CN105861726A - Braf基因突变检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种Braf基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，长度在21‑25个碱基，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑2；（2）用于测序PCR的测序引物，用于对Braf基因Exon15号外显子c. 1799T>A,p. V600E突变位点进行测序分析，引物序列是SEQ ID No：3；（3）1个装有Braf野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本利用Sanger测序法检测出样本中Braf基因主要突变位点的状态。

Description

Braf基因突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因Braf基因突变检测试剂盒。
背景技术
BRAF (B-type Raf kinase)基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，大小为190Kb，含有七个转录区，包括18个外显子， 编码一个67KD-99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的增殖、分化和凋亡。2002年Davie等在66％的恶性黑色素瘤和一系列的其它肿瘤中检测到BRAF基因体细胞突变， 该突变主要见于 BRAF基因11和15 外显子的激酶结构域内，80％以上的突变都是15外显子1799位核苷酸上的单碱基颠换，致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。之后，不同国家和地域的学者在甲状腺乳头状癌(Papillarythyroidcancer,PTC) 中检测到了BRAF V600E突变。由于该突变中在599位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近插入了一个负性调节残基，可模拟活化区域的磷酸化过程，使BRAF基因与维持其失活态的ATP 结合环活化区的联系中断，从而级联式激活，并通过RAS-RAF-MEK-MAPK 激酶信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化.最终导致肿瘤的形成。
BRAF突变发生在近8%人类肿瘤中，BRAF基因可在甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发生突变。文献报道的突变位点主要有位于15号外显子的V600ES616F(C1847T)、K601E(A1801G)、D594G(A1781G)及串联突变V600K(G1798A、T1799A)及位于11号外显子的G466R(G1396A)，将近90%是V600E突变。检测BRAF基因突变，对判断肿瘤的发生和发展后以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。(1)正常人血检中出现BRAF基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明，无BRAF基因突变的结直肠癌等肿瘤患者，经帕尼单抗和爱比妥靶向药物治疗疗效明显，因此，通过检测BRAF基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。因此，这种检测为临床医生用药提供指导和依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。
据统计，约 15%的结肠癌患者中存在体细胞BRAF基因突变，绝大部分突变发生于外显子15上的1799位核苷酸上，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代（V600E）。目前针对BRAF的靶向药物主要有爱必妥或帕尼单抗，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》（V3.2011）建议，在使用爱必妥（cetuximab）或帕尼单抗（Panitumumab）等靶向药物时，须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态。一项对结直肠癌(mCRC)患者的研究证实，KRAS基因野生型的状态下，BRAF基因野生型的患者使用Cetuximab+FOLFIRI药物疗效最好，总生存期显著延长。
在黑色素瘤患者的治疗方面，BRAF基因在原发性黑素瘤中突变率为80％、在转移性黑色素瘤中突变率为68％、在良性痣中的突变率高达82％。针对BRAF基因突变所研发的新型靶向药物Vemurafenib对于BRAF基因突变阳性患者疗效显著。Vemurafenib是由制药巨头—瑞士罗氏公司和Plexxikon公司联合研发的一种治疗伴BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤的新药，其本质就是一种BRAF激酶抑制剂，它能特异性的降低黑色素瘤细胞活化产物的表达，而不影响正常的组织，从而能够快、准、狠的杀死肿瘤细胞。经第1期和第2期临床试验已证实其对伴BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤患者的反应率超过50％。它是目前唯一一个被证实与标准化疗方案相比可同时改善BRAF V600E基因突变型黑色素瘤患者的有效率、无进展生存期和总生存率的药物。因此，通过检测BRAF基因的突变情况来为临床医生用药提供科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。
甲状腺癌根据其组织学类型可分为乳头状癌(PTC)，滤泡状癌(FTC)，未分化癌(ATC)和髓样癌(MTC)，其中以PTC所占比例最大。BRAF基因在甲状腺癌中的突变率为39%。BRAF基因突变作为乳头状甲状腺癌（PTC）发生的驱动性突变，已经成为乳头状甲状腺癌(PTC)细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。研究表明PTC中BRAF基因突变率高达44%，具有很好的诊断意义。BRAF基因突变阳性的病人较突变阴性病人预后不良。目前针对BRAF的靶标药物主要有XL281，它是一种口服烦人RAF激酶小分子抑制剂，I期的临床研究结果表明，该药能很好地稳定患者的病情；Vemurafenib：一种口服BRAF激酶小分子选择性抑制剂，其对BRAF突变型激酶作用明显；索拉非尼：一种口服多激酶抑制剂，一方面通过与BRAF激酶区结合，阻断RAF激酶信号传导途径，另一方面通过抑制VBraf和PDGFR，阻止肿瘤新生血管的生成，该药在晚期的患者中，效果良好。
Braf基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测Braf基因的技术具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种Braf基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中Braf基因主要突变位点c.1799T>A, p.V600E。
本发明的Braf基因突变检测试剂盒具体包括：
（1）用于扩增样本中Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，具体序列如下:
名称 序列号 Reverse 5’-3’
BrafEx15-F SEQ ID No.1 AATGCTTGCTCTGATAGGAAAA
BrafEx15-R SEQ ID No.2 TTGTGAATACTGGGAACTATGAAAA
（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对Braf基因c.1799T>A, p.V600E突变位点进行测序分析，具体序列如下：
名称 序列号 Reverse 5’-3’
SEQ-B15 SEQ ID No.3 TTGTGAATACTGGGAACTATGAAAA
（3）1个装有Braf野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒为Braf基因上的c.1799T>A, p.V600E突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：
组份 体积（μl）
10PCR buffer 2.5
5 Q solution 5
25mM MgCl2 3.5
25mM dNTPs 0.4
H2O 8.35
其中10× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
本试剂盒主要是根据Braf基因的Exon15号外显子的保守序列分别设计Braf基因c.1799T>A, p.V600E突变位点的特异性引物，并纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：
（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从Braf基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID NOs：1-3。长度在21-25个碱基左右
（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。
（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因Braf的Exon15号外显子片段回收用于测序。
附图说明
以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为 Braf基因的Exon15号外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
附图1中各标号的具体表示如下：
1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；4：4号样本；5：5号样本；6：6号样本；M：DNA maker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。
图2-1为Braf基因的Exon15外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-2为Braf基因的Exon15外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
具体实施方式
1、引物设计
根据Braf基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从Braf基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID Nos：1-2。
测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列是SEQ ID No：3。
2、PCR扩增
2.1、质控品准备
阳性质控品为Braf野生型和突变型质粒混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
2.2、试剂配制
提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
确定反应数N，N=待检样本数（n）×4+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：
组分 PCR mix 3 Taq酶
体积（μl） 19.75×N 0.25×N
取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。
2.3、加样
将Braf阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加2.5μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。
2.4、PCR扩增
配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。本试剂盒不包含核酸回收成分，请采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒。回收得到的产物即可用于测序。
序列表
<110> 广东凯普生物科技股份有限公司
<120> Braf基因突变检测试剂盒
<160> 3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BrafEx15-F
<400> 1
aatgcttgct ctgataggaa aa 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BrafEx15-R
<400> 2
ttgtgaatac tgggaactat gaaaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-B15
<400> 3
ttgtgaatac tgggaactat gaaaa 25

Claims (4)

1.用于检测Braf基因突变的Exon15号外显子的引物，包括特异性引物和测序引物，特异性引物序列分别是SEQ ID Nos：1-2，测序引物序列是SEQ ID No：3。
2.Braf基因突变检测试剂盒，包括：
（1）用于扩增样本中Braf基因Exon15号外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ IDNos：1-2。
3.（2）用于测序PCR的测序引物，用于对Braf基因Exon15号外显子c. 1799T>A, p.V600E突变位点进行测序分析，引物序列是SEQ ID No：3；
（3）1个装有Braf野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。
4.权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下表组成：
其中10 PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5 Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
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