KR102429219B1 - 콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종을 판별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도{Marker composition for discrimination of soybean cultivar resistant or susceptible to Phytophthora sojae and uses thereof}

본 발명은 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

콩(Glycine max (L.) Merr.) 역병은 토양에 생존하는 난균류인 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 의해 전염된다. 감수성 콩 식물체가 콩 역병균에 감염되면 뿌리와 줄기가 썩음으로써 고사하게 되고 이는 결과적으로 콩 수량을 감소시킨다. 우리나라에서는 1998년 처음 콩 역병이 발견된 이래 병 발생 보고가 꾸준히 증가하고 있으나, 이후 연구가 많이 수행되지 않았으며 역병 저항성에 대한 유전분석 연구도 초기 단계인 실정이다. 콩 역병 저항성 품종의 검정은 균주를 직접 하배축에 접종하는 방식을 통해 이루어진다. 이는 식물을 균일한 생장 단계까지 재배하는 작업과 특정한 균주가 충분한 양이 되도록 배양하는 작업이 선행되어야 하며 접종 후에도 병 반응이 나타나기까지 또한 시간이 걸리게 되어 다수의 계통을 대상으로 하는 경우 많은 노동력과 기간을 요구하게 된다.

콩의 주요한 역병 저항성 기작은 Rps (Resistance to Phytophthora sojae)라는 저항성 유전자(R gene, R)에 의해 형성되는 질적 저항성(qualitative resistance)으로 나타난다. 식물체에서 R 유전자에 의해 생성되는 R 단백질은 병원균이 생성하는 비병원성(avirulence, Avr) 단백질을 특이적으로 인식하여 저항성을 가지게 되는데, 이러한 상호작용을 유전자-대-유전자(gene-for-gene) 저항성이라고 한다. Avr 단백질은 동일한 병원균에서도 각각의 레이스(race)에 따라 다른 구조를 가지며 이러한 특성이 단백질을 암호화하는 유전자(Avr)에 의해 유지된다. 따라서 콩 역병균(P. sojae) 에 대한 저항성은 각각의 균주에 대한 서로 다른 유전자에 대한 반응으로 나타나게 된다.

최근 본 발명자들은 콩 품종 중 역병균주 2457에 감수성 품종 대풍과 저항성 품종 대원, 그리고 그 두 품종의 교배에서 파생한 재조합 근교 계통(RIL) 집단을 이용하여 저항성 연관 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커의 위치를 탐색한 연구를 수행하였다(Jang et al. 2020. The plant pathology journal. 36(6):591-599). 상기 연구에서 저항성과 연관된 9개의 마커가 3번 염색체의 3,893,390~4,752,969 bp 부분에서 발견되었고 이 마커의 유전자형들이 콩의 저항성 및 감수성 분리와 관련이 있음을 파악하였다.

한편, 한국공개특허 제2018-0028410호에는 '대두에서의 파이토프토라 뿌리 및 줄기 썩음 관련 유전자 좌'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0056520호에는 '콩 점무늬병 저항성 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명자들은 콩 역병 균주 2457 저항성이 특정 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 높은 연관성을 가짐을 대풍과 대원 교배에서 유래한 RIL 집단을 통해 발견할 수 있었다. 상기 결과를 통해 콩 역병 균주 2457 저항성을 특이적으로 검출할 수 있는 마커를 개발하였고 해당 마커를 이용하여 재배종 유전자원인 신록, 녹원, 연풍, 신팔달 2호, 남풍, 명주나물, CS01964, 광교, 수계#43, SLSB406-2 및 KLS77170에 적용하였다. 그 결과 본 발명의 분자마커가 콩 역병 균주 2457에 대한 저항성 여부를 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종을 판별하기 위한 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 마커 조성물을 이용하면 역병 저항성 생물검정보다 노동력 및 시간을 절약할 수 있으므로, 병 저항성 유전자원의 선발 요구에 빠르게 대응할 수 있어 신품종 콩 육성에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 역병 균의 하배축 접종 결과를 보여준다. 왼쪽의 대풍은 감수성이며 오른쪽의 대원은 저항성이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 설계 후 대풍과 대원의 DNA를 이용하여 58, 60 및 62℃에서 증폭반응을 수행하여 프라이머를 선발한 과정을 보여주기 위한 도이다. Ta: 결합(annealing) 온도.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 설계 후 대풍과 대원 교배 유래 RIL에 Set 2G와 Set 2A 프라이머의 특이적 증폭을 보여주는 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머를 사용하여 국내 재배종 유전자원 중 신록, 녹원, 연풍, 신팔달 2호, 남풍, 명주나물, CS01964, 광교, 수계#43, SLSB406-2 및 KLS77170을 이용한 대립유전자형 검정 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종을 판별하기 위한 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 콩 역병균(P. sojae)에 대해 저항성 또는 감수성을 보이는 콩 자원의 Glyma.03g034200 유전자에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 염기 타입을 검출할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 따른 상기 마커 조성물은 바람직하게는 SNAP(single nucleotide-amplified polymorphism) 마커 조성물일 수 있다. SNAP(single nucleotide-amplified polymorphism) 마커는 핵산 서열에서 나타나는 SNP를 선발하는데 쓰이는 마커의 하나로, 간단한 PCR 방법을 이용하여 대립유전자형에 특이적인 증폭산물을 생산하는 것을 기초로 한다. 이용되는 프라이머는 대립유전자형에 특이적인 3' 말단을 가지며 핵산 주형에의 결합 특이성을 높이기 위해 3' 부분 두 번째 또는 세 번째 염기에 주형과 다른 염기서열을 하나 더 가지게 된다. 프라이머 3' 말단에 비 상보적 염기가 있는 경우 상보적인 염기가 있는 경우와 달리 PCR에서 증폭되지 않게 되므로 이론상으로 모든 SNP 대립유전자형의 검정이 가능하나 목표 SNP 주변의 염기서열에 따라 차이가 있어 실제로는 모든 SNP 위치에서 대립유전자 특이적 프라이머를 사용할 수 있는 것은 아니다.

본 발명에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 콩 역병균에 대한 감수성 콩 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트이고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 콩 역병균에 대한 저항성 콩 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트로, 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공통의 정방향 프라이머이며, 서열번호 8 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 서열의 3' 말단 염기가 Glyma.03g034200 유전자의 SNP 위치 염기에 각각 특이적인 역방향 프라이머이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 역방향 프라이머는, SNP 위치 특이적인 염기 외에도 3' 말단으로부터 두 번째에 위치한 염기에 인위적인 미스매치 염기를 삽입하여 SNP 유전자형에 대한 특이성을 높인 것이 특징이다.

본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 7 내지 서열번호 9 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 7의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 7 내지 서열번호 9의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 콩 품종은 이에 한정되지 않으나, 대풍, 대원, 신록, 녹원, 연풍, 신팔달 2호, 남풍, 명주나물, CS01964, 광교, 수계#43, SLSB406-2 또는 KLS77170일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 마커 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 마커 조성물은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것으로, 상기 프라이머 세트에 관한 상세한 내용은 전술한 것과 같다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종의 판별방법을 제공한다.

본 발명에 따른 판별방법은 구체적으로,

콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 콩 시료는 콩 종자, 떡잎, 잎, 뿌리, 줄기 또는 꽃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 판별방법은 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "균주 2457"은 콩 역병균 중 국내에서 분리된 특정 유전형을 가지는 역병균주를 의미한다. 본 발명에서 저항성 및 감수성은 해당 균주에 대해서만 검정되었으나, 동일 유전자좌가 저항성 반응을 나타낼 수 있는 다른 균주에도 적용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명은 그 기술적 사상이나 필수적 특징의 변경 없이 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

프라이머 개발을 위하여 선행 연구(Jang et al. 2020. The plant pathology journal. 36(6):591-599)에서 이용한, 역병 균주 2457에 감수성인 콩 품종 대풍과 저항성인 대원을 이용하였다. 또한, 프라이머의 검정을 위하여 대풍과 대원의 교배로부터 얻은 71개 재조합 근교 계통(RILs)을 이용하였다.

본 발명에서 사용된 프라이머 및 SNP 대립유전자형의 타 유전자원에 대한 검정을 위하여 정 등(Plos one, 2019, 14(10):e0224074)에 따른 재배종 콩 유전자원 71 계통을 이용하였다.

2. 저항성 판별 방법

균주 2457에 대한 각 계통의 저항성 및 감수성을 판별하기 위해 하배축 접종을 이용하였다. 접종 전 10일에 V8 배지에 P. sojae 균주 2457을 치상하고 배지들을 25℃, 암조건에서 항온 배양하였다. 각 계통 당 10~15립의 종자를 상토를 채운 플라스틱 포트(지름 13cm, 높이 10cm)에 파종하고 온실에서 발아시켰다. 파종 7~8일 후 하배축 상단의 중심부를 의료용 칼날을 이용하여 1cm 길이로 세로로 절개한 후, 유묘의 절개부위에 마쇄한 배지를 접종하였다. 배지의 마쇄는 50㎖ 주사기에 2-3회 통과시키는 방법으로 시행한 후 10㎖ 주사기와 18 게이지(G) 굵기의 바늘을 이용하여 하배축 절개 부위 내부 관다발계에 충분한 양의 배지가 닿을 수 있도록 약 0.4㎖ 씩 배지를 충전하였다. 접종 후 식물은 약 16시간 동안 고습처리 후, 생장상(25℃, 낮/밤 14/10시간)에서 배양하였다.

접종 7일 후 유묘의 저항성과 감수성 반응을 관찰하고, 각 계통별로 전체 유묘 개수에 대한 고사 유묘 개수의 비율(%)을 다음과 같이 계산하였다; (고사한 유묘/전체 유묘 개수)×100(%). 고사한 유묘의 비율이 20% 이하면 저항성(resistant), 80% 이상이면 감수성(susceptible), 20% 초과 80% 미만인 경우 중간형(intermediate)으로 각 계통의 표현형을 결정하였다.

이 접종을 통하여 저항성과 감수성을 검정한 결과 대풍에서 거의 모든 식물체가 고사하여 감수성으로 판별되었고, 대원에서 거의 모든 식물체가 생장을 회복하여 저항성으로 판별되었다(도 1).

3. DNA 추출 및 Axiom ^® 180K SoyaSNP arrays

대풍, 대원과 RIL 및 유전자원 각 계통의 어린 식물체로부터 어린잎을 채취하여 CTAB (cetyl trimethyl ammounium bromide) 방법으로 DNA를 추출하였다. RIL DNA 시료에 대해 Axiom^® 180K SoyaSNP array (Affymetrix, USA)를 이용하여 169,028개의 SNP 유전자형 데이터를 얻었다.

4. 연관 마커 분석

RIL 계통에서 SNP 유전자형과 균주 2457에 대한 저항성 간 연관을 검정하기 위해 SNP 유전자형에 대한 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 수행하였다. 전체 169,028개의 SNP 중 모부본간 다형성이 없는 경우와 결손데이터와 이형접합 비율이 높은 경우를 제외한 25,761개의 SNP가 유전분석에 이용되었다. ANOVA에는 통계분석프로그램 R을 이용하였다. 연관마커 분석 결과 염색체 3번에 위치하는 20개의 SNP가 높은 연관이 있는 것으로 탐색되었다(표 1).

5. SNP 분자마커의 설계

대원-대풍 사이의 저항성과 유전적으로 연관이 있는 것으로 탐색된 20개의 SNP 마커 중 저항성 선발을 더욱 용이하게 하기 위해 식물 병 저항성 위치 중 저항성 유전자의 위치와 관련이 있는 SNP를 탐색할 필요가 있었다. Glyma.Wm82.a2.v1 (Grant et al., Nucleic Acids Res 38 (Database issue):D843-846, 2010)을 바탕으로 SNP 마커의 위치가 유전자상에 존재하는 경우를 탐색하였다. 이 중 단백질 패밀리 데이터베이스인 Pfam (http://pfam.xfam.org/) 정보를 바탕으로 했을 때 저항성과 연관이 있는 것으로 여겨지는 3개의 유전자 모델에 위치하는 4개의 SNP 마커를 선발하였다(표 2).

상기의 SNP 마커 위치를 바탕으로 WASP(Web-based Allele Specific Primer design tool, https://bioinfo.biotec.or.th/WASP/)을 이용하여 각 대립유전자형에 특이적인 SNAP 프라이머를 설계하였다. 두 프라이머는 SNP 위치의 대립유전자형을 증폭하는 시퀀스를 3' 말단으로 하고 3' 두번째 시퀀스를 원래의 모델 시퀀스와 다르게 하여 특이성을 높였다. 또한 유사한 온도조건에서 함께 증폭되도록 하였으며 공통으로 작용하는 하나의 상보적인 반대방향 프라이머를 공유한다. 예를 들어 표 3의 프라이머 중 서열번호 4과 서열번호 6에 해당하는 프라이머가 한 PCR 내에서 작용하여 대립유전자형 G 특이적으로 증폭하며 서열번호 5와 서열번호 6에 해당하는 프라이머가 다른 PCR에서 작용하여 대립유전자형 A 특이적으로 증폭한다. 따라서 두 개의 대립유전자를 모두 검정하기 위해서는 3개의 프라이머로 이루어진 2개의 세트가 필요하다. 해당 프라이머 설계 도구에서 AX-90503215 위치를 증폭하는 프라이머는 설계되지 않았다. 설계된 프라이머의 리스트는 표 3과 같다.

실시예 1. SNP 분자마커를 이용한 대풍, 대원 유전형 분석

본 발명에서 설계한 SNAP 프라이머를 이용하여 대풍과 대원에서 대립유전자형에 따른 특이적인 증폭 가능 여부를 분석하였다. PCR 시 annealing 온도를 각각 58℃, 60℃, 62℃로 변경하여 프라이머의 증폭 정도와 특이성 정도를 시험하였다. PCR 반응액은 20ng/㎕의 주형 핵산, 프라이머 0.25μM, dNTP 0.2mM, 1U의 SG-taq plymerase (삼정바이오사이언스, 한국) 및 1X SG-taq buffer 완충액을 포함하는 총 20㎕의 용액이다. PCR 반응은 95℃에서 2분간 유지시킨 후 28 사이클 동안 95℃ 30초, annealing 온도 30초, 72℃ 30초를 반복하였다. PCR 증폭산물 확인은 2% 아가로즈 겔을 이용하였다.

도 2에서 각 Set의 PCR 결과를 보여준다. AX-90360753를 제외한 다른 SNP 마커 위치의 프라이머는 모두 증폭이 되지 않거나 매우 낮은 증폭산물을 생성하였다. 그리고 AX-90360753에서 설계된 프라이머 중에도 Set 1G와 Set 1A의 경우 특이성이 낮거나 증폭의 정도가 낮아 서열번호 7, 8, 9으로 이루어진 조합인 Set 2G와 Set 2A가 균주 저항성 검정 마커로 가장 적합함을 확인하였다.

실시예 2. RIL을 이용한 프라이머 검정 확인

본 발명에서 선발된 Set 2A와 Set 2G SNAP 마커를 이용하여 역병 균주 2457 저항성 검정 및 연관분석에 이용한 대풍과 대원 교배 유래 RIL 집단의 유전형 검정에 이용하였다(도 3). 검정 결과 알려진 RIL의 SNP 위치의 대립유전자형과 SNAP 프라이머를 이용한 검정결과가 완전히 일치하여 SNAP 프라이머가 대립유전자형 특이적으로 증폭됨을 확인하였다.

실시예 3. 재배콩 유전자원을 이용한 유전형 검정 및 저항성 검정

본 발명에서 개발된 SNAP 프라이머를 이용하여 임의의 콩 유전자원의 유전형을 검정하고, 하배축 접종 결과와 비교하여 일치 여부를 확인하였다. 본 발명에서 개발된 프라이머를 유전자원인 신록, 녹원, 연풍, 신팔달 2호, 남풍, 명주나물, CS01964, 광교, 수계#43, SLSB406-2, KLS77170에 적용한 결과, 해당 프라이머는 대립유전자형을 특이적으로 증폭하였다. 이 중 신록, 녹원, 연풍, 신팔달 2호, 남풍, 명주나물이 G 대립유전자형을 가지고 있었으며 CS01964, 광교, 수계#43, SLSB406-2, KLS77170은 A 대립유전자형을 가지는 것으로 판명되었다(도 4 및 표 4).

Set 2A와 Set 2G SNAP 마커를 이용한 11개 유전자원 계통의 대립유전자형 검정 결과와 저항성 판별 결과의 비교

계통명	대립유전자형	하배축 접종을 통한 저항성 판별 결과
신록	G (감수성 대립유전자)	S
녹원	G (감수성 대립유전자)	S
연풍	G (감수성 대립유전자)	S
신팔달 2호	G (감수성 대립유전자)	S
남풍	G (감수성 대립유전자)	S
명주나물	G (감수성 대립유전자)	S
CS 01964	A (저항성 대립유전자)	R
광교	A (저항성 대립유전자)	R
수계 #43	A (저항성 대립유전자)	R
SLSB406-2	A (저항성 대립유전자)	R
KLS77170	A (저항성 대립유전자)	R

또한, 71개 유전자원을 대상으로 상기 표 2에 개시된 균주 2457 저항성 연관 SNP 마커 4개에 대한 SNP array 분석 결과와 하배축 접종을 통한 저항성 검정 결과를 비교하였다. 그 결과, AX-90360753 위치에서 71개 개체 중 50개의 대립유전자형이 G로, 21개의 대립유전자형이 A로 나타났다. 또한, 대립유전자형이 G인 경우 모두 역병균주 2457에 대해 감수성의 반응을 나타내었고, 대립유전자형이 A인 경우 모두 저항성을 나타내었다(표 5 내지 표 7). 반면, AX-90503215, AX-90337768 및 AX-90385376는 SNP array 분석에 따른 유전형 결과와 하배축 접종을 통한 균주 2457에 대한 저항성 표현형 결과가 완전히 일치하지 않는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명에서 개발된 SNAP 마커가 다양한 유전자원에서 역병 균주 2457에 저항성을 가지는 우수 유전자원을 선발하는 데 유용함을 의미한다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Marker composition for discrimination of soybean cultivar resistant or susceptible to Phytophthora sojae and uses thereof <130> PN20387 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4490 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 ttccctcctt tcaccctctc tctctcacac actcactctt tccctttata tctctcactt 60 tactctcctt ttcagaacca caacaagaag aagtggtaga aacaagactt aatccatgtt 120 ttttatactc actttctctt tcaaactctc tggcttctct cagtttctta ttcttaattc 180 tgttccaagt tcttctttta tattctttta gcagcttcta tacaccacaa tcaaaactca 240 aaagcaaatt cttctttttg gttccgagtt ccaagttcca acttcacttc acaatgctta 300 accacaccct caaatcatca aatactgttt tattcacatc aaagcatcga tcttacactc 360 tcaagaaggt ttccatgttt ttcctttacc atgtcacagt atatatagtg tggtcttttg 420 tttctggttt gcttgtgtaa tttcgctgca tgcactttct ccaaactaat aactcttttt 480 tctttactaa aaacactgtg ttgtgtcacc ccacttgaat caatattcaa agcttcttct 540 gctgctcctc tgtgagtgca attatcacca ttcagccttg gaaattctga 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1440 ttctcacaat tggtgatttg ctagttgttg atttgagtga gaacaacctc tctggaccaa 1500 tcccagatgg gattttccag caatgttggt ctctaagagt agtttcattt gccaacaaca 1560 acctcacagg taaggttcct gattctttga gctcatgcta ttcattggca attgtgaact 1620 tttcctctaa ccagctacac ggggaattgc catctggaat gtggttcttg agggggctac 1680 agtcaattga tctttcaaac aactttctgg agggagagat tccagaagga attcagaacc 1740 tgattgattt gagggagttg aggctaggta gtaaccactt cactggtagg gttcctgagc 1800 atattggaga ctgcttgctt ttgaagttgg ttgatttcag tggcaattct ctctctggaa 1860 gacttcctga gtcaatgcaa aagctcacct catgcacatt cctcagcttg caagggaatt 1920 cattcactgg tggcattcca cactggatag gagaaatgaa aagtctagag acattggatt 1980 tttcagcaaa cagattttct ggttggattc caaattctat aggaaatctt gacttgctga 2040 gtaggttgaa tctgtcaagg aatcagatca caggaaacct gccagagtta atggtaaact 2100 gcattaaact tttgactctt gacatcagcc acaatcactt ggcaggccat cttccttcat 2160 ggatatttag gatgggttta caaagtgtct ctctttcagg gaatagcttc agtgagagca 2220 attatccctc acttacttcc attcctgtat cttttcatgg cctccaggtt ttggatttgt 2280 catcaaatgc attttttggt caacttccat ctggagttgg aggtcttagt agcttgcaag 2340 tcttgaattt gtccaccaac aatatctcag ggtctattcc tgtgagtatt ggagaactta 2400 aatctttgtg cattcttgac ttaagtaaca acaagcttaa tggaagcatt ccttccgaag 2460 tagaaggggc aatttcactc agtgaaatga ggctacaaaa gaacttctta ggtgggagaa 2520 ttccaaccca aattgagaag tgttcagaac taacatttct gtaagctcct ctcccatagc 2580 tgacatcttt catgctttat tattataaca taatttggat gaattgtttt gaaaaacctt 2640 ttcctttgtt ctatttcagt tatgaaaatt caaaatatta tgtttaagag tctacaattt 2700 tttctgatta ttttctcttt gtgcatttca ttggaatgtt tcaggaatct ttctcacaac 2760 aagcttatag gttcaatccc ttcagccatt gcaaacctaa ccaatcttca gcatgcagat 2820 ttctcatgga atgagctctc aggaaactta ccaaaggagc tgacaaatct ttccaacctt 2880 ttctcattta atgtttcgta caaccacctc ctaggtgagc taccagtggg tggtttcttc 2940 aatatcatct ctccttcatc tgtctctggt aatccattgt tatgtggttc tgttgttaat 3000 cactcttgcc cttctgttca tccaaagcct attgtcctaa accccaattc ttcttactcc 3060 aactctggct cttccttaca aaaccatcaa cataggatga tgctcagtat ctctgtcatt 3120 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ccagggacat tggatgctcc ccggaggcca tggtgcgtca gagttctggg 720 gtccgcagtt ttccagaggt aaatttagca attgaaaatt ttcccctttt ttagaattac 780 tttttcttgt tttgtgagaa tgttttggtg aaaaattgtc aaggttttaa attgcggtca 840 gggttttgat gcattcctag ataatgataa cgtgggaaat tgtagacaaa tgcacggatg 900 aggccacaat tgcagtcaca gacacttcaa aaaccttagc attgcagcaa aaattgcggt 960 catggactgt attttaaaac cttgaaattt ctttcccgaa tgtaatttaa catgtttttt 1020 tgtttattta tgcttaattg tttgtgctag tataggggac atatctatgg gatgtttgat 1080 gaatttgaca gtggttttga gttgcttttt atgattgtgg agaagagatg gtcctggtgt 1140 aatgaaattg aggtgtggaa tggctgctag caatgaatct gtgaaaaccc tcaaagtgat 1200 tttgttgagg atggttttat ttgtcatgtg taatatggga tttgtaaggg agggggaggg 1260 ttaagaaatg gtgcttgagc atttgtcaat tatgtaggca tgtaacttaa actaaaataa 1320 ttaaaggagg acctatctta tgatagatag cttgtaccag ccttagcatg gacgctgata 1380 ttagcaatgg cagagactgg ttcctttaga agattttttt gtttagcaga aatttccaaa 1440 tcatatattc atatgtacta ctgacattta tcctttatgg tatctgtcgt ttttataaat 1500 tgctttcata atactcaggt 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26 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 catacaggtt ccttcctttg 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctgtcctata actgatctcc ttgcc 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgtcctata actgatctcc ttgct 25 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaaatgtcaa aaaggctgtc 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aaatgtaatt aaaaagtcag gaaag 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aaatgtaatt aaaaagtcag gaaaa 25 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgggagtttt aattctgcat 20 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aatgtaatta aaaagtcagg aaag 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aatgtaatta aaaagtcagg aaaa 24

Claims (5)

1. 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종을 판별하기 위한 마커 조성물.
2. 제1항의 마커 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
4. 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 콩 역병균(Phytophthora sojae)에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 판별방법.

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