KR102240776B1 - 신종 및 변종 고구마 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 키트, 및 고구마 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 10개의 서로 다른 지역에서 채취한 고구마 잎으로부터 라이브러리를 제작하고 바이롬(virome) 분석을 수행함으로써 2개의 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 1개의 변종 고구마 바이러스 SPVG를 동정하였으며, 직접 확보한 신종 또는 변종 고구마 바이러스 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 고구마 감염 바이러스의 모니터링 및 바이러스 프리(virus free) 고구마 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신종 및 변종 고구마 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 {Primer sets for diagnosing of new and variant sweet potato viruses and diagnostic methods using thereof}

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 키트, 및 고구마 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.

고구마(Ipomoea batatas)는 쌍떡잎 다년생 식물로 Convolvulaceae 과에 속한다. 고구마는 주로 전 세계의 열대와 온대지역에서 넓게 재배되고 있으며, 많은 양의 베타카로틴, 탄수화물, 섬유질 및 다양한 영양분들을 포함하고 있어서 가장 건강한 음식 중의 하나로 알려져 있다.

한편, 주요 고구마 품종들은 무성번식 방법인 영양방식으로 재배되고 있어서, 다양한 병원성 미생물에 의해 심각하게 감염되어 있다. 지금까지 고구마 감염 바이러스로 약 30개가 넘는 고구마 감염 바이러스 종들이 알려져 있다. 그 중 가장 많이 동정되는 바이러스로는 Begomovirus 속에 속하는 DNA 바이러스인 Sweet potato leaf curl virus(SPLCV)가 있으며, 그 외 Potyviridae 과에 속하는 다양한 종류의 RNA 바이러스들이 있다. 잘 알려진 고구마 감염 RNA 바이러스로는, Potyviridae 과에 속하는 Sweet potato feathery mottle virus(SPFMV), Sweet potato virus C(SPVC), Sweet potato virus G(SPVG), Sweet potato virus 2(SPV2), Sweet potato latent virus(SPLV) 및 Sweet potato mild mottle virus(SPMMV)와, Flexiviridae 과에 속하는 Sweet potato chlorotic fleck virus(SPCFV) 및 Closteroviridae 과에 속하는 Sweet potato chlorotic stunt virus(SPCSV) 등이 있다.

차세대염기서열분석(Next-generation sequencing; NGS) 기술의 빠른 발달로 인해 이를 이용하여 바이러스 동정, 바이러스 진단 및 바이러스 유전체 조립 등을 손쉽게 할 수 있게 되었다. 예를 들면, NGS 기술을 이용하여 고구마에 감염되어 있는 바이러스들을 RNA-Sequencing이나 small RNA-Sequencing 기술들을 이용하여 동정하였을 뿐만 아니라, Illumina MiSeq 시스템을 이용해 Begomovirus 속에 속하는 두 종의 DNA 바이러스 Sweet potato mosaic virus(SPMaV) 및 Sweet potato leaf curl Sao Paulo virus(SPLCSPV)와 두 종의 RNA 바이러스인 SPFMV 및 SPCSV가 남아프리카 공화국에서 동정되었다. 최근에 중국에서는 small RNA-Sequencing을 통해 10개 지역에서 채취한 219개 샘플에서 SPVG와 SPFMV를 포함한 총 11개의 바이러스들을 동정하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 고구마 감염 바이러스의 진단 및 모니터링, 나아가 바이러스 프리(virus free) 고구마 개발에 활용하고자, 10개의 서로 다른 지역에서 채취한 고구마 잎으로부터 라이브러리를 제작하고 바이롬(virome) 분석을 수행함으로써 2개의 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 1개의 변종 고구마 바이러스 SPVG를 동정하였으며, 상기 신종 또는 변종 고구마 바이러스 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 고구마 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "고구마 바이러스"는 고구마에 나타나는 질병의 원인이 되는 바이러스를 총칭하는 것으로, 예컨대 Begomovirus 속에 속하는 DNA 바이러스 Sweet potato leaf curl virus(SPLCV), Potyviridae 과에 속하는 Sweet potato feathery mottle virus(SPFMV), Sweet potato virus C(SPVC), Sweet potato virus G(SPVG), Sweet potato virus 2(SPV2), Sweet potato latent virus(SPLV) 및 Sweet potato mild mottle virus(SPMMV)와, Flexiviridae 과에 속하는 Sweet potato chlorotic fleck virus(SPCFV) 및 Closteroviridae 과에 속하는 Sweet potato chlorotic stunt virus(SPCSV) 등을 모두 포함하는 것일 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명에서는 10개의 서로 다른 지역에서 채취한 고구마 잎으로부터 라이브러리를 제작하고 바이롬(virome) 분석을 수행한 결과로, 2개의 신종 고구마 바이러스 SPVF isolate GS(Sweet potato virus F isolate GS), SPVE(Sweet potato virus E isolate GS) 및 1개의 변종 고구마 바이러스 SPVG isolate IS(Sweet potato virus G isolate IS)를 동정하였다. 구체적으로, 상기 신종 고구마 바이러스 SPVF isolate GS는 서열번호 7의 전체 염기서열로 이루어져 있고, NCBI Genbank database에 Accession No. MH388501로 등록되었다. 상기 신종 고구마 바이러스 SPVE isolate GS는 서열번호 8의 전체 염기서열로 이루어져 있으며, NCBI Genbank database에 Accession No. MH388502로 등록되었다. 또한, 상기 변종 고구마 바이러스 SPVG isolate IS는 서열번호 9의 전체 염기서열로 이루어져 있고, NCBI Genbank database에 Accession No. MH388503으로 등록되었다. 본 명세서에 있어서 용어 신종 고구마 바이러스 SPVF isolate GS는 신종 고구마 바이러스 SPVF 또는 SPVF isolate IC와 혼용될 수 있으며, 신종 고구마 바이러스 SPVE isolate GS는 신종 고구마 바이러스 SPVE, SPVE isolate IC 또는 YJ-B와 혼용될 수 있다.

본 발명에서 상기 신종 또는 변종 고구마 바이러스의 진단을 위한 프라이머는　PCR용　프라이머　쌍을 의미하며, 보다 구체적으로는 이에 제한되지는 않으나, 상기 고구마　바이러스의 RNA 게놈에 대한 RT-PCR(reverse transcription PCR)용　프라이머　쌍을 의미할 수 있다. 본 발명의　프라이머　쌍은 정방향　프라이머와 역방향　프라이머를 포함하며, 구체적으로는 신종 고구마 바이러스 SPVF isolate GS를 진단할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 신종 고구마 바이러스 SPVE isolate GS를 진단할 수 있는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 변종 고구마 바이러스 SPVG isolate IS를 진단할 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 변종 SPVG isolate IS의 경우 기존 SPVG와 구별할 수 있도록 각 SPVG 유전체들을 비교 분석한 후 SPVG isolate IS의 C-terminal를 이용해 디자인하였고, SPVF isolate GS는 CP부분을 포함하였으며, SPVE isolate GS는 다단백질 일부분을 증폭할 수 있도록 디자인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 바이러스 진단용 조성물 및 이를 포함하는 고구마 바이러스 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 역전사-중합효소연쇄반응 키트일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물 및 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는　프라이머　쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는　프라이머　쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는　프라이머　쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의　프라이머　쌍과, 추가로 역전사 반응 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적 상 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 역전사 효소(reverse transciptase), DNA 폴리머라제(polymerase), dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 또한 RT-PCR 산물의 증폭 여부를 확인하기 위해 전기영동(electrophoresis)의 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가, 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC-water 및 멸균수 등이 포함될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 고구마 바이러스 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 변종 고구마 바이러스 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계의 시료는 본 발명의 신종 또는 변종 고구마 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 구체적으로는 RNA를 추출하기 위한 미지의 물질을 의미하는 것으로, 예컨대 상기 바이러스가 감염된 고구마의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 등을 포함할 수 있으며, 그밖에도 식품, 천연물(예컨대, 물) 또는 생물학적 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 역전사-중합효소연쇄반응을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, RT-PCR 조건으로 50℃에서 30분, 95℃에서 15분, 이어서 95℃에서 20초, 50℃ 내지 56℃에서 40 초 (어닐링 온도는 프라이머의 Tm 값에 따라 변화될 수 있음), 및 72℃에서 1분 동안 30회 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.

상기 (c) 단계에서 증폭된 표적 핵산의 검출은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), DNA 칩, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 증폭된 RT-PCR 산물을 겔 전기 영동에 이어 EtBr 염색으로 확인하였으며, 나아가 pGEM-T-Easy Vector(Promega, Wisconsin, US)에서 증폭된 RT-PCR 산물을 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다.

본 발명은 10개의 서로 다른 지역에서 채취한 고구마 잎으로부터 라이브러리를 제작하고 바이롬(virome) 분석을 수행함으로써 2개의 신종 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 1개의 변종 고구마 바이러스 SPVG를 동정하였으며, 직접 확보한 신종 또는 변종 고구마 바이러스 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 고구마 감염 바이러스의 모니터링 및 바이러스 프리(virus free) 고구마 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1의 a는 본 발명의 고구마 샘플을 수집한 대한민국 내 지역(IC, YJ, GS, NS, IS, GJ, YA, HN)을 나타낸 것이며, 도 1의 b는 샘플의 고구마가 자라는 밭, 도 1의 c및 d는 각각 고구마 잎의 기형 및 색 이상(purpling), 반점을 나타낸 것이다.
도 2는 RT-PCR에 의해 고구마를 감염시키는 11개의 확인된 바이러스에 관한 것으로, RT-PCR에 의해 증폭된 각 바이러스의 영역(amplicon)은 회색 막대로 나타내었다.
도 3은 2개의 신종 바이러스 SPVF isolate GS 및 SPVE isolate GS의 게놈 구성 및 계통 발생 학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 1개의 변종 바이러스 SPVG isolate IS의 게놈 구성 및 계통 발생 학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 총 10개의 서로 다른 고구마 샘플로부터 총 RNA 추출 후, RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물들을 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 고구마의 액틴(actin) 유전자가 positive control로 사용되었으며, 새롭게 디자인한 RT-PCR 프라이머로 동정되는 신종/변종 고구마 바이러스를 녹색으로 표시하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고구마 바이러스 연구를 위한 잎 샘플 수집

고구마 감염 바이러스를 식별하고자, 2016년 및 2017년 8개의 다른 지역에서 고구마 잎 샘플을 수집하였다(도 1의 a). 모든 고구마는 도 1의 b와 같이 밭에서 재배되며, 도 1의 c 및 d와 같이 질병 증상을 보이는 잎 샘플을 수집하였다. 수집된 잎 샘플을 지역에 따라 모으고, total RNA 추출에 사용하였다. 총 357 개의 샘플을 RNA-Seq에 적용하였으며, RNA-Seq에 대한 10 개의 상이한 라이브러리를 제조하고 HiSeq2000 시스템을 통해 paired-end sequencing하였다.

실시예 2: Total RNA 추출 및 RNA-Seq를 위한 라이브러리 준비

고구마 잎 샘플을 모은 후 이를 액체 질소의 하에 동결시켰다. 냉동된 잎 샘플을 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. RNA-Seq에 대한 총 RNA를 추출 하기 위해 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, 10 Hilden, Germany)를 사용하였다. 추출된 총 RNA의 품질 및 양을 겔 전기영동에 이어 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, U.S.A.)를 사용하여 측정하였다. NEBNext Ultra RNA 라이브러리 프렙 키트를 사용하여 추출된 총 RNA로부터 10 개의 서로 다른 RNA-Seq 라이브러리를 제조하였다. 즉, 폴리-T 올리고-부착된 자성 비드를 사용하여 폴리 (A)-꼬리 mRNA를 추출하였다. 추출된 mRNA로부터 cDNA의 첫번째 가닥을 합성한 후 cDNA의 두번째 가닥을 합성하였다. DNA 단편의 3' 말단은 아데 닐화되었다. 어댑터 liagation 후 PCR 증폭을 수행하여 어댑터가 있는 DNA 단편을 선택적으로 풍부하게하고, 라이브러리에서 많은 양의 DNA를 증폭시켰다. 이후 2100 Bioanalyzer를 사용하여 각 라이브러리의 품질 및 양을 다시 측정하였다. 2016년에 제작된 6 개의 라이브러리는 HiSeq2300 플랫폼을 사용하여 Theragen(한국, 수원)에 의해 paired-end sequencing 하였고, 2017년 제작된 4 개의 라이브러리는 HiSeq2000 플랫폼을 사용하여 Macrogen Co.(서울, 한국)에 의해 paired-end sequencing 하였다.

실시예 3: De novo 전사체 조립 및 바이러스 식별

De novo 전사체 조립 및 BLAST 검색을 포함한 바이오인포매틱스 분석에는 Ubuntu 16.04.4 LTS와 함께 설치된 2개의 20-코어 CPU 및 256GB RAM이있는 워크 스테이션을 사용하였다. 이전 연구의 결과를 바탕으로, de novo 전사체 조립을 위한 기본 매개변수로 Trinity 프로그램(버전 2.0.2, 2015년 1월 22일)만 사용하였으며, 각각의 라이브러리로부터의 raw 서열 판독은 트리니티 (Trinity)를 사용하여 de novo 조립되었다. NCBI의 바이러스 레퍼런스 데이터베이스로부터 식물 종을 감염시키는 바이러스들만 선택하여 자체 식물 바이러스 게놈 데이터베이스를 생성하였다. 바이러스 관련 콘티그(contig)를 확인하기 위해, 컷오프 E-value가 1e-6 인 MEGABLAST을 사용하여 각 라이브러리로부터의 조립된 콘티그(전사체)를 식물 바이러스 게놈 데이터베이스에 대해 blast하였다. 얻어진 바이러스 관련 콘티그를 다시 NCBI의 NT 데이터베이스에 blast하여 고구마 숙주 서열 및 다른 오염 된 서열을 제거 하였다. 궁극적으로, 고구마 바이러스의 연구에는 바이러스 관련 콘티그만을 사용하였다.

실시예 4

4-1: 바이러스 게놈 조립 및 명명(annotation)

BLAST 결과에 기초하여, 각 라이브러리의 바이러스 관련 콘티그를 MEGA7 프로그램에서 구현된 ClustalW 프로그램을 사용하여 식별된 바이러스 레퍼런스 게놈에 정렬하였다. 추가 정렬(alignment)없이 몇 개의 거의 완전한 바이러스 게놈 서열을 얻었으며, 3' 말단의 Poly(A) 꼬리 서열은 삭제되었다. 이후 다시 기본 매개변수로 BWA(Browrows-Wheeler Aligner) 프로그램을 사용하여 바이러스 게놈의 누락된 갭을 채우기 위해 식별된 바이러스 게놈 서열에 대한 raw 서열 판독 값을 정렬하였다. 각 바이러스 게놈에서 ORF를 예측하기 위해 ORF Finder 프로그램(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)을 사용했으며, 해당 레퍼런스 바이러스 게놈을 비교하여 식별된 ORF와 5' 및 3' 미번역 영역(UTR)을 수동으로 확인하였다.

4-2: 고구마 감염 바이러스의 전체 게놈 분석

고구마 전사체로부터 여러 고구마 감염 바이러스의 게놈을 조립하였으며, SPFMV, SPLCV, SPLV, SPVC, SPVF, SPVE 및 SPVG를 포함한 총 7가지 바이러스에 대해 ORF를 포함하는 12개의 거의 완전한 게놈을 조립하였다(표 1). SPLCV 및 SPVF를 제외한 모든 바이러스는 Potyvirus 속에 속하며, 추가로 식별된 고구마 바이러스에 대한 여러 부분 서열을 수득하였다.

No.	명칭	약어	종	속	분리주 명칭	게놈 사이즈	기탁 번호
1	Sweetpotato feathery mottlevirus	SPFMV	Potyviridae	Potyvirus	IC	10812	MH388493
2	Sweetpotato feathery mottlevirus	SPFMV	Potyviridae	Potyvirus	YJ	10877	MH388494
3	Sweetpotato feathery mottlevirus	SPFMV	Potyviridae	Potyvirus	YJ-B	10714	MH388495
4	Sweetpotato leaf curl virusDNA A	SPLCV	Geminiviridae	Begomovirus	GS	2829	MH388496
5	Sweetpotato latent virus	SPLV	Potyviridae	Potyvirus	YJ-B	10065	MH388497
6	Sweetpotato virus C	SPVC	Potyviridae	Potyvirus	GS	10827	MH388498
7	Sweetpotato virus C	SPVC	Potyviridae	Potyvirus	IC	10798	MH388499
8	Sweetpotato virus C	SPVC	Potyviridae	Potyvirus	IS	10796	MH388500
9	Sweetpotato virus F	SPVF	Betaflexiviridae	Carlavirus	GS	9122	MH388501
10	Sweetpotato virus E	SPVE	Potyviridae	Potyvirus	GS	10890	MH388502
11	Sweetpotato virus G	SPVG	Potyviridae	Potyvirus	IS	10785	MH388503
12	Sweetpotato virus G	SPVG	Potyviridae	Potyvirus	YJ	10770	MH388504

실시예 5: 식별된 바이러스의 계통 발생학적 분석

계통수(phylogenetic tree) 분석을 위해, 조립된 바이러스 게놈 서열과, 8 개의 바이러스에 대해 GenBank로부터 이용 가능한 바이러스 게놈 서열을 사용하였다. SPVF 및 그 상동성 서열에 대해 RdRp 아미노 서열, CP 아미노 서열 및 완전한 게놈 서열을 사용하였고, 반면 SPVE 및 이의 상동성 서열에 대해서는 다단백질(polyprotein) 아미노산 서열 및 완전한 게놈 서열을 사용하였다. 6 개의 바이러스(SPFMV, SPVC, SPVG, SPLV, SPV2 및 SPLCV)의 경우, 실시예 4에서 얻은 완전한 게놈 서열과 GenBank의 완전한 바이러스 게놈 서열이 사용되었다. 6개의 SPFMV 게놈, 7개의 SPVC 게놈, 2개의 SPVG 게놈, 3개의 SPLV 게놈, 4개의 SPV2 게놈 및 4개의 SPLCV 게놈을 계통수의 구성에 사용하였다. 개별 바이러스에 대해, 바이러스 서열은 ClustalW 프로그램을 사용하여 정렬하였으며, maximum likelihood method 및 1,000 부트 스트랩 복제와 함께 MEGA7 프로그램을 사용하여 정렬된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 계통수 구성에 사용하였다.

실시예 6

6-1: RT-PCR 분석

RNA-Seq의 결과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 이를 위해 12 개의 RT-PCR 프라이머 쌍을 디자인하였으며, 고구마의 액틴 유전자를 양성 대조군으로 사용하였다.

SPVG의 경우, SPVG 및 SPVG isolate IS에 대해 두 개의 서로 다른 프라이머 쌍을 설계하였고, SPVG isolate IS 특이적 프라이머 쌍은 IS 영역으로부터 식별된 SPVG의 변이체를 증폭시킬 수 있다. 설계된 프라이머 쌍의 자세한 정보는 아래 표 2에 나타내었으며, RT-PCR에 의해 증폭된 각 바이러스의 영역은 도 2에 나타내었다.

레퍼런스	레퍼런스 게놈	PCR 산물 크기 (bp)	명칭	5'-프라이머 서열-3'	프라이머 위치	서열 번호
Ipomoea batatas actin	AY905538.1	397	IbACT-F1	ACTCAGTGGCGGGACTACCATGTT	1-25 / 397-369	-
			IbACT-R1	GTGCAACATCATAATATAACTCCTTGAAT
Sweet potato virus C	NC_014742.1	560	SPVC-CP1F	TCGGTGTATCATCAATCTGGC	9641-9661(-1) / 10200-10181	-
			SPVC-CP1R	CCATCCATCATCGTCCAAAC
Sweet potato feathery mottle virus	NC_014742.1	402	SPFMV-SP1F	CTCCACCACCCACAATAACTG	9719-9739 / 10120-10101	-
			SPFMV-SP1R	TCCCCATTCCTGTATCGTCA
Sweet potato virus 2	NC_017970.1	489	SPV2-IVMV-P1F	TGCTGAAATGGGCATACTCC	10026-10045 (-1) / 10514-10493	-
			SPV2-IVMV-P1R	TGCACACCTCTCATTCCTAACA
Sweet potato leaf curl virus	NC_004650.1	300	SPLCV-P1F	GAAGCTATGTCCCGGTTTCAAGAG	425-448 / 724-703	-
			SPLCV-P1R	GCCTTCTGTCACGAATCAACCA
Sweet potato chlorotic feck virus	NC_004650.1	900	SPCFV-7768F1	ATGGCGGCGAAGGAGGCT	7768-7785 / 8667-8641	-
			SPCFV-8667R1	TCACTTGCACTTCCCATTACCTTTAAG
Sweetpotato symtomless mastrevirus 1	NC_034630.1	436	SPSMV-MastvKF	GACAGACCCCTAGGGTGA	218-235 (-1) / 653-632	-
			SPSMV-MastvsR	ACTGCATATAGTACATGCCACA
Sweet potato latent virus	NC_020896.1	873	SPLV-9003F1	CAAGCCGATGAAACCATCCTCG	9003-9024 / 9875-9848	-
			SPLV-9875R1	ACGCATTCCAAGTAGTGTGTGTATGTTC
Sweet potato virus F isolate GS	MH388501	930	SPVF-F1	ATGTTTCCTGGAGAAAGTCAAGAAAGC	7568-7594 / 8497-8470	1
			SPVF-R1	AGGCTTAATAGCTGCATGGTTAGTCACA		2
Sweet potato virus G	NC_018093.1	702	SPVG-9856F1	AGAGATGTGAATGCTGGTACGGTTG	9865-9889 / 10536-10566	-
			SPVG-10566R1	CCTCATACCCAAGAGGTTATGTATATTCCTT
Sweet potato virus E isolate GS	MH388502	939	SPVE-F2	TCTGGAGAAAAACCCGAATTTAAAGAT	6020-6046 / 6958-6935	3
			SPVE-R2	CTGCACACCCCTCATTCCTAAGAG		4
Sweet potato virus G isolate IS	MH388503	702	SPVG-IS-F2	AGAGACGTAAATGCCGGAACAGTAGG	9853-9878 / 10554-10524	5
			SPVG-IS-R2	CCTCATACCTAAGAGGTTATGTATATTCCTT		6

RT-PCR 분석을 위한 주형 RNA로 모아진 샘플 유래의 동일한 총 RNA를 사용 하였다. RT-PCR은 DiaStar OneStep RT-PCR 키트(SolGent, 대전, 한국)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR 조건은 50℃에서 30분, 95℃에서 15분, 이어서 95℃에서 20초, 50℃ 내지 56℃에서 40 초 (어닐링 온도는 프라이머의 Tm 값에 따라 변화될 수 있음), 및 72℃에서 1분 동안 30회 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.

증폭된 RT-PCR 산물을 겔 전기 영동에 이어 EtBr 염색으로 확인하였으며, 나아가 pGEM-T-Easy Vector(Promega, Wisconsin, US)에서 증폭된 RT-PCR 산물을 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다.

6-2: 고구마 바이러스를 진단하기 위한 분자생물학적 방법(molecular methods) 개발

총 10개의 고구마 감염 바이러스가 발견되었는데, 각 라이브러리의 바이러스-관련 리드(reads)를 기반으로, SPCFV(16개 리드)는 하나의 라이브러리 (IS)에서만 식별되었으며, SPFMV(198,658개 리드)는 총 8개의 라이브러리에서 식별되었다(표 3).

No.	명칭 (Abbreviation)	GJ	GS	HN	IC	IS	NS	YA	YJ	YJ-B	YJ-H
1	SPCFV					16
2	SPFMV	60		191	26392	2020	1902		13046	104115	50932
3	SPLV		3359	1582						6365
4	SPLCV		34027		4580	167	1518		4358	22140	17575
5	SPV2		3684		434				186	1737	5122
6	SPVC	1022	130595	1284		10400			2332	29625	27717
7	SPVG				841	4109			16331	317	3520
8	SPSMV	59	332	19	141	61	80	191	63	187
9	SPVF		667		292
10	SPVE		129306		49226

RNA-Seq 결과를 확인하고 고구마 감염 바이러스에 대한 분자생물학적 진단 방법을 개발하는 것이 중요한데, 이를 위해 10개의 바이러스에 대한 프라이머 쌍을 설계하였다. 9개 바이러스에 대한 RT-PCR 프라이머는 단일 RNA 게놈을 갖는 RNA 바이러스를 위해 설계되었으며, PCR 프라이머는 수득된 바이러스 서열에 기초하여 단일 원형 DNA 게놈을 갖는 SPLCV를 위해 설계되었다(표 1 및 도 2). 특히, 변종 SPVG isolate IS의 경우 기존 SPVG isolate와 구별할 수 있도록 각 SPVG 유전체들을 비교 분석한 후, SPVG isolate IS의 C-terminal를 이용해 디자인하였고, SPVF isolate GS는 CP부분을 포함하였으며, SPVE isolate GS는 다단백질 일부분을 증폭할 수 있도록 디자인하였다. 부분 액틴 유전자를 증폭시키는 프라이머 쌍을 양성 대조군으로 사용하였고, RNA-Seq에 사용된 동일한 샘플에서 총 RNA와 DNA를 추출하였다.

총 10개의 서로 다른 지역에서 채취한 고구마 잎으로부터 추출한 총 RNA를 template로 하여 RT-PCR를 수행하고, 각 샘플로부터 증폭된 PCR 산물을 겔 전기 영동에 의해 가시화하였다(도 5). 그 결과, 전반적으로 PCR 결과는 RNA-Seq의 결과와 상관 관계가 있었으며, 예를 들어, SPFMV는 RT-PCR에 의해 9개의 라이브러리(YA를 제외한 모든 라이브러리)에서 식별된 반면, SPFMV는 RNA-Seq에 의해 8의 라이브러리(GS 및 YA를 제외한 모든 라이브러리)에서 식별되었다. PCR 및 RNA-Seq 결과는 SPV2, SPLCV, SPVF, SPSMV 및 SPLV에서 전반적으로 동일하였다. SPVC, SPVE 및 SPCFV의 경우, RT-PCR은 RNA-Seq와 비교하여 추가적인 바이러스 감염을 확인하였다. 게놈 서열 및 계통 발생 분석에 기초한 결과, SPVG isolate IS는 다른 SPVG isolate와 먼 관계가 있음을 확인하였으며, 따라서 SPVG isolate IS를 위한 추가 프라이머 쌍을 설계하였으며, 결과적으로 크기 702 bp의 SPVG isolate IS 용 프라이머 쌍은 SPVG isolate IS를 높은 특이도로 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 7: 2개의 신종 고구마 감염 SPVF, SPVE 바이러스 및 변종 고구마 SPVG 바이러스 확인

고구마 전사체로부터 고구마 바이러스 F(SPVF)와 고구마 바이러스 E(SPVE)라는 이름의 두 가지 신종 바이러스를 확인하였다. 신종 고구마 바이러스 SPVF isolate GS는 한국 괴산 고구마 재배지에서 동정되었으며, 단일 가닥 RNA 바이러스(single-stranded RNA virus)로 유전체는 총 9,122 뉴클레오티드(nt)로 구성되었다. SPVF isolate GS는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RdRp)를 인코딩하는 6개의 오픈 리딩 프레임(ORF), 3개의 triple gene block(TGB) 단백질, 1개의 코트 단백질(CP) 및 1개의 핵산-결합 단백질 (NABP) 등 총 6개의 단백질을 인코딩한다(도 3e). 국립생물공학정보센터(NCBI)의 뉴클레오티드 데이터베이스에 대한 BLASTN 검색 결과로부터 SPVF isolate GS가 한국에서 확인된 SPCFV isolate UN210(KP115607.1)와 67%의 커버리지와 76%의 뉴클레오티드 동일성을 공유한다는 것을 확인하였다(도 3f). RdRp(도 3g) 및 CP(도 3h) 아미노산 서열에 기초한 계통수는 SPVF가 SPCFV와 동일한 계통군(clade)에 속하며, Betaflexiviridae과 Carlavirus 속에 속함을 나타내었다. 바이러스 분류 국제 위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)의 Carlavirus 속의 종 구분 기준에 의하면, 막단백질(Coat protein; CP) 또는 폴리머라제(polymerase) 유전자가 기존의 가까운 바이러스와 비교하여 뉴클레오타이드(nucleotide) 유사성이 72% 미만이거나, 아미노산(amino acid) 유사성이 80% 미만이어야 한다. 본 발명의 신종 고구마 바이러스 SPVF의 경우 RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)단백질이 기존 바이러스와 78.41% 아미노산 유사성을 나타내는바, Potyvirus 속의 새로운 종임을 확인하였다. 또한, 추가적으로 IC 라이브러리에서 불완전한 게놈의 SPVF isolate IC를 동정하였으며, SPVF isolate GS, IC 및 3개의 SPCFV isolate의 게놈 서열을 사용한 계통수로부터 SPVF가 Carlavirus 속의 새로운 종이라는 것을 확인하였다(도 3i).

또한, 신종 고구마 바이러스 Sweet potato virus E (SPVE) isolate GS를 한국 괴산 고구마 재배지에서 동정하였으며, 이는 단일 가닥 RNA 바이러스(single-stranded RNA virus)로 유전체는 총 10,890 nt로 구성되었다. SPVE isolate GS는 다단백질을 인코딩하는 2개의 ORF로 구성되었다(도 3a). 뉴클레오티드 데이터베이스에 대한 BLASTN 검색 결과는 SPVE isolate GS가 남아프리카에서 확인 된 SPVC isolate ECK17 1(KT069223.1)과 86% 커버리지 및 77% 뉴클레오티드 동일성을 공유함을 나타내었다(도 3b). 다단백질 아미노산 서열에 기초한 계통수는 SPVE isolate GS가 5개의 SPVC isolate와 동일한 계통군에 속하며, Potyviridae과 Potyvirus속에 속함을 나타내었다(도 3c). 또한, 추가적으로 국내 여주에서 채집한 고구마 YJ-B 라이브러리로부터 불완전한 게놈의 SPVE를 동정하였으며, SPVE, SPVC 및 SPFMV의 완전한 게놈 서열을 기반으로 한 계통수로부터 SPVE는 SPVC 및 SPFMV와 먼 관계가 있음을 확인하였다. 바이러스 분류 국제 위원회(ICTV)의 Potyvirus 속의 종 구분 기준에 의하면, 전체 ORF의 염기서열이 기존 가까운 바이러스와 비교하여 뉴클레오타이드 유사성이 76% 미만이고, 아미노산 유사성이 82% 미만이어야 한다. 본 발명의 신종 고구마 바이러스 SPVE의 경우 기존 바이러스와 73.88%의 뉴클레오타이드(Complete nucleotide) 유사성과 79.60%의 아미노산(polyprotein) 유사성을 나타내는바, Potyvirus 속의 새로운 종임을 확인하였다(도 3d).

한편, 변종 고구마 바이러스 SPVG isolate IS는 한국 익산 고구마 재배지에서 동정하였으며, 단일 가닥 RNA 바이러스(single-stranded RNA virus)로 유전체는 총 10,785 nt로 구성되었다(도 4a). SPVG isolate IS는 각각 다단백질, P1N-PISPO, P3N-PIPO를 인코딩하는 3개의 ORF를 포함한다. 추가적으로 한국 여주 지역에서 SPVG isolate YJ의 유전체를 확보하였으며, 기존에 알려진 10개의 SPVG isolates의 전체 유전체 서열과 SPVG isolate IS와 SPVG isolate YJ의 전체 염기서열을 이용하여 계통수를 분석한 결과, 두 개의 서로 다른 그룹을 얻었다(도 4b). SPVG isolate YJ의 경우 다른 9개 SPVG isolate들과 함께 그룹을 이루고 있었으나, SPVG isolate IS는 SPVG isolate WT325와 함께 그룹을 이루고 있으며, BLASTN 수행결과 SPVG isolate IS는 WT325와 98% coverage와 81.39% nucleotide identity를 보여주였다. 게놈 서열 및 계통 발생 분석에 기초한 결과, SPVG isolate IS는 다른 SPVG isolate와 먼 관계가 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Primer sets for diagnosing of new and variant sweet potato viruses and diagnostic methods using thereof <130> KPA01420 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVF-F1 <400> 1 atgtttcctg gagaaagtca agaaagc 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVF-R1 <400> 2 aggcttaata gctgcatggt tagtcaca 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVE-F2 <400> 3 tctggagaaa aacccgaatt taaagat 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVE-R2 <400> 4 ctgcacaccc ctcattccta agag 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVG-IS-F2 <400> 5 agagacgtaa atgccggaac agtagg 26 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPVG-IS-R2 <400> 6 cctcatacct aagaggttat gtatattcct t 31 <210> 7 <211> 9122 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Sweetpotato virus F isolate GS <400> 7 tcttccgatc tgaaaaacag cacagagcaa taagaaacaa tccagaaaga tttaaaacaa 60 ccaagtcatt ctgcaatgtc tcttacattt cgctctcctg ctgaagaggc tttatcctcg 120 ttctcatccg ttgaacaatc ccaaataact cgtaaagctc ttgccacatt cataggtata 180 gaagaaaggg atcatacttt cttcaactat gcagtcaaga ctcatgcgaa ggaacgttta 240 acgaatgctg ggatatacct ctcgcccgtc tcacccatac ctcattccca tcctgtatgt 300 aaaattttag aaaattatat gctgtacaaa gtattgccga gtgttattga taatagcttt 360 ttctttgttg gcattaaaga taataagttt actgcattta aatccaggga accaaagttg 420 gacctggtaa cttgtataaa taggtttgtt actagtcaag ataagaatag gtatttcggc 480 tggagaacgg ctaagtgtac cgttgctgag gtaggaagca ctgttgcaaa ttctcccagt 540 ctagtagggt tggtgcccca agtcttgagt cagcgtgcga ggaatatttt cttacatgat 600 gagatacact actggagccg cagagagctc attacttttc tagaagtggc gaagccagaa 660 aggttactag caactctcat attcccacca gaaatcttgg caggttcaaa agtgagttta 720 aatcggtggt gttacgagta tgagattagg gagtgtggta gaagtggggc aaatggcatg 780 ctcaatttcc gggcggctta ccgcggtgac agtggaaaaa ccctgttctt ttaccccgat 840 ggggttagat cagaaggtta tgaacaacct ttagattctg gctttctact caagacaagg 900 cggatagtgt gtaatgatgg gactgtttat agtgtagaca taatatgttc aaagtttgcg 960 catcatcttg ttagcataac tagaggtagt tttgtaggga gatcatctag atcttttggg 1020 gattttgagg ccataacaac tagaggtctt aataaagttt cttcaaatat gaaagatgcc 1080 tatcccatat gctatactac tgttaatagg atctatagat atttgaggtc tcttgttaaa 1140 cccgatgtac agtcagccgt ctctaagtta tctcagaccg ttggcgagcc taccgggcct 1200 gaaataaagt ttgtagagga atttgcaaag ttagttataa atacccatag tataaatagt 1260 atgataggta aggaggattt caaaatccta caaggtctcg tggctggggc attgcctcga 1320 atgttcgccc agaggtttaa ggagtttagg gccataagtc ttgatgagtt catatgcgaa 1380 ctagcgccct attcgttcaa tttaagcctt gttgatctga aaagtgacac gtgtttagac 1440 tttgtatttt atgatgtcac ttttggttct gtaacaaagg acccggtcac acttatggaa 1500 aaaatctttc tggagggctc tgaaactgtg aggcccaatg gcctctatca ctgtgatgaa 1560 tcccactctt atgtgcttga gttgagtgaa ggtggaatgg caattctgtt taatcgattc 1620 ttgaggcaat acttgggcta cttacagcac caattcacaa ggcagaatct agatgagtgt 1680 ctcatacagt tcaagatgtg gttcaaatca agtaagatac tcagcttaac tttctatgct 1740 ttagatgggg aggatgctct caagattttt aagaaagtca aagcatgcag atccactcgt 1800 cgagagattg tattccaaag agacggaatc atatggttct tcaacagaca ctcaagttct 1860 aagagtaagt ggtattccag ggatacaaag ttcattaagg atgaccataa gcatctgtcc 1920 aaattggaaa ctgaggttat ttgcaaggcc aaaatgttaa tggcagagtt gaaattaata 1980 gtgcctgtac aattgcctga cgaagagcct acggagaggc ccaagatcag ccccaatgca 2040 gaggaatgga atgtaaatgc aagcgctcaa acagttcaga gttctaatga aggggaaatc 2100 gattctggta cagacgttcc aagagtcact gaagttgcag catctagtcg caccaaggac 2160 tgtgaagaaa gactgctcca gactgaggtc accaggagga ttagtgaatt aatggaggag 2220 caagctgtca tttctaaaga gattaggttt gaaggcatga gcatacctgt taagaaactc 2280 cgcactttgg gcccactatc tttccacttg accgacaatt taaataatcg cgttgcttct 2340 tggcacacaa aaggagtcct gacgccctac aaatataaag gcggttatca cgagcccaaa 2400 ccttggttgg atctatttaa caatatactg gctctcaatg gccttccaag tgattattac 2460 aactgcgtcc tcgtgcaaga gtataaagaa gggggcggta tcaatttcca cagggatgat 2520 gaagatttgt ttgagaaagg tgcaagggtg cttactgtcc atctatacgg aacgtgcatc 2580 ttctcattct caagtgctag agagacagtt tctttcgagt tgactgaaga ttctttcttc 2640 gaaatgccag agcatttcca ggagaagtat tatcatggtg tgcagaactg cacaaaaggt 2700 aggatatcaa tgacattcag gaaactcact ggtagtgtag aggaagcggt tacggatagc 2760 cctaatgttg aaaattctgt tgaagaccaa ggaaaatctg tggaaaagcc tattggaaca 2820 aaggaaacag gaggccaagg aaccgaaggg ggtggtgatt cagaagccag ctcagatgag 2880 ggcccagaaa tctcaacttt tgggtacagc aagcatcgtc tcatggagct tgacctgata 2940 gtcaagaagt atggggatga ggaaatgaat aggctgctat caagcaagaa aaaagtggct 3000 gaatgtgact atgaagggct ttgtagggtt tgtgcttgcg agcttggact taatgagcaa 3060 tatctaaaag agaagtgtga ccatttcatg caggtgttgc cagtaagagc tgcaaatgct 3120 atatccaact tcatactgga tcataatttg gacactgcat ttatcagcct aatgggttta 3180 ataaagatgt tcaaattaca agtcactgtg tttgtacctg cctatggttt aatcctacag 3240 gttgaaggga ataatggaaa ggtgattgag ctcaattgga acttaagcac gcaatctttt 3300 gaactgctaa ggtgtgcaaa tgactgctgc attagagctg tagctgacgc tttagaaagg 3360 ccagcagacc agattattga ggcaatcagg aacaaaggtg gtgttgaaat tatggaagag 3420 attactgcag gtcaggggct cgaattagag cattttgaga aggttctggc actttttgac 3480 atatgcggca tttgttttgg tgacttcaat actgtactta atgaggaagg taggcttctt 3540 ttctacttct acgtggaaga aggccatgtg gagcattttg tcaagaataa aagtgctggc 3600 aagagtaaac tgaatgcctt gaagaatagg gaagacctac ttgacctcaa aaggtacagt 3660 ggtattttaa aaccaaaaga ggggaataca acaccacatg gggggattag cagaaggcca 3720 ggaaatcaaa ataattacat tctagatctc tccatgatca agccagccag caccagtgtg 3780 aagtttgtaa gcacgaagga tcgtttcaat ctaatcaaga atagccttct ggtaggagac 3840 actggcgtgc tttttgacaa gaattttgac aaagtgggcc ttctggaatc tagaaactgg 3900 tctgagtgga atggccaaat tggggtagtt ttgggtgttt atgggtgtgg aaagagcaca 3960 ctatttaaaa aactagtgaa caaaaaccca agggcataca tacatattgt ttcaccccgt 4020 aaagccctag caaatgagat gaagatggcc ctagaagaaa gtcgtgatgt gcaggttcgc 4080 agaggcggtc ataacactac agtttcgaca tttgagcgct ttatacagag ggcactccaa 4140 aaaaaattca agtgtgacgc actgcttatt gatgaaatcc aattgtaccc acctggatac 4200 ttagatctgg tcacaaactt gataaatcct aaggagaact ctgttttctt aattggggat 4260 ccgtgccaaa gtgattatga ttctctgcga gatagattaa ctttcagtga gattaaacca 4320 gatatagaaa tgctgcttga tggtaaggag tacaagtaca attttttaag cagaagattt 4380 aggaataaaa atttcatggg taggctgaat tgtgcttttg atgaggacct catgaatttt 4440 gaggagccgt acttaatatg caacagcttc gatgagtgta gagcactggc gcctaagtac 4500 catgaagcat tcttggtctc cagttttgag gaaaagaagg tggtgtccgt cgaatttcct 4560 gattgtgagc agatattaac tttcggggaa tctacaggaa ggaacttcag ttatggcacg 4620 cttgtgataa ctggtacctc gaagtatgtt aatgaaaaga ggtgggtgac ggcattaagc 4680 agattttcgc acaacttggc ctttttgaat ctcactggtt acggcataga gagtgtttgc 4740 cagcagtatt cagggctcgc cctaaataac tttttaactg ctaatgccgg acctaaggat 4800 ctgatggtaa gcttgcctgg aaagcctata ctcacaaagg gattcacaag cagaatgggc 4860 aaggactacc aggtcaagga actaaaactt cagggggacc catggcttaa aacaatgatc 4920 aatctgggcc aattagaaga tttccaagat gaggaaatgg gtgaggtggt gcaccaaatt 4980 gaatcagtta aaactcacgt acctctgtca tatttggaag gtgttagggc tacctggaat 5040 gatcgcttca aagctaaaga ggatagggaa tttaagatta agggtctcat tactgatcaa 5100 tttgctgatg agcattcaaa aaatagtggc ttcaaaatga ccaatgctgc cgagagattt 5160 gcagctattt accccagaca taaaagcggt gatacagcca ctttcttaat gggcgtcaga 5220 aaaaggttac gattctcaaa accttctgtt gaatgcgcca agtataggga tgcagcctgc 5280 ttcggaccat ttatgcttaa agaatttcta aagagggtac ctgtcaaacc aggtaggtcc 5340 aacttttatt ttgagaaggc tcttcgagat tttgaggaga aaaagactgc taagagcact 5400 gcaactattg agaatcattc aggaaggtca aatttagatt ggaagatcga tactggtcta 5460 atttttatga aatctcaaaa ttgtacaaaa tttgaaaaca gatttagaga cgctaaagct 5520 gctcagacca tcgtgtgttt ccaccacgtc gttctagcta ggtttgcgcc tttcattagg 5580 tacattgaga tgaagattag tgaggccctc cctgagaatt tttacatcca cagtggcaag 5640 agtctggatg aattgaatga atgggtcata aggaatgatt ttaccagggt gtgcactgag 5700 tcagattatg aggcttttga cgcctctcaa gatgcgtaca tacttgcgtt cgaagtgtgc 5760 ctcatggaac atctatgcct accaagggat ttaattgagg attacaagta cataaaaacg 5820 cacctaggct ccaaacttgg aaacttctca ataatgcgat tttctggtga agcttcaacc 5880 ttcttgttta acacaatagc caacatgctg 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ctacacccca aaaatgttcc tattataaag 1740 caagcggcaa gactcgcagc atggaagaaa caccacagca cagagaacat agtgaaagga 1800 atgagtggtt ttgtcttaaa tcctcaacgc gttactggaa agctagggca tactccaaac 1860 ggaattctcg tggtacgtgg ggctttaaaa ggagtgatat atgatgctcg aatgaagttg 1920 ggaaggtctg ttctcccata tatcgagcaa ttttcgagca ctggttcgag attttggaat 1980 ggatttgacg aaggctttcg aaatctcatt ccatccgata gagatcatgt ctgttcatca 2040 gacataaaag ttgaggatgc aggtagtatg gcagcaatga tccatcacat aatgctacct 2100 atgaatcgca caacttgcgc tatatgtgca agtaatgttt cagatatgag cttagcagaa 2160 tgggttaaac acatgaaggg tttcatactg aagaatcaat cccagatgca acaaaaaggt 2220 ggagcttatg agcattttaa ttggtttttg tcgtcattac caaaagtgct tgttgatgag 2280 aatcctaaca caaaagcttt taatgaaatt cagcaaacga ttggtgaccg tactgattca 2340 cctttctctt tggtaaatga tatcaataga attttgatta agggagggag agcaacaagc 2400 agtgaattca cgcaagccct tgagagtctt ttagaacttg cgcgttactt gaagaataga 2460 actgaaaata ttaagaaagg ttcattggtg tcgtttagga acaagatctc acagaaagct 2520 catgttaact tatctttgat gtgtgacaac caattggaca aaaatggtaa cttgatatgg 2580 ggtgagagag gttaccactc aaaaagattt ttcgcaaatt attttgaggt ggtaaacccc 2640 gaagaagggt acgataagca tatcttgcga ttcaatccca atggaatacg gaaattggca 2700 ataggaaagc tgattgtttc aacaaatttt tcagttttca gggagcaaat gaaaggagag 2760 ccaataccaa agttgaaatt agatcagcac tgcacaagct tgagggatgg aaatttcgtt 2820 tacccctgtt gttgtgtgac acttgatgat ggaaccccta ttgaatctga gtttaaactt 2880 ccaaccaaga accacttagt gattgggaat tctggtgacc caaaatatgt agatatgcct 2940 gctgagatta gtaggaaaat gtatatagca aaagaaggat attgttatgt gaatatcttc 3000 ctagctatgc tcgttaatgt gaatgaaggg gaagcgaaag attttacaaa acaagtccgt 3060 gatgttctta tggaaaagct tggtaaatgg ccttctatgt ttgacgttgc aacagcatgt 3120 gcttttattt cagtgtttta tcctgaaact cgaaatgctg aacttcctcg gatacttgtg 3180 gaccataata ctaagactat gcatgtcatt gattcatttg gttcattgac tacaggatat 3240 cacgtattga aagcgaacac tgttagtcaa ctaattcagt tcgcgagctc aagtcttgaa 3300 tccgaaatga aacactattt ggttggtgga atgatgggag ttaattcatt tgaagaagga 3360 agtttgaaag ctataatcaa aggcatttac 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cacgtgaatg atgcgcaagc aatggctttt 5100 cgatgtcttt tagtggaaca tggatattct ggaaagcttt taaaagtttc tgcaacacca 5160 ccaggacgag aggttgaatt ttcgacacaa tttcctgtga agattaagac ggaggaaagg 5220 ctagcatttc aagcatttgt gaacgcacaa ggaacgggta gcaattccga tgttacgtcc 5280 ttcgctgata acatattggt ttatgttgcc agttacaacg aagttgatga actcagcagg 5340 ttactacttg agaagggtca caaagtcacc aaagttgatg ggagaacgat gaaggttggg 5400 aatgttgaaa tcattacaag tggaactcaa agtcggaaac acttcattgt agcaacaaac 5460 ataatcgaaa atggtgtaac cttggatatt gaagctgtcg ttgattttgg taccaaggtt 5520 acagcatacc tcgatgttga ttcaaggcga attcaaacat gcaaaggacc aattaactat 5580 ggagagagga tacaaagact tggaagagta ggaagaaata aagctggtgt ggctttgaga 5640 attggcttta ctgagaaagg tttgtgcgaa ataccacaaa ccgtcgctac agaagccgcg 5700 tttctgagct ttgcatatgg attaccagtc atgacaaaca atgtttcgac aagtctattg 5760 agcaactgca cagtgaggca ggcaagaaca gcattgcaat ttgagctcac tcctttttac 5820 acagttaaca tggttagata tgatggatca atgcatcaag caatccataa catccttaag 5880 caatacaaac tccgtgattc ggaaattata 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Claims (10)

1. 고구마 바이러스 SPVF (Sweet potato virus F, Genbank Accession No. MH388501)를 진단하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍; 고구마 바이러스 SPVE (Sweet potato virus E, Genbank Accession No. MH388502)를 진단하는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍; 및 고구마 바이러스 SPVG (Sweet potato virus G, Genbank Accession No. MH388503)를 진단하는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 고구마 바이러스 SPVF는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 고구마 바이러스 SPVE는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것인, 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 고구마 바이러스 SPVG는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것인, 고구마 바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
5. 제1항의 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단용 조성물.
   
6. 제5항의 조성물을 포함하는, 고구마 바이러스 진단용 키트.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 고구마 바이러스 진단용 키트.
   
8. (a) 시료로부터 고구마 바이러스 핵산을 분리하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고구마 바이러스 SPVF, SPVE 및 SPVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 바이러스 진단 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인 것인, 진단 방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR)에 의해 수행되는 것인, 진단 방법.

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