CN105861650A - Egfr基因突变检测试剂盒 - Google Patents

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CN105861650A CN201610209729.9A CN201610209729A CN105861650A CN 105861650 A CN105861650 A CN 105861650A CN 201610209729 A CN201610209729 A CN 201610209729A CN 105861650 A CN105861650 A CN 105861650A
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陈俊飞
陈华梅
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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Abstract

本发明提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物；（2）用于测序PCR的测序引物；（3）4个装有EGFR野生型质粒和突变型质粒按1:1比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本发明的各种引物长度在20‑25个碱基之间，无特殊修饰；反应液预混液采用独特的配方及比例；不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

Description

EGFR基因突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因EGFR基因突变检测试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）基因定位于7p13-q22区，全长200Kbp，由28个外显子组成，编码的蛋白质相对分子质量为170000Da，具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)活性，是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，是传递细胞外信号到细胞核内的重要途径蛋白。EGFR与其配体结合后形成同源二聚体，也可与其他TK受体形成异源二聚体，导致胞内TK区的激活，启动一系列级联反应，将信号传到细胞核内，最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞增殖、凋亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受， 在肿瘤发生发展过程中扮演着重要角色。多个文献报道显示，EGFR在胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞癌以及胶质瘤等恶性肿瘤中存在突变或过表达，并在其发生、发展中起重要作用。
目前发现的肿瘤细胞EGFR基因突变的主要形式：(1)点突变：主要集中在EGFR-TK区，导致翻译后的氨基酸变异或翻译提前终止；(2)基因扩增：指基因整体拷贝数量的增加；(3)基因片段插入或缺失，主要见于3种情况，一是20号外显子的小片段插入；二是19号外显子内部出现短序列的缺失-框内缺失；三是EGFR突变变异体Ⅲ的出现，这是由于基因重排或选择性mRNA剪切导致细胞膜外配体结合区2-7外显子缺失。基于上述突变形式产生变异的不完整蛋白可以自身激活TK，并引发下游信号通路的激活。
EGFR是结直肠癌和肺癌靶向治疗的主要靶点之一。目前针对EGFR的靶向治疗策略主要有两大类：一类是针对EGFR受体胞外区的单克隆抗体，如：西妥昔单抗和帕尼单抗；另一类是抑制EGFR胞内区TK的小分子化合物.虽然两类药物的作用部位不同，但通过竞争性阻滞配体与EGFR的结合及阻断下游信号通路转导，最终产生相似的效果，即阻滞肿瘤细胞在G1期、促进凋亡、抑制新生血管形成、抑制侵袭和转移，从而起到治疗肿瘤的作用。目前临床上常见的EGFR TK抑制剂有吉非替尼(gefitinib, ZD1839)、埃罗替尼(erlotinib, OSI-774)、EKB-569。
由于EGFR靶向药物费用昂贵，很多患者没有机会获得这些最新的治疗。另外，即使有条件获得这种治疗，多数患者也不一定能获得理想的疗效。所以，准确预测EGFR靶向治疗的意义非常重大。
EGFR基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测EGFR基因的技术具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中EGFR基因主要突变位点型别，检测位点包括EGFR基因18、19、20和21四个外显子的主要突变位点，包括但不限于18号外显子上c.2156G>C,p.G719A突变位点；19号外显子上c.2235-2249del15,p.E746A750delELREA缺失突变位点；20号外显子上c.2396C>T,pT790M突变位点；21号外显子上c.2573T>G,pL858R突变位点。
本发明的EGFR基因突变检测试剂盒具体包括：
（1）用于扩增样本中EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，具体序列如下:
（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子进行测序分析，具体序列如下：
外显子 名称 序列号 Reverse 5’-3’
18 SEQ-18 SEQ ID No.9 TCTTCCAAATGAGCTGGCAAGT
19 SEQ-19 SEQ ID No.10 TTGGTAACATCCACCCAGATCACT
20 SEQ-20 SEQ ID No.11 TGAAACTCAAGATCGCATTCATGC
21 SEQ-21 SEQ ID No.12 TCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG
（3）4个装有EGFR野生型质粒和突变型质粒按1:1比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括18号外显子上c.2156G>C,p.G719A突变位点；19号外显子上c.2235-2249del15,p.E746A750delELREA缺失突变位点；20号外显子上c.2396C>T,pT790M突变位点；21号外显子上c.2573T>G,pL858R突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：
组份 体积（μl）
10 PCR buffer 2.5
5 Q solution 5
25mM MgCl2 0.75
25mM dNTPs 0.4
H2O 11.1
其中10× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
本试剂盒主是根据EGFR基因的Exon18、19、20和21四个外显子的保守序列分别设计EGFR基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon18、19、20和21号外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：
（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从EGFR基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID NOs：9-12。长度在21-25个碱基左右。
（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。
（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因EGFR的Exon18、19、20和21四个外显子片段回收用于测序。
附图说明
以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为 EGFR基因的Exon18、19、20和21四个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
附图1中各标记的具体表示如下：
1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；4：4号样本；5：5号样本；6：6号样本；18：EGFR基因第18号外显子；19：EGFR基因第19号外显子；20：EGFR基因第20号外显子；21：EGFR基因第21号外显子；M：DNA maker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。
图2-1为EGFR基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-2为EGFR基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-3为EGFR基因的Exon19外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-4为EGFR基因的Exon19外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-5为EGFR基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-6为EGFR基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-7为EGFR基因的Exon21外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-8为EGFR基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
具体实施方式
1、引物设计
根据EGFR基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从EGFR基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID Nos：1-8。
测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID Nos：9-12。长度在21-23个碱基。
2、PCR扩增
2.1、质控品准备
阳性质控品为EGFR野生型和突变型质粒混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
2.2、试剂配制
提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
确定反应数N，N=待检样本数（n）×4+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：
组分 PCR mix 3 Taq酶
体积（μl） 19.75×N 0.25×N
取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。
2.3、加样
将EGFR阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加2.5μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。
2.4、PCR扩增
配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。本试剂盒不包含核酸回收成分，请采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒。回收得到的产物即可用于测序。
序列表
<110> 广东凯普生物科技股份有限公司
<120> EGFR基因突变检测试剂盒
<160> 12
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx18-F
<400> 1
acttccaaat gagctggcaa gt 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx18-R
<400> 2
agggacctta ccttatacac cgt 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx19-F
<400> 3
atggtaacat ccacccagat cact 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx19-R
<400> 4
agcaaagcag aaactcacat cga 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx20-2F
<400> 5
agaaactcaa gatcgcattc atgc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx20-2R
<400> 6
agcaaactct tgctatccca ggag 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx21-2F
<400> 7
acagccataa gtcctcgacg tgg 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFREx21-2R
<400> 8
acatcctccc ctgcatgtgt taaac 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-18
<400> 9
tcttccaaat gagctggcaa gt 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-19
<400> 10
ttggtaacat ccacccagat cact 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-20
<400> 11
tgaaactcaa gatcgcattc atgc 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-21
<400> 12
tcagccataa gtcctcgacg tgg 23

Claims (3)

1.用于EGFR基因突变检测的Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-8。
2.EGFR基因突变检测试剂盒，包括：
（1）用于扩增样本中EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-8；
（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：9-12；
（3）4个装有EGFR野生型质粒和突变型质粒按1:1比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管，其中突变型质粒包括18号外显子上c.2156G>C,p.G719A突变位点；19号外显子上c.2235-2249del15,p.E746A750delELREA缺失突变位点；20号外显子上c.2396C>T,pT790M突变位点；21号外显子上c.2573T>G,pL858R突变位点。
3.权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下组份组成：
其中10 PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5 Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
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