CN107475392A - 一种检测单细胞egfr基因突变的引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术和医学领域，具体公开了一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合及其应用。本发明采用高特异性扩增引物和多重扩增体系，一次性获取EGFR基因18、19、20和21号外显子上的所有常见突变，并可及时发现新型突变。使用本发明所述引物组合进行单细胞EGFR基因突变的检测，特异性好，灵敏度高，无需提取DNA，可对低至单个细胞中的两个拷贝进行扩增，有助于更系统地研究肿瘤异质性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，涉及一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)上的活化突变使得大部分含有该类突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)敏感。埃罗替尼和吉非替尼等第一代抑制剂通过与酪氨酸激酶结构域可逆性结合来靶向受体，阿法替尼等第二代抑制剂则是通过与靶标共价结合来发挥抑制作用。然而患者在治疗9-16个月后，总会出现耐受性，其中有60％的患者是由于第790号密码子发生二次突变(T790M)。第三代共价突变选择性EGFR TKisCO-1686和AZD9291同时靶向活化和T790M突变，可用于T790M阳性NSCLS患者。
虽然很多患者可以从第三代TKIs中收益，但仍有部分患者无响应，完全响应的患者也很少，这表明还存在其他耐受机制，降低了这些抑制剂的治疗效果。迄今为止，对新型抑制剂耐受的机制尚未可知。最新研究表明，对CO-1686和AZD9291耐受的主要机制可能不同。然而，这两种抑制剂似乎都可以降低T790M突变的细胞数，但AZD9291耐受患者中有一部分出现C797S突变，而CO-1686耐受性与EGFR扩增或组织学转化有关。
克服肿瘤异质性是个性化治疗的主要挑战。虽然肿瘤内异质性已经在包含NSCLC在内的多种肿瘤类型中得以详述，但具体哪种异质性程度会影响治疗决策还尚未可知。尽管有证据表明EGFR靶向治疗的NSCLC患者中对出现多重耐受亚型，但这部分患者的多重耐受机制还没有得到系统性的评估。这很大程度上归根于之前的研究都主要依赖于组织活检，而这极大地限制了地理异质性的检测。且现有技术均无法实现单细胞水平的EGFR基因突变的检测。因此，亟需研发一种可以高效高灵敏准确全面检测出EGFR基因突变的产品和方法，以精确获得EGFR基因突变的异质性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合，包括针对EGFR基因第18、19、20和21号外显子的特异性引物对，如SEQ ID NO.1～8所示。
所述引物组合为可以完整扩增EGFR基因第18、19、20和21号外显子的高特异性引物。
应用所述引物组合检测单细胞EGFR基因突变，可同时获得EGFR基因第18、19、20和21号外显子内的所有突变，检测灵敏度可低至单细胞中的两个拷贝，有助于更系统地研究肿瘤异质性。检测过程中无需提取和纯化DNA，具有极高的特异性；通过对样本进行标记，可一次性同时获取多个细胞的EGFR突变信息。
进一步地，本发明提供了所述引物组合在制备检测单细胞EGFR基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
更为具体地，本发明提供了一种含有前述引物组合的检测单细胞EGFR基因突变的试剂和试剂盒。
作为优选，所述试剂和试剂盒中，所述引物组合中第18、19、20和21号外显子的特异性引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合。
第二方面，基于前述引物组合的特点，本发明提供一种单细胞多重PCR扩增方法。
进一步地，所述PCR扩增中，PCR反应体系为10μL：
所述引物混合液的制备方法为：将10μM的第18、19、20和21号外显子的特异性引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合成原液后，稀释10倍，即得。
进一步地，所述PCR扩增中，PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，57℃45s，72℃45s，15个循环；72℃8min。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合及其应用，采用高特异性扩增引物和多重扩增体系，一次性获取EGFR基因18、19、20和21号外显子上的所有常见突变，并可及时发现新型突变。使用本发明所述引物组合进行单细胞EGFR基因突变的检测，特异性好，灵敏度高，无需提取DNA，可对低至单个细胞中的两个拷贝进行扩增，有助于更系统地研究肿瘤异质性。
附图说明
图1为本发明实施例中PCR扩增目的片段后，2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物图。
图2为本发明实施例中四重PCR扩增目的片段及进行标记后，2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物图。
图3为本发明实施例中四重PCR扩增目的片段的测序比对结果。
图4为本发明实施例中四重PCR扩增目的片段进行标记后，2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物图。
图5为本发明实施例中单细胞多重PCR片段标记扩增后，2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、引物设计：
根据美国基因数据库(Genbank)中EGFR基因组序列NG_007726.3设计针对18，19，20和21号外显子的引物，并在上下游引物序列前加入一段通用序列，具体引物序列见表1。
表1
2、PCR：人工序列
提取A549肺癌细胞基因组DNA，并取200ng为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，25个循环后，72℃5min。
随后采用2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。结果如图1所示，分别在目标长度范围内观察到目的条带，且无杂带，证明本发明设计的引物特异性良好。
3、四重PCR扩增目的片段：
取200ng A549细胞DNA为模板，进行PCR扩增。10μM的18、19、20、21外显子引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合成原液，随后稀释10倍，然后取4μL用于PCR反应，随后加入10μL 2×HotStart Taq PCR MasterMix(天根，KT202-11)，5％DMSO，用ddH2O定容至20μL。
PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，25个循环后，72℃5min。
2.5％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果。结果如图2标记为18，19，20，21的泳道所示，在150～300bp范围内，有4条条带，与目标片段长度相符。随后对这四条片段回收，进行测序鉴定。测序比对结果如图3所示，A549-18，A549-19，A549-20和A549-21为回收片段，Exon18,19,20和21为数据库中调出的EGFR外显子片段，比对结果完全吻合，进一步证明了这四条片段与目标扩增片段完全吻合。
4、对步骤2的扩增片段进行标记：
为了同时获取多个样本的EGFR突变信息，对每个样本进行标记。设计引物如下：
上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC；
下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(barcode)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT。
取步骤2的扩增产物各0.5μL，10μM的上游引物和下游引物各1μL，加入2×HotStart Taq PCR MasterMix(天根，KT202-11)12.5μL，ddH2O定容至20μL。
PCR扩增条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，25个循环后，72℃5min。
2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段。如图2所示，标记后的目的片段长度分别为257bp，284bp，369bp和325bp，与步骤2中扩增片段相比，标记后的片段长度均延长，与目标长度一致。
5、对步骤3的四重PCR产物进行标记：
取步骤3的扩增产物0.5μL，10μM的标记用上游引物和下游引物各3μL，5％的DMSO或甘油，2×HotStart Taq PCR MasterMix(天根，KT202-11)12.5μL，ddH2O定容至20μL。PCR扩增条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，15个循环后，72℃8min。
2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段。结果如图4所示，标记扩增后仍然只有4条条带，相比未标记前长度更长，与目标长度吻合。
6、单细胞多重扩增：
采用微流控芯片分离单细胞，10μM的18，19，20，21外显子引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合成原液，随后稀释10倍，然后取0.5μL用于PCR反应。
PCR反应体系为0.05％NP40，5％DMSO或甘油，混合引物0.5μL，2×HotStart TaqPCR MasterMix(天根，KT202-11)5μL，ddH2O定容至10μL。
PCR扩增条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，15个循环后，72℃8min。
7、单细胞多重PCR片段标记扩增
取上述单细胞扩增产物1μL，10μM的上游引物和下游引物各1μL，5％的DMSO或甘油，2×HotStart Taq PCR MasterMix(天根，KT202-11)12.5μL，ddH2O定容至20μL。PCR扩增条件为：95℃3min，95℃30s，57℃45s，72℃45s，15个循环后，72℃8min。
2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段。结果如图5所示，单细胞标记扩增后只有4条条带，且长度与采用DNA模板扩增的产物长度一致。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合及其应用
<130> KHP171115257.0
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 32
<212> DNA
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<210> 3
<211> 34
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 38
<212> DNA
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<400> 5
cgttatcgag gtccgaagcc acactgacgt gcctctcc 38
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgctcttcc gatctctccc ctccccgtat ctcccttcc 39
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgttatcga ggtcccctca cagcagggtc tt 32
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgctcttcc gatcgtctga cctaaagcca cctc 34
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ctacacgagc gttatcgagg tc 52
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 50
Claims (9)
1.一种检测单细胞EGFR基因突变的引物组合，其特征在于，包括针对EGFR基因第18、19、20和21号外显子的特异性引物对，如SEQ ID NO.1～8所示。
2.权利要求1所述的引物组合在制备检测单细胞EGFR基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种检测单细胞EGFR基因突变的试剂，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述引物组合中第18、19、20和21号外显子的特异性引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合。
5.一种检测单细胞EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合中第18、19、20和21号外显子的特异性引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合。
7.一种单细胞多重PCR扩增方法，其特征在于，PCR反应体系为10μL：
8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述引物混合液的制备方法为：将10μM的第18、19、20和21号外显子的特异性引物按照1.5:1:1.5:1的比例混合成原液后，稀释10倍，即得。
9.根据权利要求7或8所述的扩增方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，57℃45s，72℃45s，15个循环；72℃8min。
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