剂盒中的耐高温的限制性内切酶，并于65℃酶切反应1h；c)酶切反应结束后继续进行PCR反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。
CN201710499203.3A 2017-06-27 2017-06-27 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法 Withdrawn CN107254529A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710499203.3A CN107254529A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710499203.3A CN107254529A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107254529A true CN107254529A (zh) 2017-10-17

Family

ID=60023839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710499203.3A Withdrawn CN107254529A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107254529A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533958A (zh) * 2010-12-28 2012-07-04 苏州科贝生物技术有限公司 一种检测人pik3ca基因突变的方法和试剂盒
CN102660641A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
CN103014147A (zh) * 2011-09-27 2013-04-03 爱科来株式会社 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒
WO2013074977A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Selective amplification and detection of mutant gene alleles
CN105838823A (zh) * 2016-06-08 2016-08-10 广东凯普生物科技股份有限公司 Pik3ca基因突变检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533958A (zh) * 2010-12-28 2012-07-04 苏州科贝生物技术有限公司 一种检测人pik3ca基因突变的方法和试剂盒
CN103014147A (zh) * 2011-09-27 2013-04-03 爱科来株式会社 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒
WO2013074977A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Selective amplification and detection of mutant gene alleles
CN102660641A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
CN105838823A (zh) * 2016-06-08 2016-08-10 广东凯普生物科技股份有限公司 Pik3ca基因突变检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G.J.S.JENKINS: "The restriction site mutation (RSM) method: clinical applications", 《MUTAGENESIS》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108004301A (zh) 基因目标区域富集方法及建库试剂盒
CN106978497A (zh) Eml4‑alk融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN104946639B (zh) 构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒
CN106119356B (zh) 一种分子标签的制备方法
CN105671167A (zh) 一组用于猪源性实时荧光pcr检测的特异性引物和探针
CN109628596A (zh) Rna水平检测pd-1和pd-l1表达量的试剂盒及方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN106498029B (zh) 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法
CN106987629A (zh) 一种在单细胞水平上检测基因组上核小体排布的方法
CN107058596A (zh) 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用
CN115094130A (zh) 血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型
CN109439747A (zh) 一组用于肺癌诊断的circRNA标志物及其应用
CN107937524A (zh) 人类kras基因突变检测试剂盒及检测方法
CN108004320A (zh) Egfr基因突变检测体系及其试剂盒
CN107365864A (zh) 检测brca1基因、brca2基因、palb2基因突变位点的试剂盒和方法
CN107254529A (zh) 一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法
CN116814740A (zh) 检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法
CN114774553A (zh) 一种利用高通量测序技术检测多基因位点突变的方法
CN107058486B (zh) 检测鼻咽癌糖酵解相关基因分型的引物组及试剂盒
CN108841958A (zh) 一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其检测方法
CN108660193A (zh) 人类lmna-ntrk1基因融合突变检测引物、探针及检测试剂盒
CN107267612A (zh) 一种检测血浆游离dna中egfr基因两种缺失突变的试剂盒及方法
CN113322317A (zh) 一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20171017

WW01 Invention patent application withdrawn after publication