CN113151543A

CN113151543A - 一种利用ssr标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用

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Publication number: CN113151543A
Application number: CN202110296979.1A
Authority: CN
Inventors: 卫尊征; 周涤; 王壹; 王贤; 熊敏
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: CN113151543B

Abstract

本发明公开了一种利用SSR标记快速鉴定种苗期马蹄莲类型的引物组、方法、试剂盒及其应用。所述引物组包含引物对Zah27、Zah89和Zah102中的至少一种；所述引物对Zah27碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述引物对Zah89碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述引物对Zah102碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明的方法具有操作简单、检测效率高等优点，填补了当前马蹄莲属内组间种苗早期鉴定技术缺失的空白，能够有效打击假冒种苗的销售和传播，保护马蹄莲种苗购买者的合法权益。

Description

一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术，具体地，涉及一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲属白色组和彩色组种苗的引物组、方法及试剂和试剂盒。

背景技术

马蹄莲(Zantedeschia)为原产于南非的天南星科(Araceae)，是多年生草本植物，全属共7种2亚种，按其生活习性和特征分为白色和彩色两个组。白色组的植株茎叶在冬季不落叶，花期从晚冬到晚春，耐寒性和抗病性强，适应范围广；但常见的仅一种，其佛焰苞花色单一仅为白色，即Z.aethiopica。而彩色组包括Z.elliottianna，Z.rehmannii，Z.albomaculata，Z.jucunda， Z.pentlandii等多个种或亚种；夏季开花，冬季落叶，经低温休眠花芽分化后可在第二年继续生长开花；与白色组相比，虽然彩色组耐寒耐热性和抗病性较差，但因为它们更容易产生组内种间园艺杂交种(Z.hybrida)，变异类型更多，佛焰苞花色更丰富艳丽，具体包含红、黄、粉、橙、紫多个色系，所以更受市场欢迎。目前国际国内市场上流行的商业马蹄莲品种主要来自于彩色组，据不完全统计，彩色组品种注册数量已超过300个，较高的观赏价值和广阔的市场前景俨然使其跻身于高档球根花卉之列。

购买利用组织培养技术生产的大批量脱毒种苗，是目前国内外栽培生产公司或机构实现马蹄莲商业种球快速供应的一个主要途径。这主要是因为采用组培技术工厂化所生产的马蹄莲种苗，其植株长势强，开花整齐，而且产花量高，具有能保持原品种的性状、繁殖速度快和便于管理等优点。但也存在一个重要问题，即组织培养过程中的白色组和彩色组马蹄莲的种质材料，在叶片形态上是无法区分和辨别的，而两者最有效的区分方式为块茎形态和佛焰苞颜色，但至少在组培苗移栽生长2年后才能观察到。因为白色组马蹄莲的市场价值相对比较低廉，加上材料获取容易且组培快繁系数大等优势，所以存在不良商家或个人故意用其冒充彩色组马蹄莲，从而达到以次充好混淆两者的目的，极大的增加了马蹄莲栽培生产者的种植商业风险。因此，如何实现白色和彩色组马蹄莲苗期的早期鉴定就显得格外重要。

白色组和彩色组马蹄莲之间存在着严重的生殖隔离，两者通过杂交所获得的后代因为核质基因组不兼容，会导致的胚乳败育、质体发育不良及白化苗等问题，使其难以成活。进一步利用流式细胞仪对两者代表种的基因组大小进行估测，发现它们存在明显的区别，白色组马蹄莲Z.aethiopica和彩色组马蹄莲Z.elliottiana的核DNA含量分别约为3.72±0.10pg和1.17±0.50pg (DNA/2C)，基因组大小各相当于3.64Gbp和1.15Gbp。考虑到两者基因组差异较大，若能寻找到两者共有的且具有差异的基因组来源的核酸序列，并开发出重现性好和特异性强的分子标记，比如一般由2～6个核苷酸为重复单位组成的串联重复SSR标记，有助于解决白色组和彩色组马蹄莲的早期检测问题，也势必将对马蹄莲属两个组未来新品种的选育和保护起到重要辅助作用。

发明内容

为解决当前白色组和彩色组马蹄莲苗期种质鉴定方法不足的问题，本发明目的在于提供了一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用。基于马蹄莲属白色组和彩色组之间多个种(品种)共有转录组拼接序列所开发的SSR引物组及鉴定方法，可有效满足当前市场对两个马蹄莲组间种苗的早期商业鉴定要求。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明第一方面提供一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源为白色组或彩色组，所述引物组包含引物对Zah27、Zah89和Zah102中的至少一种；

所述引物对Zah27的正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

所述引物对Zah89的正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；

所述引物对Zah102的正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5 所示，反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

本发明第二方面提供一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的方法，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲类型为白色组或彩色组(也可以表述为：区分马蹄莲来源为白色组或彩色组)，所述方法包含以下步骤：

S1、提取待测马蹄莲的基因组DNA；

S2、以待测马蹄莲的基因组DNA为模板，用上述的引物组中的任一或多个引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S3、检测所述PCR扩增产物，并根据所述PCR扩增产物的带型进行鉴定，以确定所述待测马蹄莲来源于白色组或彩色组。

根据本发明第二方面的方法，作为一种优选实施方式，所述PCR扩增的体系按12.5μL计为：10ng/μL所述模板2.0μL，10×Buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 0.25μL，10μM正向引物0.4μL，10μM反向引物0.4μL，Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH₂O8.0μL。

根据本发明第二方面的方法，作为一种优选实施方式，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，52-58℃退火40s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明第二方面的方法，作为一种优选实施方式，所述待测马蹄莲为马蹄莲种苗。

根据本发明第二方面的方法，作为一种优选实施方式，在步骤S3中，所述检测是采用电泳的方式进行的；所述带型的特征包括条带的大小和/或数量；

根据本发明第二方面的方法，作为一种优选实施方式，在步骤S3中，所述鉴定按照如下方法进行：

采用引物对Zah27进行PCR扩增时，经电泳后，当PCR扩增产物是分子量大小为120bp的条带和/或110bp的条带时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物为一条电泳条带且分子量大小为130bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

采用引物对Zah89进行PCR扩增时，经电泳后，当PCR扩增产物是分子量大小为147bp的条带和/或153bp的条带时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物为一条电泳条带且分子量大小为160bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

采用引物对Zah102进行PCR扩增时，当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小分别为190bp时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为177bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

在对某一品种进行鉴定时，三个引物可以单独使用获得鉴定结果，这些结果之间可以互相验证，以增加结果的可靠性。因此，鉴定时，引物可以组合使用。

本发明第三方面提供了一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的试剂盒，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源于白色组或彩色组，所述试剂盒包含上述引物组。

根据本发明第三方面的试剂盒，作为一种优选实施方式，所述引物组中，正向引物和反向引物的摩尔比为1:1；

根据本发明第三方面的试剂盒，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和/或dNTPs。

根据本发明第三方面的试剂盒，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括PCR缓冲液。

本发明第四方面提供了上述引物组或上述方法或者上述试剂盒在马蹄莲种苗类型鉴定方面的应用。

根据本发明第四方面提供的应用，作为一种优选实施方式，所述类型鉴定是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源于白色组或彩色组。

本发明提供利用SSR标记鉴定马蹄莲属白色组和彩色组种苗的引物组，该引物组中含有所筛选产生的3对马蹄莲属通用引物中的一种或多种，其具有扩增带型清晰容易判读、重复稳定性好和结果准确等优点；由于它们非常适合于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，对未来建立如毛细管电泳高通量检测平台，实现更加快速简便、经济实用和稳定可靠的鉴定方法提供支持。本发明提供的方法，具有操作简单方便和检测效率高等优点，填补了当前马蹄莲属内组间种苗早期鉴定技术缺失的空白，从而，能够有效打击假冒种苗的销售和传播，保护马蹄莲种苗购买者的合法权益，为进一步发展和壮大马蹄莲产业提供帮助。

另外，本发明获取的SSR位点利用了自己独特的方法，首先基于多个转录组原始测序序列按照统一参数进行拼接，之后采取先寻找SSR位点再筛选多态性的策略，保证同源序列内SSR位点真实存在和多态性，克服了以往类似研究所存在因为拼接序列数量少，假阳性高，真实性差，扩增失败率高和多态性低等缺陷，通过该种方法筛选的标记效率更高，真实有效性更强。

本发明选用的42份种质资源进行试验，材料范围广，品种齐全，白色和彩色的种质资源均来自多个地方和国家，代表性强，其检测结果可以说明，本发明提供的三对引物是可以根据扩增片段长度将种苗期马蹄莲区分为白色组还是彩色组。

附图说明

图1是马蹄莲属共有序列查找SSR碱基数量和类型；

图2是Zah27、Zah89和Zah102三对SSR引物提供的鉴定白马组和彩马组马蹄莲材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；

图3是Zah197、Zah277、Zah405和Zah430四对SSR引物提供的鉴定白马组和彩马组马蹄莲材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。

下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

试验材料:

收集(包括商购、赠予和种质库)了来自欧美及非洲等国家的马蹄莲属 42份种质资源(表1)，其中白色组马蹄莲主要是Z.aethiopica的野生种或栽培种；而彩色组马蹄莲主要是当前国际国内市场上流行的园艺杂交种 Z.hybrida。

表1.试验用白色组和彩色组马蹄莲试验材料

实施例1：SSR引物组的获取和初步筛选

1、白/彩色组马蹄莲转录组测序及序列下载

1.1马蹄莲属已测定RNA原始序列下载

目前NCBI(National Center for Biotechnology Information)上已经公布两组来自马蹄莲属的转录组原始序列。一个是白色组马蹄莲(Z.aethiopica)，主要是利用Hiseq2000平台对处于盛花期的佛焰苞进行测序，登录号为 SRR868662，获得原始碱基数的大小约为17G左右；另外一个是来自彩色组马蹄莲Z.rehmannii cv.‘Rehmannii’，同样是利用Hiseq2000平台对多个时期多个组织混合材料进行双端测序，登录号为SRR3310941，大小预计在6G左右。主要利用软件Aspera直接下载上述fastq文件到电脑本地。

1.2彩色组马蹄莲品种“Black Magic”不同时期种球混合转录组测序

利用QiaGene RNeasy kit试剂盒提取包括处于三个不同生长或休眠时期块茎在内的RNA，琼脂糖检测后紫外分光光度计定量，稀释后各样品等量混合送至美吉生物公司测序。测序主要步骤包括以下内容：首先利用DNase去除基因组DNA污染，再经反转录试剂盒合成cDNA第一条链；之后加入缓冲液、dNTPs、RNase H等合成第二条cDNA链；经过试剂盒纯化并加EB 缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头；之后再进行琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择和PCR扩增；最后用Illumina HiSeq^TM2000 采用双末端测序法测序。最终获得7G左右的原始序列。

2、马蹄莲转录组序列重新拼接及功能注释

将上述三组马蹄莲原始序列上传至北京百迈客云 (https://international.biocloud.net/)分别进行重新拼接分析。主要步骤如下：首先利用BMK自主研发“真核生物无参考基因组的转录组分析平台”对测序数据进行质量评估为开始，包括冗余reads和rRNA过滤、低质量碱基过滤等的评估。做完数据质量评估之后，使用该平台内嵌软件Trinity默认参数将测序Reads拼接成转录本序列，Trinity不依赖于参考基因组序列，从头进行全长转录本的拼接，是目前业界公认的最好的RNA-Seq从头(de novo)组装软件。拼接完序列后提取出每个基因最长的转录本构建该样品的Unigenes 数据库。

马蹄莲属白/彩色组3个种(品种)转录组拼接序列参数进行比较的结果参见表2。

表2马蹄莲属白/彩色组3个种(品种)转录组拼接序列参数比较

从表2可知，用Trinity软件对经过序列质量控制和筛选后的高质量clean 数据进行拼接组装。三份研究材料分别组装得到71089，89825和120836条 Unigenes，N50分别为1187bp，960bp和825bp，平均长分别为675.1bp，604.4bp 和585.7bp，拼接序列的GC含量在45.1-46.7％之间。具体的组装结果和统计信息见表2。经过拼接最终获得unigenes序列长度分布在各品种间基本一致，随着unigenes序列长度增加，unigenes序列的数量随之逐步平稳递减。但三者的unigenes序列均以长度在200-300bp间数量最多，所占比例分别为40.7％，44.21％和41.86％；大于2000bp数量最少，所占比例分别为7.0％， 5.5％和4.9％。

3.马蹄莲属共有序列SSR位点查找

CandiSSR是目前为数不多的，一个能从同物种或近缘物种多个转录组或基因组核酸序列中快速鉴定出真实有效多态性SSR位点的生物信息学软件。该软件主要基于Perl语言，具体步骤包括以下内容：首先收集转录组或基因组拼接序列，并从候选序列中鉴定SSR位点并提取鉴定两翼序列；之后将各个包含SSR位点序列与指定参考转录组或基因组序列进行blast比对；在去除低质量比对结果后提取比对后的SSR位点及两翼序列后，依照参考转录组或基因组拼接序列，提取侯选参考SSR位点的最终特异性序列；最后进一步过滤掉低质量SSR位点，分析该SSR位点的多态性特点并输出。在Linux 系统下对马蹄莲属三个转录组拼接unigene序列进行上述分析，SSR位点寻找主要利用嵌套MISA软件搜索，搜索标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸及以上且至少碱基重复次数分别为10、8、6、5和 3；包含SSR位点的比对主要是利用BlastN比对程序，以白马组Z.aethiopica拼接的109286条Unigenes作为参考序列，其它两个彩马组序列作为query 序列，所涉及分析参数均为默认。

如图1所示，利用CandiSSR方法寻找三组马蹄莲共有的SSR位点及其同源拼接序列，结果显示在所共有的670条同源unigenes中共鉴定出660个潜在的多态性SSR位点。不同碱基类型分布显示各碱基类型之间分布的极度不均衡，两个亚组之间共有的上述转录拼接序列所包含的SSR位点以三碱基和二碱基数量最多，分别为429和221，其它类型碱基较少，如图1所述。而进一步的碱基类型表明，二碱基类型中以AG/CT含量最高(145)，AT/TA (44)和AC/GT(27)次之，CG/CG最少(5)；三碱基中以CCG/CGG(82) 和AGG/CCT(109)含量最高，AGC/CTG(46)和AAG/CTT(37)次之，其它相对较少。

4.引物寻找、设计及多态性筛选分析

获得白色组和彩色组共有序列后利用Primerpair 3软件批量设计引物并进行后续引物合成和筛选。设置参数如下，Product size range：100～300bp； Numbers toreturn:3；Max 3’stability:2kcal/mol；Max mispriming:8；Primer Tm:50～65℃；Maximum Tm difference:5℃。引物设计后需人工浏览分析并手动修正，特别注意的是引物3’端最后五个碱基应避免有3个以上的G或C。

利用CandiSSR方法内嵌Primer pairs软件批量设计上述马蹄莲共有序列中SSR位点的上下游引物，其中有70个SSR位点由于上下游序列短或不能满足设计条件被放弃，结果显示可以成功设计590个引物序列对。因为白色组和彩色组马蹄莲基因组大小存在显著差异，为了提高上述引物的适用和有效性，我们继续对三组马蹄莲鉴定SSR中所涉及的两个参数“Missing Rate”“Transferability(Similarity)”进一步比较筛选；当“Missing Rate”为0，“Transferability(Similarity)”大于0.6时所鉴定的SSR位点及引物对保留，同时后者参数还要确保转移率是在两组间而不是组内；最后经人工筛选后共有 160对引物符合条件。再利用表1中的21份白马组和21份彩马组的材料进行初步验证分析。结果显示共有7对引物可在两组材料中扩增出清晰可重复且稳定性好的带型，7个引物对序列参见表3，它们在42份材料中的扩增等位基因数量(Na)为2～4个，有效等位基因数(Ne)为1.98～3.07，观察和期望杂合度分别为0.00～0.76和0.50～0.67，遗传多样性参数为0.69～1.23。显示出上述位点在马蹄莲属材料中的遗传分化的不同。筛选的7对多态性 SSR引物序列的分析参见表4。通过图2和3可知，Zah27引物对、Zah89 引物对和Zah102引物对可以显著区分马蹄莲属的白色组和彩色组。

表3筛选的7对多态性SSR引物序列

表4筛选的7对多态性SSR引物序列的分析

实施例2采用本发明引物进行鉴定的方法

1.DNA提取和贮藏

取马蹄莲材料的新鲜叶片，液氮研磨后用泽星科技公司植物基因组试剂盒提取核基因组DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计定量稀释，之后可以选择放于-20℃冰箱中贮存备用。

2.PCR扩增及检测

2.1 PCR扩增及程序

PCR扩增的反应体系12.5μL，包括DNA模板2.0μL(20ng)，10×Buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 0.25μL(TAKARA公司)，10μM正向引物和负向引物各0.4μL(上海生工公司)，Taq DNA聚合酶0.2μL(泽星科技公司)、ddH₂O 8.0μL。

PCR扩增的反应程序为:预变性94℃5min；94℃变性45s，最佳52-58℃退火40s，72℃延伸60s，共进行30个循环；之后72℃延伸10min，最终4℃保存；所用PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMS GeneAmp PCR system 9700。

2.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA)

将PCR扩增产物在8.0％高分辨率非变性PA胶中分离，仪器为北京鸿涛基业公司的HT-SCZ04型高通量双面垂直电泳槽。具体操作步骤如下：

A玻璃板清洗:用洗涤剂将玻璃板反复擦洗干净，并用酒精擦干。

B凝胶制备:8％PA胶90ml+TEMED50μl+20％APS500μl，充分混匀。

C灌胶:把胶沿灌胶口轻轻灌进两玻璃板空隙间，防止出现气泡，待胶流动到底部，在灌胶口插入梳子，需聚合1h以上；

D上样:将胶板安装在电泳槽内，向电泳槽的正负极加入1×TBE电极缓冲液，拔出样品梳子；在PCR扩增产物中加5μl Loading Buffer，上样后恒压 150V电泳60min左右；

E取胶:电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将胶剥离等待染色。

2.3弱碱法银染检测

将电泳后的凝胶在弱碱条件下用硝酸银染色，操作程序为：

A固定:10％的固定液(60ml冰乙酸+540ml水)浸泡30min，至二甲苯青FF消失，回收固定液；

B水洗后染色:蒸馏水冲洗胶2次，5min/次；(0.6g硝酸银+600ml水+ 900μl甲醛)染色，约30min，弃银染液；

C水洗后显影:蒸馏水快速漂洗胶，约10s；将胶放入4℃预冷的显影液 (18g无水碳酸钠+600ml水+900μl甲醛+120μl的10mg/ml硫代硫酸钠)显影，振荡至条带型显现为止；

D固定及水洗:弃显影液，将胶放入回收的固定液中振荡5min；最后用蒸馏水冲洗胶2次。

2.4统计带型

胶片晾干后用保鲜膜覆盖并照相或扫描，Marker估计其分子量大小并输入计算机。

3.鉴定

采用引物对Zah27进行PCR扩增时，产物经电泳后，当PCR扩增产物是分子量大小为120bp的条带和/或110bp的条带时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物为一条电泳条带且分子量大小为130bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

采用引物对Zah102进行PCR扩增时，当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小分别为190bp时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为177bp时，待测马蹄莲来源于彩色组。

实施例3多态性SSR引物在马蹄莲属42份资源中应用分析

根据扩增条带分子量大小利用GenAlex软件计算白色组和彩色组马蹄莲的Na(等位基因数)、Ho(观察杂合度)、He(期望杂合度)、I(多态信息量)等相应的遗传多样性参数。之后，依据所筛选的组间或组内的扩增清晰重复性好的SSR标记组合，共同构建42份马蹄莲属谱系或品种的指纹图谱；最终筛选并确定出区分白色组和彩色组马蹄莲的最佳引物组合。

1.DNA提取和贮藏

取表1中42份马蹄莲材料的新鲜叶片，液氮研磨后用泽星科技公司植物基因组试剂盒提取核基因组DNA，制得42份DNA模板，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计定量稀释，之后可以选择放于-20℃冰箱中贮存备用。

2.采用实施例2的方法、利用表3中记载的7对多态性SSR引物，分别对42份马蹄莲基因组DNA进行PCR扩增、检测，电泳结果参见图2和图3。

3.白色组和彩色组马蹄莲的多样性比较分析

根据第2步的扩增条带分子量大小利用GenAlex软件计算白色组和彩色组马蹄莲的Na(等位基因数)、Ho(观察杂合度)、He(期望杂合度)、I(多态信息量)等相应的遗传多样性参数。具体参见表5。

表5 7对多态性SSR引物在21份白色组和21份彩色组马蹄莲中多样性分析

进一步利用上述材料分别对21份白色组和21份彩色组马蹄莲材料的多样性参数进行分析。结果显示，引物Zah102在白色组材料的扩增产物中仅有一个等位基因(Na)，其余引物扩增等位基因数在2～4个之间，总体有效等位基因数(Ne)在1.0～2.78之间。而彩色组中除Zah102仅扩增出一个等位基因外，还有Zah27，Zah89和Zah197，其余引物扩增等位基因数在2～ 3个之间，有效等位基因数在1.0～2.0。由于白色组和彩色组均存在由至少单个引物扩增出的单个等位基因，所以说两组马蹄莲的观察杂合度(Ho)，期望杂合度(He)和多样性参数(I)都存在最低值。白色组马蹄莲Ho，He 和I分别为0～0.52，0～0.64和0～0.12，而彩色组的Ho，He和I分别为0～ 1.0，0～0.50和0～0.69。总体来讲，与彩色组相比，白色组马蹄莲具有更多的等位基因，更高的杂合度和多样性。这与两个因素有关，一是白色组马蹄莲野生种适应性更强，在世界范围内分布更广，而彩色组马蹄莲原生种，对生长环境要求较为苛刻，最初仅分布在非洲部分如好望角等区域；二是白色组马蹄莲的栽培驯化历史更长，可追溯至16世纪，而彩色组马蹄莲则不足百年，而且因为野生种资源有限，所选育的亲本多是园艺杂交种，遗传多样性显著不足。正因为彩色组马蹄莲的资源稀有和匮乏，所以造成其盆切花和种苗种球都要远远高于白色组马蹄莲，也正因如此出现不少白色组材料冒充彩色组马蹄莲销售出卖的现象。

4.白色组和彩色组马蹄莲指纹图谱及区分引物筛选

为避免将马蹄莲属白色组和彩色组两种材料混淆，并更加清楚的区分马蹄莲属白色组和彩色组，我们进一步应用上述的7对马蹄莲属共有的SSR标记对21份白色组和21份彩色组的马蹄莲代表材料进行分析。根据步骤2和3 的结果，得到白色组和彩色组马蹄莲基因类型以及区分白色和彩色马蹄莲材料的能力，具体参见表6。

表6 7对多态性SSR引物在21份白色组和21份彩色组的多样性分析

如图2和3所示，所扩增出的条带显示它们在区分能力上可以分为两组：第一组是可以显著区分白马组和彩马组马蹄莲材料的三对SSR引物(Zah27， Zah89和Zah102)，它们在白色组的扩增等位基因估测分子量依次是 A110/120，A147/153和A190，而在彩色组的扩增等位基因估测分子量是 A130，A160和A177，白色组和彩色组的扩增产物无重叠，容易区分白色组还是彩色组；第二组则是不能显著区分白马组和彩马组马蹄莲材料四对SSR 引物(Zah197，Zah277，Zah405和Zah430)，其中白色组的扩增等位基因估测分子量为A177/192，A127/130/133，A186/190/194/206和A188/191/1201，而彩色组的扩增等位基因估测分子量为A192，A130/145，A190/194， A185/191，白色组和彩色组的扩增产物有重叠，不容易区分白色组还是彩色组。上述所筛选的第一组SSR引物填补了白马组和彩马组马蹄莲鉴定的技术空白，将为今后有效打击假冒种苗的销售和传播，保护马蹄莲种苗购买者的合法权益，为进一步发展和壮大马蹄莲产业提供帮助。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用

<130> C1CNCN210262

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgccatgaca tatgcctgct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggtgctga tgtaggggat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttggggaag ctgccaaaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctcgcaca acacaacacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgcccctgg actagagaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actccgcgtt ggctctaatc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actccacaac ccttctccct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctccctctaa aggccccaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtgggactt ggggaaaacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggacggctt ctccttctct 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tacatgcccc taagctggtg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgcactttgt cgaggacaca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acacatctgt cacagtcgca 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actgctatgt tctgcatacg gt 22

Claims

1.一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分其属于白色组马蹄莲或彩色组马蹄莲，其特征在于，所述引物组包含引物对Zah27、Zah89和Zah102中的至少一种；

所述引物对Zah102的正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

2.一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的方法，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源为白色组或彩色组，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

S1、提取待测马蹄莲的基因组DNA；

S2、以待测马蹄莲的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物组中的任一或多种引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S3、检测所述PCR扩增产物，并根据所述PCR扩增产物的带型进行鉴定，以确定所述待测马蹄莲类型是来源于白色组或彩色组。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系按12.5μL计为：10ng/μL所述模板2.0μL，10×Buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs0.25μL，10μM正向引物0.4μL，10μM反向引物0.4μL，Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH₂O8.0μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，52-58℃退火40s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测马蹄莲为马蹄莲种苗。

6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述检测是采用电泳的方式进行的；所述带型的特征包括条带的大小和/或数量；

优选地，所述鉴定按照如下方法进行：

采用引物对Zah27进行PCR扩增时，经电泳后，当PCR扩增产物是分子量大小为120bp的条带和/或110bp的条带时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为130bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

采用引物对Zah89进行PCR扩增时，经电泳后，当PCR扩增产物是分子量大小为147bp的条带和/或153bp的条带时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为160bp时，待测马蹄莲来源于彩色组；

采用引物对Zah102进行PCR扩增时，当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为190bp时，待测马蹄莲来源于白色组；当PCR扩增产物是一条电泳条带且分子量大小为177bp时，待测马蹄莲来源于彩色组。

7.一种利用SSR标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的试剂盒，所述鉴定马蹄莲种苗类型是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源为白色组或彩色组，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中，正向引物和反向引物的摩尔比为1:1；

优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和/或dNTPs；

优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液。

9.权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一项所述的方法或者所述权利要求7或8所述的试剂盒在马蹄莲种苗类型鉴定方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述类型鉴定是指在马蹄莲种苗期区分马蹄莲来源于白色组或彩色组。