CN104004829A - 兰科植物授粉成功与否的鉴定方法 - Google Patents

兰科植物授粉成功与否的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA；双酶切和连接；预扩增和选择性扩增；聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；获得授粉后差异甲基化差异片段；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；将获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。

Description

兰科植物授粉成功与否的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法。
背景技术
兰科植物发育的一个独特特点是子房发育时间较长，且只有在授粉后才启动发育，形成种子非常细小。
不同于大多数被子植物，兰花在授粉后子房才开始发育，发育间期较长，一般情况下，对于兰科植物授粉成功与否没有适宜简便的方法判断。兰科植物如果未真正受精(授粉未成功)，子房也会膨大，因此只能等待最后结果(子房凋谢或继续生长),这样增加了鉴别受精与否、种子合成成功与否的时间，不仅增加了培育成本，而且会影响其他枝条上花的授粉。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，包括下述步骤：
(1)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板；
(2)双酶切和连接：用识别四碱基的Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR Ⅰ组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接；
(3)预扩增和选择性扩增：将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增；
(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；
(5)获得授粉后差异甲基化差异片段：比较授粉前后EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后植株中有带而未授粉子房中无甲基化差异带的情形；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；
(6)将步骤(5)获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；
(7)选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。
所述兰科植物为大花蕙兰。
步骤(2)中，第一个酶切反应体系的组成为：5×RT buffer2μL，步骤(1)得到的模板DNA1μL，EcoR I0.2μL，Hpa Ⅱ0.2μL，三蒸水6.6μL；酶切反应条件为在37℃保温20h；第二个酶切反应体系的组成为：5×RTbuffer2μL，步骤(1)得到的模板DNA1μL，EcoR I0.2μL，Msp I0.2μL，三蒸水6.6μL；酶切反应条件为在37℃保温20h。
连接的接头包括与EcoRⅠ酶切位点互补的人工接头即E接头和与HpaⅡ/PMspⅠ酶切位点互补的人工接头即H/M接头，所述E接头的引物序列分别为：GACGATGAGTCTAGAA和CGTTCTAGACTCATC，所述H/M接头的引物序列分别为：CTCGTAGACTGCGTACC和AATTGGTACGCAGTC；
所述连接体系的组成为：两个所述酶切反应体系的酶切混合液10μL，5×RT buffer4μL，浓度为5pmol的E接头1μL，浓度为5pmol的H/M接头1μL，浓度为5mmol/L的ATP0.8μL，浓度为350U/μL的T4DNA连接酶0.1μL，灭菌三蒸水3.1μL；连接条件为：16℃保温过夜；连接完成后，65℃保温10min。
所述预扩增引物序列为：GACTGCGTACCAATTC(E00)和GATGAGTCTAGAACGG(H/M00)；
所述预扩增的体系为：体系总体积为25μL，其中，10×PCR buffer2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP0.5μL，浓度为25μmol/L E000.5μL，浓度为25μmol/L H/M000.5μL，步骤(2)所得DNA连接产物1μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL，余量为灭菌三蒸水；反应条件为：94℃ 30ｓ，56℃ 1min，72℃min，21cycles；
72℃延伸10min。
所述选择扩增的引物序列为：
所述选择扩增的体系为：体系总体积为25μL，其中，10×PCR buffer2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP0.5μL，浓度为25μmol/L E000.5μL，浓度为25μmol/L H/M000.5μL，步骤(2)所得DNA连接产物1μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL，余量为灭菌三蒸水；选择扩增的条件为降式PCR扩增，即：
94℃ 30ｓ，65℃～56℃，降0.7℃/cycle，30s，72℃ 1min，13cycles；
94℃ 30ｓ，56℃ 30s，72℃ 1min，23cycles；
72℃ 10min；
4℃保存。
选择扩增完成后，在扩增产物中加入20μL变性胶加样缓冲液，95℃变性5min后立刻转移到冰上冷却。然后，取5μL变性产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳以检测扩增产物。30W恒功率电泳，直至二甲苯青到达胶板的三分之二处；然后进行银染。
所述提取大花蕙兰被测植株授粉前后各时期的基因组DNA的方法如下：
A、取0.1g大花蕙兰子房于液氮中迅速研成细粉，迅速转入2mL离心管，加入0.8mL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀后，65℃水浴保温30min。
B、冷却至室温，加入1/8体积的Tris饱和酚，65℃水浴15min，离心(4℃，10000r/min，15min)。取上清液，加入等体积的氯仿，缓慢颠倒混匀，65℃水浴15min后离心(4℃，10000r/min，15min)。
C、取上清液，加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后，于-20℃静置30min以上。取出离心(4℃，10000r/min，10min)，所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，转移至1.5mL离心管中，室温晾干。
D、晾干后，溶入0.6mL高盐TE缓冲液，用等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提1次，离心。取上清液，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)混匀，再加入0.7倍体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀1h以上，离心，弃上清液，收集沉淀。
E所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，自然风干后溶于0.1mL TE缓冲液中。充分溶解后，加入1μL RNaseA，37℃水浴1h，得到DNA样本，-20℃保存备用。
所述5×RT buffer的配方如下：0.05mol/L Tris Hcl(PH7.5)，0.05mol/LMg(CH3COO)2乙酸镁，0.25mol/L KCH3COO，0.01％BSA，最终调PH值为7.6。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的方法利用获得的甲基化差异片断来作为分子标记，从而可以作为检测其他大花蕙兰乃至其他兰科植物授粉成功与否的标志，不需要等待所授粉的兰花子房长时间发育完全，有利于较早的了解植物授粉成功与否，确定兰科植物普遍授粉时间，从而保证兰科植物有效授粉的几率大大增加，可以广泛运用于兰科植物自花授粉，异花授粉，乃至不同兰花之间的授粉过程的鉴定中，继而为控制有性生殖过程提供理论依据，有利于创造出更适合于人类要求的兰花新品种。
2、本发明的方法能够较早的了解植物授粉成功与否，降低了培育成本。
具体实施方式
以下以大花蕙兰为实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
(1)提取大花蕙兰子房授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板：
大花蕙兰由市场购入粉红花品种“Great Flower Marie Laurencin”,在开花15～20天后,进行人工授粉,并于授粉后2,4,8,16,24天同时取未授粉及授粉子房迅速冻于液氮中备用。
在植物基因组DNA提取过程中，容易受酚类、多糖类、色素类这些物质的干扰。酚类杂质存在，氧化后会络合DNA分子，产生褐色杂质；多糖类杂质会粘连DNA分子，形成胶状复合物，导致DNA难以溶解。这些杂质存在于DNA样本中，会使限制性内切酶类和Taq聚合酶的活性受到抑制，导致后续酶切、连接、PCR等操作失败。大花蕙兰花中DNA的含量小于叶片、茎部、根部等其它器官，且子房中酚类、多糖类物质含量较高，所以在花子房中提取出高质量的DNA样本有一定的难度。
因此采用优化的CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷基三乙基溴化铵)方法,同时提取大花蕙兰未授粉和授粉2,4,8,16,24天后子房DNA，精确测定浓度并稀释至400ng/μL，作为后续反应模板，并在-20℃保存待用。
具体操作步骤如下：
A、取0.1g大花蕙兰子房于液氮中迅速研成细粉，迅速转入2mL离心管，加入0.8mL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀后，65℃水浴保温30min。
B、冷却至室温，加入1/8体积的Tris饱和酚，65℃水浴15min，离心(4℃，10000r/min，15min)。取上清液，加入等体积的氯仿，缓慢颠倒混匀，65℃水浴15min后离心(4℃，10000r/min，15min)。
C、取上清液，加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后，于-20℃静置30min以上。取出离心(4℃，10000r/min，10min)，所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，转移至1.5mL离心管中，室温晾干。
D、晾干后，溶入0.6mL高盐TE缓冲液，用等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提1次，离心。取上清液，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)混匀，再加入0.7倍体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀1h以上，离心，弃上清液，收集沉淀。
E所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，自然风干后溶于0.1mL TE缓冲液中。充分溶解后，加入1μL RNaseA，37℃水浴1h，得到DNA样本，-20℃保存备用。
在上述优化的CTAB法中，加入的Tris-饱和酚不仅更好地去除了DNA样本中杂质蛋白的影响，而且去除了酚类杂质，消除了DNA的褐变反应；提取过程中使用了高盐TE溶液溶解DNA样本，起到去除多糖类杂质的作用，最大地降低了DNA样本的受污染程度，相对于其它几种方法，简化了步骤，缩短了操作时间，最大程度保护了DNA的完整性，节约了实验成本，最终获得了高浓度、低污染、完整性好的DNA样本，完全符合分子生物学实验的要求。
(2)双酶切反应和连接：用识别四碱基的Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoRⅠ组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接。
建立酶切反应体系10μL，其具体组成如表1所示。
表1
试剂 第一个酶切反应体系 第二个酶切反应体系
5×RT buffer 2μL 2μL
模板DNA(400ng/μL) 1μL 1μL
EcoR I(10-15U/μL) 0.2μL 0.2μL
Hpa Ⅱ(15U/μL) 0.2μL /
Msp I(15U/μL) / 0.2μL
三蒸水 6.6μL 6.6μL
总体积 10μL 10μL
第一个酶切反应体系和第二个酶切反应体系分别在37℃保温20h。
连接反应体系为20μL，其具体组成如表2所示。连接所用接头及引物序列如表4所示。
表2
试剂 连接反应体系
酶切混合液 10μL
5×RT buffer 4μL
E接头(5pmol) 1μL
H/M接头(50pmol) 1μL
ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)(10mmol/L) 0.8μL
T4DNA连接酶(350U/μL) 0.1μL
灭菌三蒸水 3.1μL
总体积 20μL
连接体系于16℃保温过夜；连接完成后，65℃保温10min；连接产物于-20℃保存。
表1和表2中5×RT buffer的配方如下：0.05mol/L Tris Hcl(PH7.5)，0.05mol/L Mg(CH3COO)2乙酸镁，0.25mol/L KCH3COO，0.01％BSA，最终调PH值为7.6。
(3)将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增：预扩增反应体系25μL，其组成如表3所示。预扩增引物如表4所示。
表3
试剂 预扩增反应体系
10×PCR buffer 2.5μL
dNTP(10mmol/L) 0.5μL
E00(25μmol/L) 0.5μL
H/M00(25μmol/L) 0.5μL
DNA连接产物 1μL
Taq酶(5U/μL) 0.1μL
灭菌三蒸水 补至25μL
反应条件为：
94℃ 30ｓ，56℃ 1min，72℃ min，21cycles；
72℃延伸10min。
预扩增效果检测：
扩增完成后，取5μL产物，1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
然后取5μL预扩增产物稀释20倍，供选择扩增用。
其余预扩增产物于-20℃保存。
表4接头和引物序列
选择扩增体系成分与预扩增反应体系相同。引物换为选择扩增引物，选择扩增引物序列如表4所示。
选择扩增条件为降式PCR扩增：
94℃ 30ｓ，65℃～56℃(降0.7℃/cycle)30s，72℃ 1min，13cycles；
94℃ 30ｓ，56℃ 30s，72℃ 1min，23cycles；
72℃ 10min；
4℃保存。
(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带。
选择扩增完成后，在选择扩增产物中加入20μL变性胶加样缓冲液(100％甲酰胺，10m mol/L EDTA，0.1％溴酚蓝，0.1％二甲苯青)，95℃变性5min后立刻转移到冰上冷却。然后，取5μL变性产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳以检测扩增产物。30W恒功率电泳，直至二甲苯青到达胶板的三分之二处；然后进行银染，银染后观察。
(5)获得授粉后差异甲基化差异片段，甲基化差异片段的回收、克隆及测序：比较授粉前后EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后植株中有带而未授粉子房中无甲基化差异带的情形。
用一次性手术刀片从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段。具体参照赛百胜公司的硅胶膜型PCR产物纯化试剂盒说明进行回收。
使用上海生工的pUCm-T载体-PCR产物克隆试剂盒进行克隆，参照操作说明进行。
①连接
a、连接体系如表5所示。
表5
试剂 体积
10×连接缓冲液 1μL
PEG4000 1μL
pUCm-T载体(50ng/μL) 1μL
步骤(5)纯化产物(250ng/μL) 5μL
T4-DNA ligase 1μL
无菌水 1μL
总体积 10μL
b、连接条件：混匀，16℃连接过夜。
②制备感受态
Mg2+法制备感受态细菌
a、取20μL冻存的E.coli DH5α接种到5mL LB液体培养基；
b、37℃振荡培养过夜；
c、取1mL过夜培养的DH5α接种于30mL LB液体培养基；
d、37℃振荡培养2h；
e、取1mL培养物至微量离心管中，4℃高速离心(10000g)30s；
f、弃上清后，沉淀轻轻地悬浮于50μL LB培养基中，冰浴5min；
g、加入50μL2×TSS(transformation and storage solution)，轻轻晃匀；
h、冰浴5min，即制备完成感受态细菌。
③转化
a、加入5μL(50～100ng)连接产物，轻轻晃匀；
连接产物：正对照用用于连接产物的质粒，即pUCm-T载体；负对照用水；实验组用纯化产物(即上面(5)中纯化后的产物)。
b、冰浴45min(5～60min)；
c、42℃热冲击90s；
d、冰浴5min；
3、在超净台上加入0.8mL LB培养基；
f、37℃轻轻振荡培养45min，使DH5α复苏；
g、取200μL菌液/平皿，涂布于选择型LB固体培养基(含X-gal50μg/mL，IPTG50μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL)；
h、静置30～60min，使菌液充分吸收；
i、37℃倒置培养过夜。
④重组克隆的PCR方法筛选和鉴定
a、随机挑取白色重组菌落划线于LB固体培养基，37℃倒置培养过夜；
b、刮取少量菌体加25μL灭菌双蒸水，煮沸5min；
c、8000rpm离心5min；
d、取2μL上清液作为模板，25μL体系进行PCR扩增；
e、准备PCR Mix，其组成如表6所示，振荡混匀，短暂离心；
表6
试剂 体积
10×PCR buffer 2.5μL
dNTP Mix(10mmol/L) 0.5μL
引物1(25μmol/L) 0.5μL
引物2(25μmol/L) 0.5μL
Taq聚合酶(5U/μL) 0.1μL
补水至 24μL
引物1和引物2为步骤(5)中获得授粉后差异甲基化差异片段的一对引物，引物1和引物2分别来自表4中的选择扩增引物。
f、取24μL表6的PCR Mix分装到含模板1μL的管中；
g、PCR反应条件：
94℃ 3min；
94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min；30cycles
72℃ 10min；
4℃∞；
h、1.5％琼脂糖电泳检测插入片段的大小，得到阳性克隆。
阳性克隆交由上海生工生物公司测序。
(6)利用授粉后差异甲基化差异片段鉴定大花蕙兰是否授粉成功：
测序结果登陆美国国家生物技术信息中心NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，用BLAST进行相似性分析比较，并进行其它的生物信息学分析。数据库分析甲基化差异片段，选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记。
(7)Southern杂交确定子房启动发育确切时间，证明被测植株授粉成功。
将甲基化差异片段测序后的序列标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交。若杂交结果成阳性，说明被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间。若杂交结果成阴性，确定被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。
Southern杂交(碱转)
基因组DNA的限制性酶切
平均每微克DNA加入限制性内切酶EcoRⅠ10～15U，37℃水浴过夜，取1～2μL酶解液，微电泳检测酶切效率。酶切完全后，转入70℃灭活15min。在灭活后的酶切体系中，直接加入两倍体积的无水乙醇，-20℃中放置2h以上。12000rpm离心15min收集沉淀，75％乙醇轻轻的洗两遍。待沉淀风干后，用灭菌双蒸水溶液回溶。琼脂糖凝胶电泳检测。
印迹转膜
①、仔细将电泳槽、配胶槽全部洗干净，更换新的0.5×TBE电泳液，配制0.8％琼脂糖凝胶，不含溴化乙锭(EB)以降低杂交背景；
②、将DNA样品小心加入样品孔中，每孔10μg总体DNA，其中一个加入DNA分子量标准物；
③、电压降为2～3V/cm电泳，至电泳指示剂离开加样孔约2.5～3cm时停止电泳；
④、切去凝胶一角，于0.25mol/L HCl中8min(溴酚兰由蓝转黄，<10min)，无离子水清洗一遍；于变性液(0.4mol/L NaOH)中，室温轻晃2×20min；
⑤、做好盐桥，排净气泡。尼龙膜于去离子水中完全浸湿。浸泡于转移液(0.4mol/L NaOH，1mol/L NaCl)中5min以上；
⑥、将凝胶倒置于盐桥平台，排净气泡，在凝胶四周用Parafilm封好，防止转移时短路；
⑦、把尼龙膜剪去一小角，相应平铺在凝胶上，赶净胶与膜之间的气泡。将两张预先用转移液湿润过的滤纸(大小与膜相同)，盖在尼龙膜上，排净气泡。再在上面放一叠普通吸水纸(5～8cm厚)，顶部放一玻璃板，压上重物(200g砝码)。静置转移8～24h，其间换纸3～4次；
⑧、将凝胶和尼龙膜置于一张干燥的滤纸上，用软铅笔标明加样孔位置；
⑨、于中和液(0.5mol/L Tris-Cl(pH值7.5)，1.5mol/L NaCl)中室温下轻晃15min，去离子水短暂漂洗；
⑩、将膜放在两张滤纸之间，在烘箱内于80℃烘烤2h。4℃备用。
探针标记
PCR法直接标记
PCR反应体系为25μL具体组成如表7所示。
表7
试剂 体积
10×PCR buffer 2.5μL
dNTP Mix(10mmol/L) 0.5μL
DIG-11-dUTP(50μmol/L) 0.1μL
引物1(25μmol/L) 0.5μL
引物2(25μmol/L) 0.5μL
DNA模板 100ng
Taq聚合酶(5U/μL) 0.1μL
补水至 25μL
引物1和引物2同表6。
杂交
①、将固定好DNA的尼龙膜置于杂交袋中，加预杂交液(0.2mL/cm2膜)，42℃晃动预杂交6h。预杂交液的组成如下：
②、探针煮沸变性5min，快速于冰上。1∶1000稀释于预温的预杂交液中(20ng/mL)，42℃杂交，16h。
杂交后洗膜
①、2×SSC，0.1％SDS，在室温下浸洗2×5min(100mL:10mL20×SSC；1mL10％SDS)；
②、0.5×SSC，0.1％SDS(预热)，65℃振荡漂洗2×15min(100mL:2.5mL20×SSC；1mL10％SDS)。
检测
①、用冲洗缓冲液(1000mL马来酸缓冲液中加入3mL Tween20)，摇晃洗膜2min，室温；
②、将尼龙膜放入干净塑料袋中，加10×封闭液200μL，马来酸缓冲液1800μL，混匀，37℃30min；
③、弃去封闭液，以1∶5000稀释抗体AP(75mU/mL)于1×封阻缓冲液中，轻轻混匀，37℃50min；
④、将尼龙膜从袋中取出，冲洗缓冲液漂洗，2×15min；
⑤、在检测缓冲液(Tris6.055g，NaCl(5mol/L)15mL，NaOH调pH至9.5，加蒸馏水定容至500mL)洗膜中平衡2～5min；
⑥、在尼龙膜上滴加CSPD ready-to-use(Roche)，约20μL/cm2。将膜封于透明袋中，避光37℃，30min；
⑦、在暗室中，将X-ray胶片置于杂交膜上，曝光1min～2h；
⑧、冲洗胶片；
显－72原液1∶1ddH2O稀释，显影5～10min；ddH2O漂洗；F－5定影10～20min；水洗,晾干。
将上述步骤重复3次，如果照片显示有杂交带即证明是阳性，说明被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，如果没有杂交带即是阴性，说明被测植株授粉未成功。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板；
(2)双酶切和连接：用识别四碱基的Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR Ⅰ组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接；
(3)预扩增和选择性扩增：将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增；
(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；
(5)获得授粉后差异甲基化差异片段：比较授粉前后EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后植株中有带而未授粉子房中无甲基化差异带的情形；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；
(6)将步骤(5)获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；
(7)选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。
2.根据权利要求1所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述兰科植物为大花蕙兰。
3.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，第一个酶切反应体系的组成为：5×RT buffer2μL，步骤(1)得到的模板DNA1μL，EcoR I0.2μL，Hpa Ⅱ0.2μL，三蒸水6.6μL；酶切反应条件为在37℃保温20h；第二个酶切反应体系的组成为：5×RTbuffer2μL，步骤(1)得到的模板DNA1μL，EcoR I0.2μL，Msp I0.2μL，三蒸水6.6μL；酶切反应条件为在37℃保温20h。
4.根据权利要求3所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，连接的接头包括与EcoR Ⅰ酶切位点互补的人工接头即E接头和与Hpa Ⅱ/PMsp Ⅰ酶切位点互补的人工接头即H/M接头，所述E接头的引物序列分别为：GACGATGAGTCTAGAA和CGTTCTAGACTCATC，所述H/M接头的引物序列分别为：CTCGTAGACTGCGTACC和AATTGGTACGCAGTC；
所述连接体系的组成为：两个所述酶切反应体系的酶切混合液10μL，5×RT buffer4μL，浓度为5pmol的E接头1μL，浓度为5pmol的H/M接头1μL，浓度为5mmol/L的ATP0.8μL，浓度为350U/μL的T4DNA连接酶0.1μL，灭菌三蒸水3.1μL；连接条件为：16℃保温过夜；连接完成后，65℃保温10min。
5.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述预扩增引物序列为：GACTGCGTACCAATTC(E00)和GATGAGTCTAGAACGG(H/M00)；
所述预扩增的体系为：体系总体积为25μL，其中，10×PCR buffer2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP0.5μL，浓度为25μmol/L E000.5μL，浓度为25μmol/L H/M000.5μL，步骤(2)所得DNA连接产物1μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL，余量为灭菌三蒸水；反应条件为：94℃30ｓ，56℃1min，72℃min，21cycles；
72℃延伸10min。
6.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述选择扩增的引物序列为：
所述选择扩增的体系为：体系总体积为25μL，其中，10×PCR buffer2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP0.5μL，浓度为25μmol/L E000.5μL，浓度为25μmol/L H/M000.5μL，步骤(2)所得DNA连接产物1μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL，余量为灭菌三蒸水；选择扩增的条件为降式PCR扩增，即：
94℃ 30ｓ，65℃～56℃，降0.7℃/cycle，30s，72℃ 1min，13cycles；
94℃ 30ｓ，56℃ 30s，72℃ 1min，23cycles；
72℃ 10min；
4℃保存。
7.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，选择扩增完成后，在扩增产物中加入20μL变性胶加样缓冲液，95℃变性5min后立刻转移到冰上冷却；然后，取5μL变性产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳以检测扩增产物；30W恒功率电泳，直至二甲苯青到达胶板的三分之二处；然后进行银染。
8.根据权利要求2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述提取大花蕙兰被测植株授粉前后各时期的基因组DNA的方法如下：
A、取0.1g大花蕙兰子房于液氮中迅速研成细粉，迅速转入2mL离心管，加入0.8mL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀后，65℃水浴保温30min；
B、冷却至室温，加入1/8体积的Tris饱和酚，65℃水浴15后min，于4℃、10000r/min条件下离心15min；取上清液，加入等体积的氯仿，缓慢颠倒混匀，65℃水浴15min后，于4℃、10000r/min条件下离心15min；
C、取上清液，加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后，于-20℃静置30min；取出，于4℃、10000r/min条件下离心10min，所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，转移至1.5mL离心管中，室温晾干；
D、晾干后，溶入0.6mL高盐TE缓冲液，用等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提1次，离心；取上清液，加入1/10体积的pH值为5.2的3M乙酸钠混匀，再加入0.7倍体积的-20℃预冷的异丙醇沉淀1h，离心，弃上清液，收集沉淀；
E、所得沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗2次，自然风干后溶于0.1mL TE缓冲液中；充分溶解后，加入1μL RNaseA，37℃水浴1h，得到DNA样本，-20℃保存备用。
9.根据权利要求4所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述5×RT buffer的配方如下：PH值为7.50.05mol/L Tris Hcl，0.05mol/LMg(CH3COO)2乙酸镁，0.25mol/L KCH3COO，0.01％BSA，最终调PH值为7.6。
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