CN105838823A

CN105838823A - Pik3ca基因突变检测试剂盒

Info

Publication number: CN105838823A
Application number: CN201610402451.7A
Authority: CN
Inventors: 葛毅媛; 陈俊飞; 郑焱; 谢龙旭
Original assignee: GUANGDONG HYBRIBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG HYBRIBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明提供一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑4；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因Exon9和20两个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：5‑6；（3）2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PIK3CA基因主要突变位点型别。

Description

PIK3CA基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因PIK3CA基因突变检测试剂盒。

背景技术

PIK3CA基因是逆转录病毒v-p3k 癌基因在细胞内的同系物，编码的I类磷脂酰-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks)是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异元二聚体，由生长因子受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)、胰岛素受体等激活。PI3Ks活化后催化磷脂酰肌醇4磷酸(PI-4-P)和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI-4，5-P2)磷酸化成磷脂酰肌醇3，4二磷酸(PI-3，4-P2) 和磷脂酰肌醇3，4，5 三磷酸 (PI-3，4，5-P3，Ptd InsP3)。从而活化一系列蛋白，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等，涉及mTOR(target of repamycin)、BAD、Caspace9、Tuberin、 GSK3β和 FH(Fork head) 转录因子家族亚群等众多的靶分子。其中比较重要的是苏-丝氨酸激酶AKT。AKT与Ptd Ins P3 结合后被定位到质膜，然后被磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2活化，从而抑制细胞凋亡，促进细胞存活。当PIK3CA基因以基因扩增或点突变等形式激活时，其转录与翻译水平升高，通过PI3K-AKT途径，使 AKT过度激活，无限制的促进细胞生长和繁殖，并抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤发生。

对 PI3K 家族全部 16 个成员的激酶结构域外显子编码区进行序列分析显示，PIK3CA是唯一被发现由体细胞突变引起致癌的基因。多个研究均提出PIK3CA基因的突变80％-90％聚集在该基因的螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域。目前已报道的PIK3CA突变位点主要有以下几个：E542K/L、E545K/G、D549E、H1047L/R/Y、R38H、G106V 、C420R、E543Q、Q546K、M1043I,其中高频突变位点为E542K、E545K、H1047R。用体外细胞培养的方法对这两个热点突变区的研究发现其突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶 P13Ks 的活性。关于 PIK3CA 突变这两个热点区的研究发现，激酶区和螺旋区的突变可能通过不同的机制引起酶功能性的改变。不同区域的突变，分别通过与 P13Ks 的调节亚单位 p85 和 RAS-GTP 相互作用的不同机制导致 P13Ks 的活化。螺旋区突变诱导获得性的功能改变时不依赖与p85的结合，但却需要与 RAS-GTP 的相互作用；相反的，激酶区的突变在缺少RAS-GTP 时是有效的但却高度依赖p85。可见，激酶区和螺旋区的突变是通过两个不同的且独立的机制发挥作用的，在同一个分子中这两种机制的突变是相互协同的。

研究表明，约30％的人类实体肿瘤中存在癌基因PIK3CA的突变，且在多种肿瘤中出现扩增或者过表达。据报道PIK3CA 基因在结肠癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌和肝癌等多种肿瘤中发生高频体细胞突变。其中该基因在乳腺癌组织中的突变频率在8％-40％。最近研究证实PI3K通路的激活，无论是通过抑癌基因PTEN的失活还是癌基因 PIK3CA的激活，都可引起乳腺癌患者对靶向药物 Herceptin 的耐药。赫赛汀 (Herceptin) 是一种抗HER2单克隆抗体，可选择性作用于人类表皮生长因子受体2（HER2），从而干扰癌细胞的生物学进程，抑制癌细胞的增生，赫赛汀用于治疗转移性乳腺癌，以及手术后的HER2阳性乳腺癌患者。研究发现赫赛汀对PIK3CA基因突变人群的疗效欠佳。PIK3CA基因突变检测可为乳腺癌患者的合理使用赫赛汀用药提供参考依据。

PIK3CA基因在结直肠癌中也是一个高频突变基因，其突变率高达32％。YardenaSamuels等采用基因打靶(gene targeting)技术对含有H1047R突变的 HCT116和含E545K突变的DLD1两种人结肠癌细胞株进行了研究，发现含突变的细胞具有对抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)所诱导凋亡的能力且含上述突变的细胞株穿越多孔膜和侵入基质胶的能力是野生型细胞株的6～8倍。因此，推测PIK3CA基因突变可能参与结直肠癌的抗凋亡、侵袭与转移过程中。PIK3CA 基因突变结直肠癌患者接受抗EGFR 单抗疗效不佳，KRAS 与PIK3CA 基因联合检测可更好的预测抗EGFR 单抗疗效。以上发现提示，对于肿瘤患者，在治疗前进行KRAS/BRAF、PI3KCA 突变和PTEN 表达状况的检测，可能对个体化选择EGFR 靶向治疗以避免不必要的毒性和经济负担有积极的意义

PIK3CA基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测PIK3CA基因的技术具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PIK3CA基因主要突变位点型别，检测位点包括PIK3CA基因9和20两个外显子的主要突变位点，包括但不限于9号外显子上c.1633G>A, p.E545K突变位点；20号外显子上c.3140A>G, p.H1047R突变位点。

本发明的PIK3CA基因突变检测试剂盒具体包括：

（1）用于扩增样本中PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，具体序列如下:

（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因Exon9和20两个外显子进行测序分析，具体序列如下：

外显子	名称	序列号	Reverse 5’-3’
				9	SEQ-P9	SEQ ID No.5	ATCCAGAGGGGAAAAATATG
20	SEQ-P20	SEQ ID No.6	TCATTTGCTCCAAACTGACCAA

（3）2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.1633G>A, p.E545K突变位点；20号外显子上c.3140A>G, p.H1047R突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：

组份	体积（μl）
		10 PCR buffer	2.5
5 Q solution	5
		25mM MgCl₂	1.5
25mM dNTPs	0.4
		H₂O	10.35

其中10^× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH₄)₂SO₄，和15 mM MgCl₂；5^× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。

本试剂盒主是根据PIK3CA基因的Exon9和20两个外显子的保守序列分别设计PIK3CA基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon9和20两个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：

（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从PIK3CA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA，引物序列分别是SEQ ID NOs：1-4。。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ IDNOs：5-6。

（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。

（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因PIK3CA的Exon9和20两个外显子片段回收用于测序。

附图说明

以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1为 PIK3CA基因的Exon9和20两个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

附图1中各标号的具体表示如下：

1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；P9：PIK3CA基因第9号外显子；P20：PIK3CA基因第20号外显子；M：DNA maker。

图2-1为PIK3CA基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。

图2-2为PIK3CA基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。

图2-3为PIK3CA基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。

图2-4为PIK3CA基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。

具体实施方式

1、引物设计

根据PIK3CA基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从PIK3CA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID Nos：1-4。

测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID Nos：5-6。

2、PCR扩增

2.1、质控品准备

阳性质控品为PIK3CA野生型和突变型质粒混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。

2.2、试剂配制

提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。

确定反应数N，N=待检样本数（n）×4+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：

组分	PCR mix	Taq酶
			体积（μl）	19.75×N	0.25×N

取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。

2.3、加样

将PIK3CA阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加2.5μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。

2.4、PCR扩增

配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：

3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收

由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。本试剂盒不包含核酸回收成分，请采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒。回收得到的产物即可用于测序。

序列表

<110> 广东凯普生物科技股份有限公司

<120> PIK3CA基因突变检测试剂盒

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIK3CAEx9-F

<400> 1

atccagaggg gaaaaatatg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIK3CAEx9-R

<400> 2

atgctgagat cagccaaat 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIK3CAEx20-F

<400> 3

tcatttgctc caaactgacc aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIK3CAEx20-R

<400> 4

tggaatccag agtgagcttt ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ-P9

<400> 5

atccagaggg gaaaaatatg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ-P20

<400> 6

tcatttgctc caaactgacc aa 22

Claims

1.用于检测PIK3CA基因突变的Exon9和20两个外显子的引物，包括特异性引物和测序引物，特异性引物序列分别是SEQ ID Nos：1-4，测序引物序列分别是SEQ ID Nos：5-6。

2. PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括：

（1）用于扩增样本中PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-4；

（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因Exon9和20两个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：5-6；

（3）2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管，其中突变型质粒包括9号外显子上c.1633G>A, p.E545K突变位点；20号外显子上c.3140A>G, p.H1047R突变位点。

3.权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下表组成：

其中10 PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH₄)₂SO₄，和15 mM MgCl₂；5 Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。