CN109680087B - 一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重pcr检测方法及其引物组 - Google Patents

一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重pcr检测方法及其引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法及其引物组。由甘蔗白叶病植原体引起的甘蔗白叶病和由白条黄单胞菌引起的甘蔗白条病在症状表现上非常相似，目前确诊病害时必须分别检测两种病原。本发明针对甘蔗白叶病植原体tuf基因和白条黄单胞菌rpoD基因分别设计了一对特异性引物，经过条件优化，建立了可以同时检测出甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR反应体系。应用该方法可以在一次PCR反应中同时检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌，具有快速、特异性、稳定的特点，可用于甘蔗白叶病和甘蔗白条病的快速鉴别诊断，对有效防控这两种病害具有重要意义。

Description

一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法 及其引物组
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及用双重PCR技术检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌以及所用的特异性引物组。
背景技术
由甘蔗白叶病植原体(Sugarcane white leaf phytoplasma)引起的甘蔗白叶病和由白条黄单胞菌(Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson)引起的甘蔗白条病均是甘蔗的毁灭性病害，可造成甘蔗和制糖产业巨大的经济损失。甘蔗白叶病的主要症状表现为叶片白化、分蘖增多和矮化。甘蔗白条病主要症状为叶片上产生白色条纹，有的梢头叶片整片白化，侧芽萌生，萌发的侧芽叶片也为白色。这两个病害在症状表现上有非常相似的地方，即叶片白化，所以，仅通过症状表现很难准确区分这两种病害，必须通过分子检测的方法确诊。
目前，检测甘蔗白叶病植原体的方法为使用依据植原体16S rRNA基因设计的通用引物(P1/P7和R16F2n/R16R2)进行巢式PCR，此方法使用的是植原体通用引物，检测的准确率不高，检测过程较为繁琐，而白条黄单胞菌的检测虽使用的是特异性引物XAF1/XAR1，但此方法使用的PCR反应程序复杂，反应时间较长。由于这两种病害症状极为相似，所以要想对疑似两种病害的样品进行检测确诊，必须分别检测这两种病原，进行两个PCR反应。目前对于使用特异性引物检测甘蔗白叶病植原体的方法还未见报道，更未形成同时检测这两种病原的双重PCR方法。
甘蔗白叶病和甘蔗白条病均为种苗传播的检疫性病害，随着目前国内外引种和调种的频繁，急需一种更为快速和准确的检测这两种病原的方法。
发明内容
为解决甘蔗白叶病植原体引起的甘蔗白叶病和白条黄单胞菌引起的甘蔗白条病在症状表现上非常相似，目前确诊该两种病害时必须分别进行两个PCR反应分别检测该两种病原，特异性不高，检测过程费工费时的技术问题，本发明提供了一种快速、准确、特异性的甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法及其特异性引物组、试剂盒。
本发明提供的一种检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR特异性引物组，由用于检测甘蔗白叶病植原体的tuf基因特异性引物和用于检测白条黄单胞菌的rpoD基因特异性引物组成，所述tuf基因特异性引物由tuf-SF引物和tuf-SR引物组成，目标片段长度为290bp，所述tuf-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述rpoD基因特异性引物由rpoD-SF引物和rpoD-SR引物组成，目标片段长度为498bp，所述rpoD-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，rpoD-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明提供的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，包括双重PCR反应体系和双重PCR反应程序，双重PCR反应体系中所用的引物为上述一种检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR特异性引物组，双重PCR反应终止后取其双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增到290bp大小的单一条带，则检测的甘蔗样品感染了甘蔗白叶病植原体；若扩增到498bp大小的单一条带，则检测的甘蔗样品感染了白条黄单胞菌；若同时扩增到290bp和498bp大小的两条带，则检测的甘蔗样品同时感染了甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌。
所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，其双重PCR反应体系：25μL双重PCR反应体系，其中，灭菌ddH2O 12.7μL，10×PCR缓冲液4.0μL，25mmol/LMgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，20μmol/L tuf-SF 1.0μL，20μmol/L tuf-SR 1.0μL，20μmol/L rpoD-SF 0.5μL，20μmol/L rpoD-SR 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，模板DNA1.0μL；其双重PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。
所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，取其双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳时可取5μL双重PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
本发明提供的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测试剂盒，包括：tuf基因特异性引物和rpoD基因特异性引物，所述tuf基因特异性引物用于检测甘蔗白叶病植原体，目标片段长度为290bp，tuf基因特异性引物由tuf-SF引物和tuf-SR引物组成，tuf-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述rpoD基因特异性引物用于检测白条黄单胞菌，目标片段长度为498bp，rpoD基因特异性引物由rpoD-SF引物和rpoD-SR引物组成，rpoD-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，rpoD-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测试剂盒，还包括双重PCR反应液，24μL双重PCR反应液中有灭菌ddH2O 12.7μL，10×PCR缓冲液4.0μL，25mmol/LMgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，20μmol/L tuf-SF 1.0μL，20μmol/L tuf-SR 1.0μL，20μmol/L rpoD-SF 0.5μL，20μmol/L rpoD-SR 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL。使用该试剂盒时，在所述的24μL双重PCR反应液中加入模板DNA 1.0μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
原核生物的延伸因子基因(tuf基因)和RNA聚合酶σ70因子基因(rpoD基因)不如16SrRNA基因保守，在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行特异性分子检测和鉴定，目前尚无针对这两个基因设计特异性PCR引物检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的报道。
现有技术要想检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌这两种病原必须分别进行两个PCR反应，且检测甘蔗白叶病植原体所用引物为通用引物，特异性不强，检测过程费工费时，与之相比，本发明针对甘蔗白叶病植原体tuf基因和白条黄单胞菌rpoD基因分别设计了一对特异性引物，经过条件优化，建立了可以同时检测出甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR反应体系。本发明的检测引物针对具有多变性的基因设计，因此均为特异性引物，特异性强，提高了检测的准确度，同时，本发明建立的双重PCR方法能够在一次PCR反应中同时检测出甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌，且PCR反应时长只需1.5小时，大幅节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本，经多次重复验证均能得到稳定的结果、具有快速、特异性强、精准、稳定的特点，本发明为该两种病害的精准有效诊断、脱毒种苗检测和引种检疫提供了技术支持，对防控该两种病害的扩散蔓延具有重要意义。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是tuf-SF引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是tuf-SR引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是rpoD-SF引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是rpoD-SR引物的核苷酸序列。
附图说明
图1为甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌双重PCR检测电泳图，其中，M为DNAMarkerE，1为混合了甘蔗白叶病植原体DNA和白条黄单胞菌DNA的样品，2为感染了甘蔗白叶病植原体的甘蔗叶片样品，3为感染了白条黄单胞菌的甘蔗叶片样品，4为健康甘蔗叶片样品，5为ddH2O。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例
1.引物设计
根据甘蔗白叶病植原体tuf基因序列设计用于检测甘蔗白叶病植原体的tuf基因特异性引物，预期扩增片段大小为290bp，所述tuf基因特异性引物由tuf-SF引物和tuf-SR引物组成，目标片段长度为290bp，所述tuf-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据白条黄单胞菌的rpoD基因序列设计用于检测白条黄单胞菌的rpoD基因特异性引物，预期扩增片段大小为498bp，所述rpoD基因特异性引物由rpoD-SF引物和rpoD-SR引物组成，目标片段长度为498bp，所述rpoD-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，rpoD-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.DNA提取
按文献“Zhang R Y,Li W F,Huang Y K,et al.Group 16SrXI phytoplasmastrains,including subgroup 16SrXI-B and a new subgroup,16SrXI-D,areassociated with sugar cane white leaf.International journal of systematic andevolutionary microbiology,2016,66(1):487-491.”方法检测得到感染了甘蔗白叶病植原体的甘蔗叶片，按文献“Wang Z K,Comstock J C,Hatziloukas E,et al.Comparison ofPCR,BIO-PCR,DIA,ELISA and isolation on semiselective medium for detection ofXanthomonas albilineans,the causal agent of leaf scald of sugarcane.PlantPathology,1999,48(2):245-252.”方法检测得到感染了白条黄单胞菌的甘蔗叶片，分别取感染了甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的甘蔗叶片各0.2g，使用植物基因组DNA提取试剂盒(以北京全式金生物技术公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取试剂盒为例)分别提取叶片总DNA，具体步骤按照该说明书操作。
3.双重PCR检测
25μL双重PCR反应体系，其中，灭菌ddH2O 12.7μL，10×PCR缓冲液4.0μL，25mmol/LMgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，20μmol/L tuf-SF 1.0μL，20μmol/L tuf-SR 1.0μL，20μmol/L rpoD-SF 0.5μL，20μmol/L rpoD-SR 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，模板DNA 1.0μL；其双重PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。
4.结果判定
取5μL双重PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，模板加入混合了甘蔗白叶病植原体DNA和白条黄单胞菌DNA的出现两条特异性条带，一条约为290bp，另一条约为498bp；模板只加入甘蔗白叶病植原体DNA的可扩增出一条约290bp的单一条带；模板只加入白条黄单胞菌DNA的可扩增出一条约498bp的单一条带；健康甘蔗和水对照未扩增出任何条带。
序列表
<110> 云南省农业科学院甘蔗研究所
<120> 一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法及其引物组
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> y=t或c
<400> 1
attgattgyc ctggtcatgc tgat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> y=t或c
<400> 2
gctgaaccac gaataatagg yaca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggagaccct gctcgaggat tacg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccttccca ggaacggatg aaat 24

Claims (6)

1.一种检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR特异性引物组，其特征在于，所述双重PCR特异性引物组由用于检测甘蔗白叶病植原体的tuf基因特异性引物和用于检测白条黄单胞菌的rpoD基因特异性引物组成，所述tuf基因特异性引物由tuf-SF引物和tuf-SR引物组成，目标片段长度为290bp，tuf-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述rpoD基因特异性引物由rpoD-SF引物和rpoD-SR引物组成，目标片段长度为498bp，rpoD-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，rpoD-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，其特征在于：双重PCR反应体系中所用的引物为权利要求1所述的一种检测甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR特异性引物组，双重PCR反应终止后取其PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增到290bp大小的单一条带，则检测的甘蔗样品感染了甘蔗白叶病植原体；若扩增到498bp大小的单一条带，则检测的甘蔗样品感染了白条黄单胞菌；若同时扩增到290bp和498bp大小的两条带，则检测的甘蔗样品同时感染了甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌。
3.根据权利要求2所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，其特征在于：
(1)双重PCR反应体系：
25μL双重PCR反应体系，其中，灭菌ddH2O 12.7μL，10×PCR缓冲液4.0μL，25mmol/LMgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，20μmol/L tuf-SF 1.0μL，20μmol/L tuf-SR 1.0μL，20μmol/L rpoD-SF 0.5μL，20μmol/L rpoD-SR 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，模板DNA 1.0μL；
(2)双重PCR反应程序：
94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。
4.根据权利要求2或3所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测方法，其特征在于：取其PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳时取其5μL PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
5.一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：tuf基因特异性引物和rpoD基因特异性引物，所述tuf基因特异性引物用于检测甘蔗白叶病植原体，目标片段长度为290bp，tuf基因特异性引物由tuf-SF引物和tuf-SR引物组成，tuf-SF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tuf-SR引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述rpoD基因特异性引物用于检测白条黄单胞菌，目标片段长度为498bp，rpoD基因特异性引物由rpoD-SF引物和rpoD-SR引物组成，rpoD-SF引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，rpoD-SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求5所述的一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括双重PCR反应液，24μL双重PCR反应液中有灭菌ddH2O12.7μL，10×PCR缓冲液4.0μL，25mmol/L MgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，20μmol/Ltuf-SF 1.0μL，20μmol/L tuf-SR 1.0μL，20μmol/L rpoD-SF 0.5μL，20μmol/L rpoD-SR0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL。
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云南甘蔗白条黄单胞菌鉴定和多基因系统发育分析;李文凤等;《中国植物保护学会2018年度学术年会暨植保科技颁奖大会》;20181024;第58页 *
云南蔗区发现由植原体引起的检疫性病害甘蔗白叶病;李文凤等;《植物病理学报》;20141231;第44卷(第5期);第3节第2段 *

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