CN103734013B - 白撮茄的高效再生培养体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物技术育种领域的白撮茄的高效再生培养体系，包括如下步骤：步骤一，培育白撮茄无菌苗；步骤二，诱导愈伤组织；步骤三，诱导不定芽；步骤四，诱导不定根，生根移栽，获得白撮茄再生植株。本发明采用幼叶作为茄子再生体系外植体，在含有NAA和ZT的愈伤组织诱导培养基上诱导出愈伤后，再在含有NAA、ZT、6-BA和AgNO3的芽诱导培养基上诱导生芽，再于1/2MS的生根培养基上诱导生根，得到生根小苗，按常规方法驯化移栽。本发明建立的再生体系，其愈伤组织诱导率可达97%左右，生芽率达到82%。继代生长良好，为茄子基因工程育种工作，提供了高效稳定再生体系。
Description
技术领域
本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种白撮茄的高效再生培养体系。
背景技术
茄子是一种重要的经济作物，其营养价值丰富，含有多种人体必需物质，每100g茄子中含有核黄素0.04mg、尼克酸0.6mg、维生素C5mg、维生素E1.13mg、铁0.5mg、锰0.13mg、锌0.23mg等。茄子在亚洲和非洲栽培广泛，目前，中国已经成为茄子最大的生产国，2011年年产量达2770万吨，是第二大生产国印度的两倍之多（FAO,2011）。在茄子生产栽培中很容易受到病虫害侵害，尤其是青枯病、黄萎病和枯萎病，发病严重时可造成茄子产量和品质的大幅下降。因此利用基因工程创造抗病、优质的茄子新品种具有重要意义。
为获得转基因植株受体系统必须具有高效稳定的再生体系。茄子再生已有相关报道Kamat,M.Getal.，1978；Guri,Aetal.，1987；Franklin,Getal.，2004；Shivaraj,Getal.，余波澜等，2003，范适等，2005，曹必好等，2008，龚静等2011.)但在茄子再生过程中，出愈率低，愈伤组织生长状态不好，芽分化率不够高，转化率低等问题较为突出。因此，建立高效稳定的再生体系，对推动我国茄子基因工程育种研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种白撮茄的高效再生培养体系。本发明是以幼叶为外植体的白撮茄高效再生体系建立方法。
本发明涉及一种白撮茄的高效再生培养体系，包括如下步骤：
步骤一，培育白撮茄无菌苗；
步骤二，诱导愈伤组织；
步骤三，诱导不定芽；
步骤四，诱导不定根，生根移栽，获得白撮茄再生植株。
优选地，步骤一中，所述培育包括如下步骤：取生长饱满的白撮茄种子，于55℃水浴锅中浸种消毒15min，在室温条件下浸泡8h，以体积分数为2％次氯酸钠杀菌10min，无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干水分，接种在无激素、pH值为5.8的MS培养基中，置于黑暗条件下发芽，温度设置白天30℃，夜间20℃，以打破种子休眠，种子长出1cm左右芽后，光照培养5-7天，待幼苗长出两片子叶，第一片真叶即将长出时，即得白撮茄无菌苗。
优选地，步骤二中，所述诱导愈伤组织使用的诱导培养基为：
MS+NAA0.1mg/L+ZT3.0mg/L，pH值为5.8。
优选地，步骤二中，所述诱导愈伤组织包括如下步骤：选取白撮茄无菌苗，切取子叶为外植体，子叶去除两端后剪成小块，正面向上平放于培养基进行诱导培养。
优选地，步骤三中，所述诱导不定芽使用的诱导培养基为：
MS+NAA0.1mg/L+ZT4.0mg/L+6-BA1.5mg/L+AgNo38.0mg/L，pH值为5.8。
优选地，步骤三中，所述诱导不定芽包括如下步骤：诱导愈伤组织10-14天后，得到幼嫩绿色愈伤组织，将其接种于诱导不定芽使用的诱导培养基中，进行不定芽的诱导。
优选地，步骤四中，所述诱导不定根使用的诱导培养基为：1/2MS培养基，pH值为5.8。
优选地，步骤四中，所述诱导不定根包括如下步骤：在不定芽诱导获得的幼苗长出2-3片真叶或幼苗为2-4cm长时，不带愈伤组织将其从基部剪断，接种不定根使用的诱导培养基进行不定根的诱导培养。
优选地，步骤四中，所述生根移栽为：幼苗进行不定根诱导培养15d后，有4-5片真叶，三条主根，若干条侧根，逐渐揭开瓶口通风，继续培养5d后即可移栽。
优选地，步骤二、三和四中，所述诱导的培养条件为：温度24±2℃；光照强度为1600lx，光照时间为16/24h。
本发明具有如下的有益效果：本发明采用幼叶作为茄子再生体系外植体，在含有NAA和ZT的愈伤组织诱导培养基上诱导出愈伤后，再在含有NAA、ZT、6-BA和AgNO3的芽诱导培养基上诱导生芽，再于1/2MS的生根培养基上诱导生根，得到生根小苗，按常规方法驯化移栽。本发明建立的再生体系，其愈伤组织诱导率可达97%左右，生芽率达到82%。继代生长良好，为茄子基因工程育种工作，提供了高效稳定再生体系。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是以白茄无菌苗子叶为外植体进行组织培养。
图2是白茄无菌苗子叶分化形成愈伤组织。
图3是白茄愈伤组织分化形成不定芽芽。
图4是白茄不定芽伸长。
图5是白茄不定芽进行生根诱导。
图6是白茄再生苗驯化移栽。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
以下各步骤的培养条件均为：温度24±2℃；光照强度为1600lx，光照时间为16/24h，各培养基中蔗糖和琼脂含量百分数为质量百分数。
一、无菌苗的获得
取白撮茄（SolanummelongenaL.）（《利用形态学标记和SSR分子标记分析茄子种质资源遗传多样性》韩洪强，陈火英。2009.上海交通大学硕士学位论文）的种子，将供试种子于55℃水浴锅中浸种消毒15min，在室温条件下浸泡8h。在无菌操作台上以2%次氯酸钠杀菌10min，无菌水漂洗3次后用无菌滤纸吸干水分，接种在无激素的MS培养基中；无菌苗生长培养基为MS培养基（月季再生体系的建立和遗传转化初步研究，孟令宁，2012年6月，硕士学位论文），pH值为5.8（如图1所示）；置于黑暗条件下发芽，温度设置白天30℃，夜间20℃，以打破种子休眠；种子长出1cm左右芽后，光照培养5-7天。待幼苗长出两片子叶，第一片真叶即将长出时，即可用作实验材料。
二、愈伤组织诱导
以步骤一中无菌苗子叶为外植体，子叶去除两端后剪成0.3cmx0.2cm的小块，正面向上平放于培养基(图1)。诱导愈伤组织的基本培养基为MS培养基，蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.8。分别附加不同激素配比：NAA：0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L，ZT：1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L。试验采用随机区组设计,每组60个，3次重复。
外植体接种到诱导分化培养基上，一周后即可产生愈伤组织(图2)。不同浓度NAA和ZT生长的愈伤组织类型不同。白撮茄在不同浓度激素培养基上可以形成多种不同类型的愈伤组织，其在颜色、质地、形态和生长状态有明显差异。
白撮茄在NAA0.1mg/L，ZT3.0mg/L时外植体诱导率能达到97%；因此，愈伤组织诱导培养基为MS基础培养基优选为，MS+NAA0.1mg/L+ZT3.0mg/L，pH值为5.8；在此种类型培养基中，愈伤组织生长状态好，愈伤组织类型主要为T3类，颜色为绿色致深绿色，质地紧密，块状，生长较慢，分化成芽潜力高。
表1不同激素浓度诱导愈伤组织类型
表2不同浓度ZT、NAA对外植体愈伤组织分化的影响
| ZT | NAA | 愈伤组织类型 | 10d后出愈率(%) | 外植体是否生根 |
| 1.0 | 0.1 | T1 T2 | 86.67±0.1667afg | 是 |
| 1.0 | 0.3 | T2 | 84.44±0.7876ab | 否 |
| 1.0 | 0.5 | T1 | 78.89±0.7876bh | 是 |
| 2.0 | 0.1 | T1 T3 | 95.00±0.1667ce | 否 |
| 2.0 | 0.3 | T1 | 88.89±0.3469ac | 否 |
| 2.0 | 0.5 | T1 T3 | 84.44±0.2546adh | 是 |
| 3.0 | 0.1 | T3 | 97.22±0.1925e | 否 |
| 3.0 | 0.3 | T1 T3 | 91.67±0.3333ceg | 否 |
| 3.0 | 0.5 | T1 | 83.89±25.46bdf | 是 |
三、不定芽的诱导
步骤二中的外植体生长10-14天后，长出幼嫩绿色愈伤组织，将其接种到添加不同激素组分和AgNO3的MS培养基中诱导生芽。MS培养基组分为：蔗糖30g/L，琼脂7g/L，NAA0.1mg/L，ZT3.0mg/L、4.0mg/L，6-BA0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L，AgNO30mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L、12.0mg/L，pH5.8。
将T3类型愈伤组织接种到分化培养基上，5d左右即可见组织膨大，部分愈伤有绿色芽点出现。10d后愈伤组织膨大数倍，周围产生松软的白色物质，绿色部分会分化形成不定芽(图3)，之后不定芽会进一步生长（图4）。NAA和ZT浓度比例对诱导芽分化起重要作用，当培养基中NAA与ZT比例较低时，有利于芽分化且单一外植体上分化的芽数较多。6-BA对芽的分化具有重要作用，当培养基组分不添加6-BA时，愈伤组织分化慢，且不易形成芽。当6-BA浓度为1.5mg/L时，每个外植体上芽数明显增多，成芽明显，芽生长快、分化率高。当6-BA浓度达到2.5mg/L时，一周即可形成芽且单个外植体生芽数量较多，但多为畸形芽，不能发育成正常植株。当培养基为MS+NAA0.1mg/L+ZT4.0mg/L+6-BA1.5mg/L时畸形芽少，芽分化率可达82%，10天左右即有明显的芽出现，2周后芽可分化成2-3cm长小苗，诱导芽分化效果最好。
不同浓度AgNo3对芽分化影响，在诱导芽分化过程中，培养基中添加不同浓度硝酸银。分别在一周、两周后统计芽分化率，观察外植体褐变程度。探讨不同浓度AgNO3对芽分化的影响。表4研究表明：表4研究表明：培养基中添加AgNO3能够促进芽的分化，同时抑制外植体褐变。在AgNO3浓度为8.0mg/L时，芽分化率为82%，诱导芽分化过程可不用更换培养基，芽即可发育成小苗。AgNO3浓度为4mg/L时，外植体不定芽分化率相对较低，且外植体出现部分褐变。AgNO3浓度为12mg/L时会造成新生芽体发黑，生芽率最高，但多为畸形芽，不适宜诱导外植体芽分化。可见，芽诱导培养基优选为：MS+NAA0.1mg/L+ZT4.0mg/L+6-BA1.5mg/L+AgNo38.0mg/L，pH值为5.8。
表3不同生长调节物质对不定芽分化影响
表4不同浓度AgNo3对芽分化影响
四、不定根的诱导和生根移栽
步骤三中的不定芽分化成的小苗长至2-4cm后，不带愈伤组织将其从基部切下，伤口整齐无污染，接种于诱导生根培养基中。表5的研究表明：1/2MS培养基（pH值为5.8）诱导生根效果较好，7d后即可生根，14d后生根率可达80%(图5)。在1/2MS+0.4mg/LNAA,1/2MS+1.0mg/LNAA培养基中同样可以生根，生根率与在1/2MS培养基中生根率差别不大。在MS培养基中只有少部分再生苗可以生根，在MS+0.4mg/LNAA、MS+1.0mg/LNAA培养基中，14天后再生苗根部会出现膨大，重新形成团状愈伤组织，不能生根。幼苗在培养基中生长15d后,有4-5片真叶，三条主根，若干条侧根，逐渐揭开瓶口通风，继续培养5d后移栽，驯化后可发育成正常植株(图6)。
表5不同培养基对白撮茄生根的影响
综上所述，本发明方法所建立白撮茄高效再生体系能使白茄子叶生成愈伤组织，愈伤组织形成不定芽，不定芽生根，驯化移栽后可长成完整植株。各个环节生长表现良好，培养的植株健壮，根系发达，表明本方法建立的白撮茄高效再生体系是切实可行和有效的。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (7)
1.一种白撮茄的再生培养体系，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，培育白撮茄无菌苗；
步骤二，诱导愈伤组织；
步骤三，诱导不定芽；
步骤四，诱导不定根，生根移栽，获得白撮茄再生植株；
步骤二中，所述诱导愈伤组织采用的外植体为子叶；
步骤二中，所述诱导愈伤组织使用的诱导培养基为：MS+NAA0.1mg/L+ZT3.0mg/L，pH值为5.8；
步骤三中，所述诱导不定芽使用的诱导培养基为：
MS+NAA0.1mg/L+ZT4.0mg/L+6-BA1.5mg/L+AgNO38.0mg/L，pH值为5.8；
步骤四中，所述诱导不定根使用的诱导培养基为：1/2MS培养基，pH值为5.8。
2.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤一中，所述培育包括如下步骤：取生长饱满的白撮茄种子，于55℃水浴锅中浸种消毒15min，在室温条件下浸泡8h，以体积分数为2％次氯酸钠杀菌10min，无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干水分，接种在无激素、pH值为5.8的MS培养基中，置于黑暗条件下发芽，温度设置白天30℃，夜间20℃，以打破种子休眠，种子长出1cm左右芽后，光照培养5-7天，待幼苗长出两片子叶，第一片真叶即将长出时，即得白撮茄无菌苗。
3.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤二中，所述诱导愈伤组织包括如下步骤：选取白撮茄无菌苗，切取子叶为外植体，子叶去除两端后剪成小块，正面向上平放于培养基进行诱导培养。
4.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤三中，所述诱导不定芽包括如下步骤：诱导愈伤组织10-14天后，得到幼嫩绿色愈伤组织，将其接种于诱导不定芽使用的诱导培养基中，进行不定芽的诱导。
5.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤四中，所述诱导不定根包括如下步骤：在不定芽诱导获得的幼苗长出2-3片真叶或幼苗为2-4cm长时，不带愈伤组织将其从基部剪断，接种不定根使用的诱导培养基进行不定根的诱导培养。
6.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤四中，所述生根移栽为：幼苗进行不定根诱导培养15d后，有4-5片真叶，三条主根，若干条侧根，逐渐揭开瓶口通风，继续培养5d后即可移栽。
7.如权利要求1所述的白撮茄的再生培养体系，其特征在于，步骤二、三和四中，所述诱导的培养条件为：温度24±2℃；光照强度为1600lx，光照时间为16/24h。
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