KR101736670B1 - 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물 - Google Patents

호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물 Download PDF

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문정환
권영은
김군보
서재환
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 호접란 품종의 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 호접란의 다양한 품종에서 P. KS Little Gem 품종을 식별할 수 있는 프라이머 세트와 이를 포함한 마커용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem의 유전체 분석 및 단일 카피 유전자를 탐색한 후, 종간 단일 카피 유전자 비교를 통해 도출된 COS를 기반으로 제작한 프라이머로서, 이를 이용하여 분석하고자 하는 호접란의 DNA를 증폭한 후 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기를 분석하는 과정을 통해 호접란의 품종을 효과적으로 식별할 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 프라이머 세트를 포함하는 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem 각각의 보존된 이종상동성 유전자(orthologous gene) 염기서열을 규명함으로써, 이를 다양한 호접란 품종 중 P. KS Little Gem 품종을 효과적으로 식별하는 마커용 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물{Primer sets for identification of Phalaenopsis and composition of marker comprising the same}
본 발명은 호접란 품종의 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 호접란의 다양한 품종에서 P. KS Little Gem 품종을 식별할 수 있는 프라이머 세트와 이를 포함한 마커용 조성물에 관한 것이다.
호접란은 세계적으로 인기가 많은 화훼작물로, 주로 꽃의 형태와 색 또는 향기 등의 표현형적 특성으로 품종을 구분한다.
애기장대, 벼, 옥수수, 콩 등에서는 차세대 염기서열 분석 방법을 이용하여 제작된 유전체 서열 정보를 이용하여 유전형이 다른 식물체의 구별에 관한 연구가 잘 되어 있다. 그러나 호접란에서는 유전체 서열에 관한 연구가 초기 단계이기 때문에 품종식별 마커에 관한 연구는 잘 이루어지지 않았다.
현재까지 유전체 염기서열이 완전히 분석된 호접란은 P. equestris 한 종류 뿐이며 이 서열만을 이용하여 품종 구분 마커를 개발하는 것에는 한계가 있다.
호접란은 개화 이전의 영양생장 단계에서 외형만으로 품종 구분이 어려운 경우가 많으며, 종자로부터 개화하기 까지는 3년가량이 소요되기 때문에 표현형적 특성으로 품종을 구분하는 것은 비효율 적인 측면이 있다. 또한, 호접란 품종은 조직배양을 통하여 대량생산되므로 품종을 무단으로 복사하는 등의 행위가 발생할 경우 이를 표현형적 특성만으로 동일 품종 여부를 판단하는 것은 거의 불가능하다.
이에 본 발명자들은 유전체 서열에 관한 연구가 초기 단계에 위치하여 기존 품종식별 마커에 대해 알려져 있지 않던 호접란의 종 및 품종 구분이 가능한 분자표지를 COS를 이용하여 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2012-0001457호
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS001 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS002 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS003 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 목적은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS001 프라이머 세트;
서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS002 프라이머 세트; 및
서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS003 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis 및 P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
삭제
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis 및 P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem을 식별하기 위한 호접란 품종 식별 방법을 제공한다.
삭제
본 발명의 프라이머 세트는 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem의유전체 분석 및 단일 카피 유전자를 탐색한 후, 종간 단일 카피 유전자 비교를 통해 도출된 COS를 기반으로 제작한 프라이머로서, 이를 이용하여 분석하고자 하는 호접란의 DNA를 증폭한 후 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기를 분석하는 과정을 통해 호접란의 품종을 효과적으로 식별할 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 프라이머 세트를 포함하는 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem 각각의 보존된 이종상동성 유전자(orthologous gene) 염기서열을 규명함으로써, 이를 다양한 호접란 품종 중 P. KS Little Gem 품종을 효과적으로 식별하는 마커용 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 KSLG-COS001을 표적으로 하는 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 산물의 서열을 분석한 것이다.
도 2는 KSLG-COS002를 표적으로 하는 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 산물의 서열을 분석한 것이다.
도 3은 KSLG-COS003을 표적으로 하는 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 산물의 서열을 분석한 것이다.
도 4는 각각 KSLG-COS001, KSLG-COS002, KSLG-COS003을 표적으로 하는 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 산물을 아가로오스 겔 상에서 길이다형성을 확인한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 호접란 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 호접란 품종을 식별하기 위한 분자표지를 개발하기 위해, 먼저 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem의 유전체 분석 및 COS (conserved ortholog set) 유전자를 탐색하였으며, COS 중 공통된 부분을 찾아 본 발명의 호접란 품종 식별을 위한 범용 프라이머 세트를 디자인하였다.
자세하게는, 본 발명자들은 바나나와 벼의 single copy gene를 상호 BLASTP 분석하여 발견한 단자엽 식물의 총 1,003 개의 COS 후보 유전자를 1차 선별하였으며, 다시 P. equestris의 single copy gene을 상호 BLASTP 분석하여 672 개의 COS 유전자를 발견한 뒤 각 종의 유전자 구조 정보를 이용하여 엑손 개수가 2개 이상인 것들로 이루어진 단자엽 COS 유전자 593 개를 선별하여, 모든 시험된 식물에서 다형성이 존재하여 호접란 품종을 효과적으로 구분할 수 있는 COS 유전자를 최종적으로 선별하였다.
본 발명에서 용어, COS(conserved ortholog set)는 공통 조상으로부터 분화하여 유래된 종들(species)에서 그 유전적 서열 및 기능이 보존된 상동유전자들 중, 단일 카피(copy) 혹은 low copy를 갖는 유전자들을 목록화한 개념으로, 최근에 그 개념이 제시되어 분자표지를 개발할 수 있는 기반이 되고 있다.
본 발명에서는 최종 선별된 COS 유전자를 'KSLG-COS001', 'KSLG-COS002' 또는 'KSLG-COS003'로 명명하였다. 또한, KSLG-COS001이 벼에서 LOC_Os03g51984.1, 바나나에서 gi|695015805|ref|XP_009394790.1|, P. equestris에서 PEQU_32041, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold10803의 38688 bp부터 57836 bp, scaffold67295의 29457 bp부터 57414 bp 임을 규명하였고, KSLG-COS002는 벼에서 LOC_Os04g08330.1, 바나나에서 gi|695079866|ref|XP_009387363.1|, P. equestris에서 PEQU_00818, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold146702의 813 bp부터 7281 bp, scaffold150811의 6289 bp부터 10762 bp, C20025078의 112 bp부터 4531 bp 임을 규명하였으며, KSLG-COS003이 벼에서 LOC_Os01g49680.1, 바나나에서 gi|695077552|ref|XP_009386121.1|, P. equestris에서 PEQU_36864, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold15381의 4867 bp부터 44099 bp, scaffold22243의 4203 bp부터 38474 bp 임을 최초로 규명하였다.
따라서, 상기 KSLG-COS001, KSLG-COS002 또는 KSLG-COS003 서열을 기초로 호접란 품종을 식별하기 위한 범용 프라이머 세트를 디자인하였다.
본 발명에 있어서, 호접란 품종은 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu - cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 가장 바람직하게는 다양한 호접란 품종에서 P. KS Little Gem를 식별하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머 세트"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 DNA 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 바나나, 벼, P. equestris, P. KS Little Gem에서 유래되는 유전자로서, 그 유전적 서열 및 기능이 보존된 이종상동성 유전자(conserved orthologous gene)를 증폭할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다.
본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 가지는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 가지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 가지는 프라이머 세트를 사용하였다.
상기 서열번호 1의 프라이머는 편의상 KSLG-COS001-F로 표시하며, 상기 서열번호 2의 프라이머는 편의상 KSLG-COS001-R로 표시한다. 서열번호 3의 프라이머는 편의상 KSLG-COS002-F로 표시하며, 상기 서열번호 4의 프라이머는 편의상 KSLG-COS002-R로 표시한다. 서열번호 5의 프라이머는 편의상 KSLG-COS003-F로 표시하며, 상기 서열번호 6의 프라이머는 편의상 KSLG-COS003-R로 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 호접란 품종 식별 방법을 제공한다.
상기에서 시료는 호접란의 어느 부분이라도 가능한데, 예를 들면, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등이 있다.
상기에서 게놈 DNA 증폭은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplificatoin), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 통상적인 조건을 취할 수 있으며, 본 발명의 일구체예에서는, 초기 변성(pre-denaturation)을 95℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃에서 5분)을 실시하는 조건을 취할 수 있다. 또한, 이러한 PCR 방법은 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 상기에서, 증폭된 산물을 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기의 증폭된 산물 검출은 겔 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기(size) 분석을 통해 이루어질 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
바나나, 벼, P. equestris , P. KS Little Gem 에서의 COS 유전자 탐색
<1-1> 바나나, 벼, P. equestris 의 single copy gene 탐색
바나나와 벼, P. equestris의 단백질 서열을 데이터베이스로부터 내려받은 후 각 서열을 self BLASTP 분석을 수행하여 single copy gene을 발견하였다. 이 때 E-value는 1e-10 이상, query coverage는 50 이상인 것으로 한정하였다. 벼의 single copy gene은 13,877 개, 바나나는 2,712 개, P. equestris는 10,610 개로 나타났다.
<1-2> 종간 single copy gene의 상호 비교를 통한 단자엽 식물의 COS 발견
먼저 바나나와 벼의 single copy gene를 상호 BLASTP 분석하여 발견한 단자엽 식물의 COS 1,003 개에 다시 P. equestris의 single copy gene을 상호 BLASTP 분석하여 672 개의 COS 유전자를 발견한 뒤 각 종의 유전자 구조 정보를 이용하여 엑손 개수가 2개 이상인 것들로 이루어진 단자엽 COS 유전자 593 개를 선별하였다.
<1-3> P. KS Little Gem과의 비교를 통한 COS 유전자 선별
선별한 COS 유전자 593개에 대한 P. equestris 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추출한 후 각 유전자 서열에 P. KS Little Gem의 전사체 서열과 P. equestris의 cds 서열을 이용해 spidey 분석을 수행하였다.
그 후 인트론 부위를 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하고 이 프라이머 세트를 이용해 P. equestris와 P. KS Little Gem 유전체 서열에서 insilico PCR 을 수행하여 증폭 산물의 길이 차이가 날 것으로 예상되는 프라이머 세트를 선별하였다.
총 45 개의 프라이머 세트를 사용해 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien 세 품종에서 PCR을 수행하여 길이 차이를 아가로스 겔 상에서 분석한 후 효과적으로 길이 차이를 구분할 수 있는 COS 유전자를 최종적으로 선별하였다.
본 발명에서는 최종 선별된 COS 유전자를 'KSLG-COS001', 'KSLG-COS002', 'KSLG-COS003'로 명명하였다.
또한, KSLG-COS001이 벼에서 LOC_Os03g51984.1, 바나나에서 gi|695015805|ref|XP_009394790.1|, P. equestris에서 PEQU_32041, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold10803의 38688 bp부터 57836 bp, scaffold67295의 29457 bp부터 57414 bp 임을 규명하였고, KSLG-COS002는 벼에서 LOC_Os04g08330.1, 바나나에서 gi|695079866|ref|XP_009387363.1|, P. equestris에서 PEQU_00818, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold146702의 813 bp부터 7281 bp, scaffold150811의 6289 bp부터 10762 bp, C20025078의 112 bp부터 4531 bp 임을 규명하였으며, KSLG-COS003이 벼에서 LOC_Os01g49680.1, 바나나에서 gi|695077552|ref|XP_009386121.1|, P. equestris에서 PEQU_36864, P. KS Little Gem 유전체 내에서는 scaffold15381의 4867 bp부터 44099 bp, scaffold22243의 4203 bp부터 38474 bp 임을 규명하였다.
나아가, 상기 3개 유전자에 대한 P. equestris의 단백질 서열을 Blast2GO 프로그램으로 그 기능을 분석한 결과 KSLG-COS001은 rRNA 소단위체를 메틸화하는 효소를 생산하는 유전자로 예측되었으며, KSLG-COS002는 아직 밝혀지지 않은 단백질을 생산하는 유전자로 세포막으로 둘러싸인 소포에서 포스파티딜이노시톨을 생산하거나 광주기성 또는 개화에 관련된 기능을 하는 것으로 예측되었고, KSLG-COS003은 DNA 수선 헬리카아제 xpb1 효소를 생산하는 유전자로 예측되었다.
< 실시예 2>
호접란 품종 식별용 프라이머 세트 제작 방법
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 발견한 'KSLG-COS001', 'KSLG-COS002', 'KSLG-COS003' 유전자 중 공통되는 서열을 기초로 호접란 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(하기 표 1 참조).
자세하게는, COS 중 공통되는 부분을 찾기 위해 Spidey 프로그램을 이용한 alignment를 실시하였다. 이후, 정렬된 유전자의 엑손 부위에서 프라이머를 제작하였다.
Figure 112016054386894-pat00001
< 실시예 3>
호접란의 게놈 DNA 분리 및 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR 다형성 분석
본 발명에서 제작한 프라이머 세트를 실제 품종에 적용해 보기 위해 샘플 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, D. pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu - cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis 에서 DNA를 추출하였다.
DNA 추출은 CTAB 완충용액을 이용한 방식으로 추출하였다. 이후 추출한 DNA를 주형으로, 프라이머 세트(상기 표 1 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 98 ℃에서 3 분간 pre-denature 한 뒤, 98 ℃ 30 초, 65 ℃ 1분, 72 ℃ 1 분 조건을 40회 반복한 다음, 마지막으로 72 ℃ 에서 5 분간 최종 신장(post-elongation)을 수행하였다. 반응 산물을 0.5X TBE 완충용액과 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 분석하였다.
< 실시예 4>
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 P. KS Little Gem 외 다양한 호접란 18개 종 및 품종에서의 다형성 분석
본 발명의 프라이머 세트의 유용성을 알아보기 위하여 P. KS Little Gem 외 호접란 P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis 의 총 19 종에서 KSLG-COS001, KSLG-COS002, KSLG-COS003을 이용한 PCR을 수행하였다. 자세하게는 상기 19 종류의 서로 다른 품종에서 각각의 조직을 채취한 후 CTAB 완충용액을 사용하여 DNA를 추출하였다. 이후 추출한 DNA를 주형으로, 프라이머 세트(상기 표 1 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 98 ℃에서 3 분간 pre-denature 한 뒤, 98 ℃ 30 초, 65 ℃ 1 분, 72 ℃ 1 분 조건을 40회 반복한 다음, 마지막으로 72 ℃ 에서 5 분간 최종 신장(post-elongation)을 수행하였다. 반응 산물을 0.5X TBE 완충용액과 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 분석하였다.
그 결과, 도 1 에서 나타낸 바와 같이, P. KS Little Gem의 증폭 산물의 크기가 다른 호접란 시료와는 차이를 나타내어 P. KS Little Gem을 식별하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.
또한 반응 산물을 시퀀싱(sequencing)하여 ClustalW를 통하여 뉴클레오티드 서열을 비교한 결과, 다양한 호접란들(01LG, P. KS Little Gem; 02EQ, P. equestris; 03SV, P. Sogo Vivien; 04DP, Doritis pulcherrima; 05JA, P. javanica; 06BE, P. bellina; 07FU, P. fuscata; 08PH, P. philippinensis; 09CO, P. cornu - cervi; 10SU, P. sumatrana; 11HI, P. hieroglyphica; 12PU, P. pulchra; 13MA, P. mannii; 14SC, P. schilleriana; 15MO, P. modesta; 16SA, P. sanderana; 17PA, P. pantherina; 18SP, P. speciosa var. tetraspis; 19AM, P. amabilis)사이에서 P. KS Little Gem의 서열이 유사함을 확인할 수 있었다(도 2 내지 4 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer sets for identification of Phalaenopsis and composition of marker comprising the same <130> PN1605-183 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS001 forward sequence <400> 1 gtatcttatc catatcaagt gcggc 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS001 reverse sequence <400> 2 tccaccatca gcttcacttc ct 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS002 forward sequence <400> 3 gggttattag ccttcgcagc tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS002 reverse sequence <400> 4 ctgaggtggc agaggctttg at 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS003 forward sequence <400> 5 gacagcaatt tttgattgat caggg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-COS003 reverse sequence <400> 6 ggtcaagttg gtcattcagc tgata 25

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS001 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS002 프라이머 세트; 및
    서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-COS003 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis 및 P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem을 식별하기 위한 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별용 마커 조성물.
  4. 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis 및 P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem을 식별하기 위한 호접란 품종 식별 방법.
  5. 삭제
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