CN101112175B - 一种龙爪兰的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙爪兰组培快繁的方法，按如下步骤进行：1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分；2)外植体的选取与灭菌：取龙爪兰幼嫩侧芽，经灭菌处理后备用；3)诱导培养：接种在诱导培养基上，直接从外植体诱导出初代幼芽；4)增殖培养：接种在增殖培养基上分化出丛芽；5)壮苗培养：接种到壮苗培养基上；6)生根培养：接种到生根培养基上；7)组培苗的驯化与移栽。本发明的有益效果是：提出的龙爪兰组培优化培养基针对性强、适用性好，生根率达100％；移栽成活率90％以上。该方法有效地防止了外植体和组培苗的褐变现象，促进了组培苗的分化和生长；遗传性状一致，克服了常规繁殖系数低的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，主要是一种龙爪兰的组培快繁方法。
背景技术
龙爪兰(Dactylorhiza majalis)是起源于欧洲的一种耐寒地生兰科植物，为兰科根爪兰属多年生草本植物，非常漂亮，花期在6月底到7月，花色为紫红色、且非常优雅。现在美国的一些专业苗圃开始培养龙爪兰出售。但龙爪兰生长缓慢、繁殖系数低，三年只能增殖2个芽，且又不能确定能否结种子。至今尚未见有组培成功的报道。
浙江省农业科学院从英国引进龙爪兰种质，拟通过植物组织培养技术大量繁殖种苗，然后出口欧美国家。同时还可以在国内试种后加以推广。采用植物组织培养方法可以在短期内快速繁殖多种植物，不仅繁殖率高，且因为其是无性繁殖，可以保持原繁殖母株的优良性状，近年来在生产上应用越来越广。但是不同的植物利用植物组织培养方法繁殖种苗的难易程度是不同的，特别是兰科植物比较难。在龙爪兰的前期组培试验中，也出现了兰科植物在组织培养中常出现的一些问题，如外植体接种污染率高、外植体易褐化、组培苗易褐化、移栽成活率低等问题，使其无法实现大规模工厂化生产。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种龙爪兰组培快繁的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案。这种龙爪兰组培快繁的方法，按如下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA2～5mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+活性炭1～3g/L；
(3)增殖培养基：MS+6-BA1～3mg/L+NAA0.05～0.3mg/L+活性炭1～3g/L；
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.1～1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+活性炭1～3g/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L+活性碳1～3g/L；
2)、外植体的选取与灭菌；取龙爪兰幼嫩侧芽，经灭菌处理后备用；
3)、诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的幼嫩侧芽在无菌条件下，用滤纸吸干后，用解剖刀剥去外叶，切去上部叶后，接种在诱导培养基上，经1～2个月后，直接从外植体诱导出初代幼芽；
4)、增殖培养：将步骤3)诱导出的初代幼芽在无菌条件下，接种在增殖培养基上，培养30～45天分化出丛芽；每隔30～45天，将步骤4)分化的丛芽切成单株再接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；
5)、壮苗培养：将步骤4)分化出丛芽接种到壮苗培养基上，20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；
6)、生根培养：将步骤5)生长达2～5厘米丛芽切成单株接种到生根培养基上，20～30天后，幼苗基部长出数根根系：
7)、组培苗的驯化与移栽：将步骤6)生长达3～7厘米以上的生根幼芽，移至常温下适应3～5天后，打开盖子再适应3～5天，洗清根部培养基后移栽入栽培基质中。
所述的灭菌处理是幼嫩侧芽用自来水冲洗干净后，整理成1～1.5厘米长的幼芽，先在体积比为10％的柠檬酸溶液中浸泡0.5～1小时，再经体积比为75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用体积比为0.1％升汞溶液灭菌10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。
所述的优化培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭3g/L；
(3)增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L；
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L；
(5)生根培养基；1/2MS+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L。
所述的各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，光照光强为1500～2500Lx，光照时间为12h/d。
所述的栽培基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成。
本发明的有益效果是：
1)、提出的龙爪兰组培优化培养基针对性强、适用性好，由于提高了细胞分裂素浓度，芽的诱导率达90％以上；芽的增殖率每个培养周期达5倍以上，年组培苗生产能力可达100万苗以上(一年为8个培养周期)；经增设的壮苗培养基培养后成苗生长速度加快，20～30天苗高可达2～5厘米，生根率达100％；移栽成活率90％以上。
2)、该方法由于外植体进行了柠檬酸溶液中浸泡预处理，在培养的各个阶段在培养基中添加了活性炭，并在20±2℃较低的温度下进行培养，有效地防止了外植体和组培苗的褐变现象，促进了组培苗的分化和生长。
3)、提出的组织培养快速繁殖方法得到的龙爪兰组培苗，遗传性状一致，克服了常规繁殖系数低的缺点。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：本实施例1中的这种龙爪兰组培快繁的方法，按如下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA2～5mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+活性炭1～3g/L
(3)增殖培养基：MS+6-BA1～3mg/L+NAA0.05～0.3mg/L+活性炭1～3g/L
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.1～1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+活性炭1～3g/L
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L+活性碳1～3g/L
2)、外植体的选取与灭菌：取龙爪兰幼嫩侧芽，用自来水冲洗干净后，整理成1～1.5厘米长的幼芽，先在体积比为10％的柠檬酸溶液中浸泡0.5～1小时，再经体积比为75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用体积比为0.1％升汞溶液灭菌10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
3)、诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的幼嫩侧芽在无菌条件下，用滤纸吸干后，用解剖刀剥去外叶，切去上部叶后，接种在诱导培养基上，经1～2个月后，直接从外植体诱导出初代幼芽；
4)、增殖培养：将步骤3)诱导出的初代幼芽在无菌条件下，接种在增殖培养基上，培养30～45天分化出丛芽；每隔30～45天，将步骤4)分化的丛芽切成单株再接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；
5)、壮苗培养：将步骤4)分化出丛芽接种到壮苗培养基上，20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；
6)、生根培养：将步骤5)生长达2～5厘米丛芽切成单株接种到生根培养基上，20～30天后，幼苗基部长出数根根系；
7)、组培苗的驯化与移栽：将步骤6)生长达3～7厘米以上的生根幼芽，移至常温下适应3～5天后，打开盖子再适应3～5天，洗清根部培养基后移栽入由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成的栽培基质中。
该实施例中各组培阶段的培养条件是：培养温度为20±2℃，光照光强为1500～2500Lx，光照时间为12h/d。
实施例2：本实施例2中的这种龙爪兰组培快繁的方法，按如下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中白糖30g/L，琼脂8g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭3g/L
(3)增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；
2)、外植体的选取与灭菌：取龙爪兰幼嫩侧芽，取龙爪兰幼嫩侧芽，用自来水冲洗干净后，整理成1～1.5厘米长的幼芽，先在体积比为10％的柠檬酸溶液中浸泡0.5～1小时，再经体积比为75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用体积比为0.1％升汞溶液灭菌10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
3)、诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的幼嫩侧芽在无菌条件下，用滤纸吸干后，用解剖刀剥去外叶，切去上部叶后，接种在诱导培养基上，经1～2个月后，直接从外植体诱导出初代幼芽；
4)、增殖培养：将步骤3)诱导出的初代幼芽在无菌条件下，接种在增殖培养基上，培养30～45天分化出丛芽；每隔30～45天，将步骤4)分化的丛芽切成单株再接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；
5)、壮苗培养：将步骤4)分化出丛芽接种到壮苗培养基上，20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；
6)、生根培养：将步骤5)生长达2～5厘米丛芽切成单株接种到生根培养基上，20～30天后，幼苗基部长出数根根系；
7)、组培苗的驯化与移栽：将步骤6)生长达3～7厘米以上的生根幼芽，移至常温下适应3～5天后，打开盖子再适应3～5天，洗清根部培养基后移栽入由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成的栽培基质中。
该实施例中各组培阶段的培养条件是：培养温度为20±2℃，光照光强为1500～2500Lx，光照时间为12h/d。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种龙爪兰的组培快繁方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA2～5mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+活性炭1～3g/L；
(3)增殖培养基：MS+6-BA1～3mg/L+NAA0.05～0.3mg/L+活性炭1～3g/L；
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.1～1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+活性炭1～3g/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L+活性碳1～3g/L；
2)、外植体的选取与灭菌：取龙爪兰幼嫩侧芽，经灭菌处理后备用；
3)、诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的幼嫩侧芽在无菌条件下，用滤纸吸干后，用解剖刀剥去外叶，切去上部叶后，接种在诱导培养基上，经1～2个月后，直接从外植体诱导出初代幼芽；
4)、增殖培养：将步骤3)诱导出的初代幼芽在无菌条件下，接种在增殖培养基上，培养30～45天分化出丛芽；每隔30～45天，将分化的丛芽切成单株再接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；
5)、壮苗培养：将步骤4)分化出丛芽接种到壮苗培养基上，20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；
6)、生根培养：将步骤5)生长达2～5厘米丛芽切成单株接种到生根培养基上，20～30天后，幼苗基部长出数根根系；
7)、组培苗的驯化与移栽：将步骤6)生长达3～7厘米以上的生根幼芽，移至常温下适应3～5天后，打开盖子再适应3～5天，洗清根部培养基后移栽入栽培基质中；
其中，所述的各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，光照光强为1500～2500Lx，光照时间为12h/d；所述栽培基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶2∶1配制而成。
2.根据权利要求1所述的龙爪兰的组培快繁方法，其特征在于：所述的灭菌处理是幼嫩侧芽用自来水冲洗干净后，整理成1～1.5厘米长的幼芽，先在体积比为10％的柠檬酸溶液中浸泡0.5～1小时，再经体积比为75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用体积比为0.1％升汞溶液灭菌10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。
3.根据权利要求1所述的龙爪兰的组培快繁方法，其特征在于：所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：MS或3/4MS或1/2MS，其中蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.4；
(2)诱导培养基：MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭3g/L；
(3)增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L；
(4)壮苗培养基：3/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L+活性碳1g/L。
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