CN101185433A - 一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 - Google Patents
一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101185433A CN101185433A CNA2007101647324A CN200710164732A CN101185433A CN 101185433 A CN101185433 A CN 101185433A CN A2007101647324 A CNA2007101647324 A CN A2007101647324A CN 200710164732 A CN200710164732 A CN 200710164732A CN 101185433 A CN101185433 A CN 101185433A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- culture
- preservation
- proliferation
- light intensity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 241000189662 Calla Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 60
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 19
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 18
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 6
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 3
- 235000000292 Gouania lupuloides Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 241001492410 Pratia purpurascens Species 0.000 claims 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 abstract description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 241000985592 Zantedeschia Species 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 241000209524 Araceae Species 0.000 description 1
- 241000132012 Atractylodes Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000299452 Gouania lupuloides Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000006004 Quartz sand Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法,属于植物种质资源保存及组织培养技术领域。该方法包括:培养基的配制;外植体消毒、接种及诱导培养;增殖培养;生根培养;球茎膨大培养;种质保存培养;恢复培养及遗传稳定性检测与利用等步骤。该方法取彩色马蹄莲0.5mm茎尖分生组织为外植体,减少了培养基中大量元素并添加了甘露醇和青霉素,在10-15℃,光照10h/d,光强1000Lx环境下保存球茎苗,15个月后无欧文氏菌污染,存活率达100%,恢复培养后生长、增殖仍正常,无可遗传变异发生。该方法具成本低廉,操作简便等特点,可在彩色马蹄莲种质保存领域中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物种质资源保存及组织培养技术领域,尤其涉及一种彩色马蹄莲种质资源离体保存的方法。
背景技术
彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrida)系天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生单子叶草本球根花卉,其形态高雅、色彩艳丽,在欧洲国家一直是切花中的佼佼者,盆花栽培也是一大消费渠道。近几年来也逐渐受到我国消费者的喜爱,种植面积正不断扩大。生产上彩色马蹄莲多为一年生栽培,通过球茎进行无性繁殖。彩色马蹄莲种质资源的繁殖和保存也主要依靠球茎为繁殖材料每年进行田间种植,这需要消耗大量的人力、物力和财力,而且彩色马蹄莲球茎本身很容易感染细菌性软腐病,通过多年的无性繁殖后很容易造成细菌、病毒等病虫害蔓延,造成资源损失,给种质资源的利用和保存带来难题。
当前,植物种质资源的保存方法主要有田间生长保存,离体低温保存、超低温保存,组织培养保存等方法。其中,常规田间种植保存中,存在因季节变换、病虫害等自然灾害的侵袭而造成工作量大和种质资源容易丢失;而超低温保存需要严格的保存条件,风险较大。植物离体保存因不受外界环境条件的影响,具有田间生长保存无法比拟的优点。对植物进行离体保存技术已多有报导,如专利申请号为CN200710019345和CN200710019346分别报导了通过减少培养基中大量元素和添加脱落酸进行菊花离体保存的方法,发明名称为“茅苍术组培繁殖的种质保存方法”,发明名称为“一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法”,等分别通过常温抑制生长,普通组织培养方式或超低温方式对植物进行了离体保存。但简单的运用以上保存方法并不适用于彩色马蹄莲,首先,彩色马蹄莲球茎本身很容易携带欧文氏菌(可导致细菌性软腐病),尤其通常以带芽眼的切块为外植体,在快繁过程中随着培养代数的增加,此内生菌也大量繁殖蔓延,导致组培快繁无法继续;其次,该欧文氏菌系内生菌,若以常规的升汞表面消毒则达不到理想的防治效果,这对彩色马蹄莲的长期离体保存也是一个瓶茎问题;再次,在常规组培保存中必需对彩色马蹄莲种质资源进行频繁的继代培养(约每月继代一次)才能较好地保持其种性;此外,彩色马蹄莲球茎除携带欧文氏菌外,也往往携带有大量病毒,这在组培与离体保存中也是必须考虑的问题。
发明内容
本发明目的是,针对以往彩色马蹄莲常规组培离体保存中,一方面以种球带芽眼切块为外植体和常规的表面消毒,对球茎本身所携带的内生菌种一欧文氏菌,难以达到好的灭菌、脱菌的效果,另一方面在常规保存培养条件下需频繁继代培养所带来的大工作量等缺陷;提出一种成本低廉,操作简便,灭菌效果较好,保存期长达一年以上不需要频繁继代培养而仍能保持优良种性的彩色马蹄莲种质资源离体保存方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法,按如下步骤进行:
(1)培养基的配制:各阶段培养基组分和各组分在每升培养基内所含重量为:
A)基本培养基:其中,诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的MS为基本培养基;生根培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基;试管球茎膨大培养基以蔗糖40~50g/L,琼脂6g/L的MS为基本培养基;种质保存培养基以蔗糖20g/L,琼脂8g/L的1/2MS为基本培养基;pH均为5.6~5.8;
B)诱导培养基M1:MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青霉素50mg/L;
C)增殖培养基M2:MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青霉素100mg/L;
D)生根培养基M3:1/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L;
E)球茎膨大培养基M4:MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L;
F)种质保存培养基M5:1/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青霉素100mg/L;
(2)外植体消毒、接种及诱导培养:选取彩色马蹄莲健康、饱满母球,用自来水刷洗掉母球上泥土及最外层褐色表皮,冲洗约20分钟后,用解剖刀切取母球上1cm3的块茎芽眼,经自来水冲洗干净后,于超净操作台上用75%酒精浸泡0.5分钟,无菌水冲洗3次,0.1%HgCl2水溶液常规灭菌12min,无菌水冲洗3~5次,剥取0.5mm以下茎尖分生组织,接种于诱导培养基M1中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;或选取彩色马蹄莲组培生产过程中无内生菌污染且生长健康的植株,剥取0.5mm以下茎尖分生组织为诱导、增殖对象;
(3)增殖培养:将步骤(2)已成活且无污染的丛生芽转接到增殖培养基M2中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;继代周期为一个月,将块状芽丛剪成小块进行扩繁;
(4)生根培养:挑选步骤(3)中健壮丛状小植株剪成单株转接到生根培养基M3中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月,长成4-6条白色长根的小苗;
(5)球茎膨大培养:挑选步骤(4)中根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大培养基M4中进行试管养球,在22-25℃,光照12-16h/d,光强2000-3000Lx下培养约一个月时间;
(6)种质保存培养:挑选步骤(5)小子球饱满的植株转接到种质保存培养基M5中,在10-15℃,光照10h/d,光强1000Lx环境下保存,保存期长达15个月以上;
(7)恢复培养:将步骤(6)保存培养一年以上已进入半休眠状态的小子球植株,先转移到同步骤(2)培养条件下恢复培养一个月,再转接到新鲜的诱导培养基M1中进行二代或二代以上的组培繁殖;
(8)遗传稳定性检测与利用:观察并挑选步骤(7)组培繁殖的小子球生长、增殖状况正常,长势旺盛,增殖率为3.8-4.2,经可溶性蛋白和过氧化物酶(POD)检测未发生遗传变异的植株;该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存;或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
所述的1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog(MS)培养基。
本发明的有益效果是:
一、本发明采用0.5mm以下彩色马蹄莲茎尖分生组织为外植体,并在诱导、增殖及保存培养基中分别添加了50mg/L与100mg/L的青霉素以获得培养材料,有效地克服了内生菌造成的污染问题,同时,通过茎尖脱毒种球内的病毒也得到了较好的控制;而通常以带芽眼切块为外植体且在培养基中不添加青霉素的培养方式中,经过4-5代增殖培养后会开始出现内生菌的污染现象,以此种材料为保存对象,很可能造成保存的失败。
二、本发明通过在保存培养基中添加了10.0~20.0g/L甘露醇,将大量无机盐成分减半,并辅以较低温度、低光照的生长环境(10-15℃,光照10h/d,光强1000Lx),抑制了保存材料的生长,达到长期保存目的,比在普通MS培养基中保存期延长6-8个月,不需频繁继代,可在有限的空间内保存更多的种质资源,并减轻了工作量。
三、本发明保存的小球茎苗经恢复培养与繁殖后,既可用于再保存,也可直接用于组培快速繁殖,后代生长正常,增殖第2代的增殖系数平均为3.8-4.2,与正常球茎苗相当,亦无遗传变异发生;这种保存方法相对于超低温保存安全、设备简单、易操作,成本可降低50%以上。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明,但本发明的内容并不仅限于此。
青霉素与甘露醇均为上海化学试剂厂生产化学纯;
实施例1:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法1)
(1)培养基的配制:
基本培养基:
1)诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的MS为基本培养基;
2)生根培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基;
3)试管球茎膨大培养基以蔗糖40~50g/L,琼脂6g/L的MS为基本培养基;
4)种质保存培养基以蔗糖20g/L,琼脂8g/L的1/2MS;
以上基本培养基pH均为5.6~5.8;
其中,1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog(MS)培养基;
(2)外植体消毒、接种及诱导培养:选取健康、饱满彩色马蹄莲母球,用自来水刷洗掉母球上泥土及最外层褐色表皮,经流水下冲洗约20分钟后,用解剖刀切取母球上1cm3的块茎芽眼,经自来水冲洗干净后,于超净操作台上用75%酒精浸泡0.5分钟,无菌水冲洗3次,0.1%的HgCl2水溶液常规灭菌12min,无菌水冲洗3~5次,剥取0.5mm以下茎尖分生组织,接种于茎尖诱导培养基M1:MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.4mg/L+青霉素50mg/L中,于26℃,光强2500Lx,光照12h/d条件下培养;
(3)增殖培养:一个月后将步骤(2)中已成活且无污染的丛生芽转移到增殖培养基M2:MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.45mg/L+青霉素100mg/L中,于22℃,光强3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月进行扩繁;继代周期为一个月,将块状芽丛剪成小块进行扩繁;
(4)生根培养:挑选步骤(3)中健壮小植株剪成单株转接到M3:1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L培养基中,于22℃,光强2000Lx,光照12h/d条件下培养一个月,可长成4-6条白色壮而长根的小苗;
(5)球茎膨大培养:挑选步骤(4)中根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大培养基M4:MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L中进行试管养球,光照期间培养温度为25℃,黑暗期间为15℃,光照时间为12h/d,光强3000Lx,约一个月时间即可;
(6)种质保存培养:挑选步骤(5)中小子球饱满的植株保存于培养基M5:1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+甘露醇20.0g/L+青霉素100mg/L中,培养温度为15℃,光照为10h/d,光强1000 Lx环境下保存可达15个月以上。
(7)恢复培养:对步骤(6)中保存一年以上已进入半休眠状态的小子球转移到,同步骤(2)相同培养条件下进行恢复培养一个月后,转移到新鲜的M1培养基中进行二代或二代以上的组培繁殖;
(8)遗传稳定性检测与利用:可观察到步骤(7)中恢复培养的小子球生长增殖状况正常,长势旺盛,到第2代增殖率与正常组培条件下已形成相应大小试管球茎的组培苗相当,为3.8-4.2,通过可溶性蛋白和过氧化物酶(POD)检测未发生遗传变异。该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存;或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
实施例2:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法2)
本例诱导培养基为M1:MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.3mg/L+青霉素50mg/L,培养条件为24℃,光强3000Lx,光照12h/d;
增殖培养基为M2:MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+青霉素100mg/L,培养条件为25℃,光强2500Lx,光照12h/d条件下培养一个月;
生根培养基为M3:1/2MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L,培养条件为23℃,光强3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;
球茎膨大培养为M4:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L,培养条件为光照期间22℃,黑暗时间温度为13℃,光照时间为14h/d,光强2500Lx;
种质保存培养基为M5:1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+甘露醇15.0g/L+青霉素100mg/L,培养条件为10℃,光照为10h/d,光强1000 Lx;
其余步骤,工艺均同于实施例1。
实施例3:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法3)
本例诱导培养基为M1:MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+青霉素50mg/L上;培养条件为22℃,光强2000Lx,光照12h/d;
增殖培养基为M2:MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.15mg/L+青霉素100mg/L,培养条件为23℃,光强2000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;
生根培养基为M3:1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L,培养条件为26℃,光强2500Lx,光照12h/d条件下培养一个月;
球茎膨大培养为M4:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L,培养条件为光照期间培养温度为24℃,黑暗期间培养温度为13℃,光照时间为16h/d,光强2000Lx;
种质保存培养基为M5:1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.4mg/L+甘露醇18.0g/L+青霉素100mg/L,培养条件为13℃,光照为10h/d,光强1000Lx;
其余步骤,工艺均同于实施例1。
试验例:(遗传稳定性检测)
(1)植物材料
a)对照材料:以常规正常繁殖生产的茎尖组培苗为材料;
b)处理材料:以恢复培养的保存材料二代繁殖苗为检测对象;
(2)将对照与处理材料经过增殖、生根后种植田间,观察生长、开花情况均趋一致,叶片与花均无变异发生;
(3)对照与处理材料蛋白质和同工酶样品溶液的制备:分别准确称取2.0g试管苗叶片,剪碎后加入适量的石英砂于冰浴下匀浆,匀浆过程加入4ml稀释4倍的浓缩胶缓冲(pH值6.7),5000r/min离心20min,取上清液2ml加入1ml蔗糖溶液(40%)和1滴溴酚蓝溶液(0.1%)混匀,于-20℃冰箱内贮存备用;
(4)电泳操作:采用垂直PAGE不连续凝胶系统。每个样品槽上样30ul,电泳开始时控制电流为15mA,待样品进入分离胶后,调整电流为25mA。待溴酚蓝迁移至琼脂层1cm时停止电泳,整个过程约3h;为防止温度对酶活的影响,电泳均在4℃冰箱内进行;
(5)染色:电泳结束后,打开胶板取出凝胶,标记溴酚蓝泳动前沿;可溶性蛋白采用考马斯亮R2250法染色;POD采用抗坏血酸-醋酸联苯胺法染色;
(6)谱带结果与对照无明显多态性,表明保存过程中无遗传变异发生。
Claims (2)
1.一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法,其特征在于该方法按如下步骤进行:
(1)培养基的配制:各阶段培养基组分和各组分在每升培养基内所含重量为:
A)基本培养基:其中,诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的MS为基本培养基;生根培养基以蔗糖30g/L,琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基;试管球茎膨大培养基以蔗糖40~50g/L,琼脂6g/L的MS为基本培养基;种质保存培养基以蔗糖20g/L,琼脂8g/L的1/2MS为基本培养基;pH均为5.6~5.8;
B)诱导培养基M1:MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青霉素50mg/L;
C)增殖培养基M2:MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青霉素100mg/L;
D)生根培养基M3:1/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L;
E)球茎膨大培养基M4:MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac 1 g/L;
F)种质保存培养基M5:1/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青霉素100mg/L;
(2)外植体消毒、接种及诱导培养:选取彩色马蹄莲健康、饱满母球,用自来水刷洗泥土及最外层褐色表皮,冲洗约20分钟后,切取母球上1cm3的块茎芽眼,经自来水冲洗后,于超净操作台上用75%酒精浸泡0.5分钟,无菌水冲洗3次,0.1%HgCl2水溶液常规灭菌12min,无菌水冲洗3~5次,剥取0.5mm以下茎尖分生组织,接种于诱导培养基M1中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;或选取彩色马蹄莲组培生产过程中无内生菌污染且生长健康的植株,剥取0.5mm以下茎尖分生组织为诱导、增殖对象;
(3)增殖培养:将步骤(2)已成活且无污染的丛生芽转接到增殖培养基M2中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月;继代周期为一个月,将块状芽丛剪成小块进行扩繁;
(4)生根培养:挑选步骤(3)中健壮丛状小植株剪成单株转接到生根培养基M3中,于22-26℃,光强2000-3000Lx,光照12h/d条件下培养一个月,长成4-6条白色长根的小苗;
(5)球茎膨大培养:挑选步骤(4)根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大培养基M4中进行试管养球,在22-25℃,光照12-16h/d,光强2000-3000Lx下培养约一个月时间;
(6)种质保存培养:挑选步骤(5)小子球饱满的植株转接到种质保存培养基M5中,在10-15℃,光照10h/d,光强1000Lx环境下保存,保存期长达15个月以上;
(7)恢复培养:将步骤(6)保存培养一年以上已进入半休眠状态的小子球植株,先转移到同步骤(2)培养条件下恢复培养一个月,再转接到新鲜的诱导培养基M1中进行二代或二代以上的组培繁殖;
(8)遗传稳定性检测与利用:观察并挑选步骤(7)组培繁殖的小子球生长、增殖状况正常,长势旺盛,增殖率为3.8-4.2,经可溶性蛋白和过氧化物酶(POD)检测未发生遗传变异的植株;该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存;或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
2.按权利要求1所述的方法,其特征在于所述的1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog(MS)培养基。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200710164732A CN100574614C (zh) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | 一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200710164732A CN100574614C (zh) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | 一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101185433A true CN101185433A (zh) | 2008-05-28 |
CN100574614C CN100574614C (zh) | 2009-12-30 |
Family
ID=39478218
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200710164732A Expired - Fee Related CN100574614C (zh) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | 一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100574614C (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102090330A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-06-15 | 天津滨海国际花卉科技园区股份有限公司 | 彩色马蹄莲瓶内结茎的快速繁殖方法 |
CN102379239A (zh) * | 2011-09-09 | 2012-03-21 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 人工辅助授粉培育彩色马蹄莲新品种的方法 |
CN104041407A (zh) * | 2013-08-08 | 2014-09-17 | 欧中(福建)植物技术有限公司 | 一种深紫色马蹄莲组培快速繁殖方法 |
CN113151543A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-07-23 | 北京市农林科学院 | 一种利用ssr标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用 |
CN118000102A (zh) * | 2024-04-10 | 2024-05-10 | 云南龙藏生物科技有限公司 | 一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1139316C (zh) * | 1999-06-01 | 2004-02-25 | 北京锦绣大地农业股份有限公司 | 彩色马蹄莲微型种球大规模快繁方法 |
CN1331383C (zh) * | 2004-02-04 | 2007-08-15 | 贵州科学院 | 马蹄莲的高产栽培方法 |
-
2007
- 2007-12-10 CN CN200710164732A patent/CN100574614C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102090330A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-06-15 | 天津滨海国际花卉科技园区股份有限公司 | 彩色马蹄莲瓶内结茎的快速繁殖方法 |
CN102379239A (zh) * | 2011-09-09 | 2012-03-21 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 人工辅助授粉培育彩色马蹄莲新品种的方法 |
CN104041407A (zh) * | 2013-08-08 | 2014-09-17 | 欧中(福建)植物技术有限公司 | 一种深紫色马蹄莲组培快速繁殖方法 |
CN113151543A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-07-23 | 北京市农林科学院 | 一种利用ssr标记快速鉴定马蹄莲种苗类型的引物组、方法、试剂盒及其应用 |
CN118000102A (zh) * | 2024-04-10 | 2024-05-10 | 云南龙藏生物科技有限公司 | 一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN100574614C (zh) | 2009-12-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101366357B (zh) | 红蓝石蒜的组织培养和快速繁殖技术的方法 | |
CN103283598B (zh) | 一种杉木初代培养芽诱导方法 | |
CN104813939B (zh) | 一种荷花再生体系的构建方法 | |
CN101647393A (zh) | 毛花猕猴桃组培快速繁殖方法 | |
CN107155898B (zh) | 一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法 | |
CN103598098A (zh) | 粉葛组织培养快速育苗方法 | |
CN102792888B (zh) | 丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法 | |
CN113331059B (zh) | 一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法 | |
CN100574614C (zh) | 一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法 | |
CN111165356B (zh) | 一种牡丹的组织培养繁殖方法 | |
CN101731137B (zh) | 一种改良十字花科作物耐盐性状的方法 | |
CN101112175B (zh) | 一种龙爪兰的组培快繁方法 | |
CN103734013B (zh) | 白撮茄的高效再生培养体系 | |
CN102613087A (zh) | 生物组织培养繁育考来木的方法 | |
CN108782247A (zh) | 一种日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法 | |
CN108739408A (zh) | 一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法 | |
CN117426304B (zh) | 一种巨花多穗蓼的组织培养方法 | |
CN115669545A (zh) | 一种光核桃愈伤组织的诱导方法 | |
CN108849500A (zh) | 一种莲胚拯救及后代快速生长发育的培养基和方法 | |
CN114698549A (zh) | 一种葡萄砧木茎段快繁的组培培养基和组培方法 | |
Kumari et al. | In vitro Propagation of Medicinally Valuable Traditional Banana Cultivar, Musa acuminata cv. Matti by Shoot Tip Culture | |
CN115918539B (zh) | 一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法 | |
CN101112174A (zh) | 一种袋鼠花组培快繁的方法 | |
CN116982557B (zh) | 一种伊藤杂种‘和谐’组培快繁方法 | |
CN116158346B (zh) | 一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20091230 Termination date: 20131210 |