CN113907001A - 一种茄子子叶愈伤组织诱导及快速增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茄子子叶愈伤组织诱导及快速增殖的方法。该方法包括：选取茄子饱满成熟的种子用赤霉素浸泡以打破休眠；对种子进行消毒处理；将消毒过后的种子接种在MS培养基上于黑暗条件下生长，待种子露白转入光照条件下培养；待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成小块，接种到诱导培养基；接种到诱导培养基后，将茄子子叶在培养箱中进行黑暗培养，14天继代一次，培养28天；增殖培养或液体悬浮培养：茄子愈伤组织诱导28天后，选择生长疏松、致密、有活力的愈伤组织切下，接种到增殖培养基或液体培养基进行快速繁殖。本发明诱导的愈伤组织既可以用于细胞悬浮培养获得代谢产物，也可以经愈伤组织胚胎发生或器官发生获得再生植株。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种以茄子子叶为外植体进行愈伤组织诱导、快速增殖的方法。
背景技术
茄子(Solanum melongena L.)，茄科茄属一年生草本植物，是一种重要的蔬菜，颜色多为紫色或紫黑色，少许淡绿色或白色，其味道鲜美、营养价值丰富，还可用作药物防止人体的动脉硬化，深受广大民众喜爱。但茄子对不良环境和病虫害等的抵抗能力较弱，因此，发展茄子生产，利用生物技术手段培育具有抗逆、抗虫、抗病的茄子新品种具有重大的理论和实践意义。
常规育种方法在茄子改良上发挥了重要作用，但同时还存在选育年限长、远缘杂交不亲和及种质资源匮乏等问题。近年发展起来的组织培养、遗传转化导入目的基因创造新种质等生物技术手段的应用，为茄子转基因研究开辟了一条新途径。
茄子果皮富含花青素，花青素属于生物类黄酮物质，类黄酮物质最主要的生理活性功能是清除自由基和抗氧化，同时也具有降低酶活性、抗变异等保健功能，很有应用前景。悬浮培养是获得大量次生代谢物的最佳方式，有助于花青素进一步的开发和利用。
愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织。利用愈伤组织可以为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象，同时为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料。
以茄子子叶为外植体诱导愈伤组织虽有相关研究，但都以再生完整植株为目的，愈伤组织无限增殖和悬浮培养的已公开技术尚为空白。利用茄子培养技术将外植体脱分化诱导为愈伤组织并使之大量增殖，可实现愈伤组织悬浮培养大规模生产次生代谢产物，但这种方式在茄子上尚未见实际应用。
发明内容
本发明提供了一种茄子子叶愈伤组织诱导及快速增殖的方法。本发明诱导的愈伤组织既可以用于细胞悬浮培养获得代谢产物，也可以经愈伤组织胚胎发生或器官发生获得再生植株。
本发明的目的在于提供一种茄子子叶愈伤组织诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：
(1)选取茄子饱满成熟的种子用赤霉素浸泡以打破休眠；
(2)对种子进行消毒处理；
(3)将消毒过后的种子接种在MS培养基上于黑暗条件下生长，待种子露白转入光照条件下培养；
(4)待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成小块，接种到诱导培养基；
(5)接种到诱导培养基后，将茄子子叶在培养箱中进行黑暗培养，14天继代一次，培养28天；
(6)增殖培养：将诱导培养基上生长疏松、致密、有活力的愈伤组织切下，转入增殖培养基，在培养箱中黑暗培养，得到扩繁的茄子愈伤组织；
或液体悬浮培养：茄子愈伤组织诱导28天后，选择生长疏松、致密、有活力的愈伤组织切下，接种到液体培养基中，在黑暗条件下，摇床中震荡悬浮培养，得到扩繁的茄子愈伤组织。
进一步地，所述步骤(1)中种子用600mg/L赤霉素浸泡2h以上。
进一步地，所述步骤(2)中的消毒处理为用无菌水将浸泡种子的赤霉素清洗干净，然后用75％的乙醇浸泡种子30s，再用20％NaClO浸泡30min，最后用无菌水洗净，滤纸吸干种子表面水分。
进一步地，所述步骤(3)中，种子接种在MS培养基上于黑暗条件下生长6-8天；培养箱条件为光照强度3000lx、温度25±1℃；转入光照条件下后生长6-8天。
进一步地，所述步骤(4)中将子叶切成5mm×5mm小块。
进一步地，所述步骤(4)中的诱导培养基的配方为：MS+0.8mg/L 6-BA+3mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，固体培养基PH为5.78-5.82。
进一步地，所述诱导培养基优选的PH为5.79-5.81，最优选的PH为5.8。
进一步地，所述步骤(5)中的培养箱条件为光照强度3000lx、温度25±1℃。
进一步地，所述步骤(6)中的增殖培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，固体培养基PH为5.78-5.82。
进一步地，所述增殖培养基优选的PH为5.79-5.81，最优选的PH为5.8。
进一步地，所述步骤(6)中的培养箱温度为25±1℃。
进一步地，所述步骤(6)中的培养14天继代一次，共培养28天。
进一步地，所述步骤(6)中的液体悬浮培养基的配方为：MS+1mg/L NAA+30g/L蔗糖，液体培养基PH为5.78-5.82。
进一步地，所述液体悬浮培养基优选的PH为5.79-5.81，最优选的PH为5.8。
进一步地，所述步骤(7)中的液体悬浮培养以0.04g/mL的接种量接种到液体培养基中，在黑暗条件下，温度25℃，转速120r/min的摇床中震荡悬浮培养14天。
本发明的有益效果为：
本发明以茄子子叶为外植体诱导的愈伤组织活性高，胚性愈伤诱导率达到95.55％；在增殖培养基上生长增殖倍数可达到三倍以上；得到的愈伤组织既可以用于细胞悬浮培养获得代谢产物，也可以经愈伤组织胚胎发生或器官发生获得再生植株，进而达到快速繁殖的目的。
附图说明
图1为茄子子叶在诱导培养基上生长28天的状态；
图2为茄子子叶愈伤组织在增殖培养基上生长28天的状态；
图3为茄子子叶愈伤组织在液体悬浮培养中悬浮培养14天的状态。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
愈伤组织质量评价指标为：
(1)愈伤组织的色泽
根据愈伤组织生长的具体情况分为四个等级
a、白色
一般颜色很白的愈伤组织表现为苍白色，这种颜色的愈伤组织整体特征是组织松软，容易松散，愈伤组织往往出现水渍化的情况，这种愈伤组织培养一段时间后细胞逐渐死亡，因此白色的愈伤组织是不合格的。
b、黄白色
黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密、硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是合格质量好的愈伤组织。
c、深黄色
深黄色愈伤组织，没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度也比较高，但是深黄色愈伤组织培养一段时间以后很容易褐化，褐化后组织容易死亡，也是不合格的愈伤组织。
d、褐色
这类愈伤组织从培养之初就开始呈现褐色，表现出明显的褐化，褐化的愈伤组织不具备再生的能力，一段时间后细胞也会死亡，也是不合格的愈伤组织。
(2)愈伤组织的状态
主要包括愈伤组织的颗粒松散度和玻璃化这两个方面。颗粒散碎表示：愈伤组织容易松散、不紧密、愈伤组织表面毛刺状不平滑。颗粒致密表示：愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状、细胞致密、胞质密度高、愈伤组织边缘清晰。玻璃化：在植物组织培养过程中，培养组织呈透明或半透明水浸状，它是组培苗的一种生理失调症状。
(3)胚性愈伤诱导率
胚性愈伤组织乳白色或浅黄色、结构松散易碎、呈颗粒状、易产生胚状体，适合长期继代培养，主要通过胚状体途径再生植株，是理想组织培养材料。实验统计诱导出的愈伤中胚性愈伤的数量，从而衡量培养基配方对愈伤组织的诱导效果。
(4)愈伤增重
计算单位愈伤组织在不同激素配比的培养基上14天的重量差，从而衡量愈伤组织生长速度的快慢。
1、愈伤组织诱导培养基的筛选：
将茄子子叶接种于添加不同浓度的NAA、6-BA的MS培养基上研究不同配比的植物生长调节剂对茄子愈伤组织诱导培养的影响，培养基中附加蔗糖(30g/L)、琼脂粉(7g/L)，如表1所示。
表1不同的激素配比对茄子子叶愈伤组织诱导的影响
由表1的结果可知：培养基中添加NAA和6-BA的浓度分别是3.0mg/L和0.8mg/L时，产生的愈伤组织大小适中、组织紧密，颜色黄白色，组织分化能力强，胚性愈伤诱导率达到95.55％，是最优的诱导愈伤组织激素配比。愈伤组织诱导培养基的配方为MS+3.0mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.78-5.82。
以上所述的培养基配方中：
MS：MS是MS培养基，是Murashige和Slkoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。具体配方可参照此书：(曹孜义等，实用植物组织培养教程，1996，甘肃科学技术出版社)。在茄子子叶愈伤组织的诱导培养中我们使用由美国sigma公司生产MS培养基粉剂(Murashige and Skoog basal salt mixture)，此MS培养基粉剂要求每配制一升培养基添加4.4克粉剂，在本培养基的配制中，每配制一升茄子子叶愈伤组织的诱导培养基需要加入MS培养基粉剂4.4克。
NAA：NAA是1-萘乙酸，是一种广谱性植物生长调节剂，属类生长素物质，具有内源生长素吲哚乙酸的作用特点和生理机能。萘乙酸对植物的主要作用是促进细胞分裂和扩大，诱导形成不定根。在促进愈伤组织诱导的时候，浓度相比细胞分裂素较高，本实验中添加3mg/L的NAA配合细胞分裂素就可以很好的诱导茄子愈伤组织的形成。
6-BA：6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，但是一般在诱导愈伤组织发生时浓度不宜过高，本试验中添加0.8mg/L的6-BA就能够很好的诱导茄子愈伤组织的形成。
蔗糖：蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖。一般的组织培养中，蔗糖都是添加30g/L。
琼脂粉：琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用。一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。
培养基pH值：茄子子叶愈伤组织的培养对pH值的要求比较严格，过高或者过低都会造成植株生长不好，或者死亡，因此要精准调节PH值，最优PH值为5.8。
2、愈伤组织增殖培养基的筛选：
将茄子子叶诱导出的愈伤组织接种于添加不同浓度的NAA、6-BA的MS培养基上，研究不同配比的植物生长调节剂对茄子愈伤组织增殖的影响，培养基中附加蔗糖(30g/L)、琼脂粉(7g/L)，通过愈伤在14天内的增重衡量其增殖快慢，从而筛选出最佳的愈伤组织增殖培养基，具体如表2所示：
表2不同的激素配比对茄子子叶愈伤组织增殖的影响
由表2的结果可知：培养基中添加NAA和6-BA的浓度分别是0.6mg/L和1.0mg/L时，愈伤组织生长最快，增殖倍数达到4.18，远超过其他组合，是最优的茄子子叶愈伤组织增殖的激素配比。愈伤组织诱导培养基的配方为MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.78-5.82。
3、愈伤组织悬浮培养培养基的筛选：
将茄子子叶诱导出的愈伤组织以0.04g/ml的接种量接种到添加不同浓度的NAA、6-BA的液体悬浮培养基上，研究不同配比的植物生长调节剂对茄子愈伤组织悬浮培养的影响，培养基中附加蔗糖(30g/L)，生长14天之后，利用真空抽滤装置称取愈伤组织重量，计算不同激素配比的培养基上愈伤组织重量的增长率，从而得到最佳的茄子愈伤组织悬浮培养培养基，具体如表3所示：
表3不同的激素配比对茄子子叶愈伤组织悬浮培养的影响
由表3的结果可知：培养基中添加NAA 1.0mg/L时，愈伤组织生长最快，增殖倍数达到1.27，超过其他组合，是最优的茄子子叶愈伤组织悬浮培养的激素配比。愈伤组织悬浮培养培养基的配方为MS+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖，且培养基的pH值为5.78-5.82。
实施例1：
1.植物材料
所用植物材料为本实验室保存的茄子种质‘116’
2.实验方法
(1)选取饱满成熟的种子用600mg/L赤霉素浸泡2h以上；
(2)用无菌水将浸泡种子的赤霉素清洗干净，然后用75％的乙醇浸泡种子30s，无菌水洗净乙醇后，再用20％NaClO浸泡30min，最后用无菌水洗净，滤纸吸干种子表面水分；
(3)将消毒过后的种子均匀接种在MS培养基上，黑暗条件下生长6-8天，待种子露白后，转入光照强度为3000lx、温度为25±1℃的培养箱中培养6-8天；
(4)待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成5mm×5mm小块，接种到诱导培养基上；
(5)将子叶接种到诱导培养基(MS+3.0mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养基的pH值为5.8)上，在温度为25±1℃的培养箱中黑暗培养，14天继代一次，培养28天；
(6)将诱导培养基中生长疏松、致密、有活力的愈伤组织小心切下，转入增殖培养基(MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，培养基的pH值为5.78-5.82)，14天继代一次，生长28天。
3.实验结果
诱导产生的愈伤组织大小适中、组织紧密，颜色黄白色，组织分化能力强，胚性愈伤诱导率达到95.55％；增殖培养获得稳定增殖的愈伤组织，增殖倍数达到4.18。
实施例2：
1.植物材料
所用植物材料为本实验室保存的茄子种质‘116’
2.实验方法
(1)选取饱满成熟的种子用600mg/L赤霉素浸泡2h以上；
(2)用无菌水将浸泡种子的赤霉素清洗干净，然后用75％的乙醇浸泡种子30s，无菌水洗净乙醇后，再用20％NaClO浸泡30min，最后用无菌水洗净，滤纸吸干种子表面水分；
(3)将消毒过后的种子均匀接种在MS培养基上，黑暗条件下生长6-8天，待种子露白后，转入光照强度为3000lx、温度为25±1℃的培养箱中培养6-8天；
(4)待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成5mm×5mm小块，接种到诱导培养基上；
(5)将子叶接种到诱导培养基(MS+3.0mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养基的pH值为5.8)上，在温度为25±1℃的培养箱中黑暗培养，14天继代一次，培养28天；
(6)将诱导培养基中生长疏松、致密、有活力的愈伤组织小心切下，以0.04g/mL的接种量接种到液体培养基中(液体培养基的配方为MS+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖，且培养基的pH值为5.78-5.82)，在黑暗条件下，温度25℃，转速120r/min的摇床中震荡悬浮培养。
3.实验结果
诱导产生的愈伤组织大小适中、组织紧密，颜色黄白色，组织分化能力强，胚性愈伤诱导率达到95.55％；液体悬浮培养获得大小均匀、组织紧密，颜色黄白色且稳定增殖的悬浮愈伤组织，增殖倍数达到1.27。
实施例3：
1.植物材料
所用植物材料为本实验室保存的茄子种质‘110’
2.实验方法
(1)选取饱满成熟的种子用600mg/L赤霉素浸泡2h以上；
(2)用无菌水将浸泡种子的赤霉素清洗干净，然后用75％的乙醇浸泡种子30s，无菌水洗净乙醇后，再用20％NaClO浸泡30min，最后用无菌水洗净，滤纸吸干种子表面水分；
(3)将消毒过后的种子均匀接种在MS培养基上，黑暗条件下生长6-8天，待种子露白后，转入光照强度为3000lx、温度为25±1℃的培养箱中培养6-8天；
(4)待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成5mm×5mm小块，接种到诱导培养基上；
(5)将子叶接种到诱导培养基(MS+3.0mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养基的pH值为5.78-5.82)上，在温度为25±1℃的培养箱中黑暗培养，14天继代一次，培养28天；
(6)将诱导培养基中生长疏松、致密、有活力的愈伤组织小心切下，转入增殖培养基(MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，培养基的pH值为5.78-5.82)，14天继代一次，生长28天。
3.实验结果
诱导产生的愈伤组织大小适中、组织紧密，颜色黄白色，组织分化能力强，胚性愈伤诱导率达到93.75％；增殖培养获得稳定增殖的愈伤组织，每次继代培养的增殖倍数达到3.27。
从实施例结果可知，诱导愈伤的胚性愈伤诱导率均达到90％以上，增殖倍数均达到三倍以上，悬浮培养愈伤生长良好；根据以茄子材料进行的亲缘关系聚类分析图谱可知，茄子种质‘110’、‘116’亲缘关系较远，遗传背景存在较大差异，本发明愈伤组织诱导及增殖培养基激素配比在两个供试材料上均取得成功，可证明本发明品种适用性较强，适于推广与应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，上述说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (12)
1.一种茄子子叶愈伤组织诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：
(1)选取茄子饱满成熟的种子用赤霉素浸泡以打破休眠；
(2)对种子进行消毒处理；
(3)将消毒过后的种子接种在MS培养基上于黑暗条件下生长，待种子露白转入光照条件下培养；
(4)待茄子子叶完全展开后，在无菌条件下将其切成小块，接种到诱导培养基；
(5)接种到诱导培养基后，将茄子子叶在培养箱中进行黑暗培养，14天继代一次，培养28天，得到愈伤组织；
(6)增殖培养：将诱导培养基上生长疏松、致密、有活力的愈伤组织切下，转入增殖培养基，在培养箱中黑暗培养，得到扩繁的茄子愈伤组织；
或液体悬浮培养：茄子愈伤组织诱导28天后，选择生长疏松、致密、有活力的愈伤组织切下，接种到液体培养基中，在黑暗条件下，摇床中震荡悬浮培养，得到扩繁的茄子愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子用600mg/L赤霉素浸泡2h以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的消毒处理为用无菌水将浸泡种子的赤霉素清洗干净，然后用75％的乙醇浸泡种子30s，再用20％NaClO浸泡30min，最后用无菌水洗净，滤纸吸干种子表面水分。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，种子接种在MS培养基上于黑暗条件下生长6-8天；培养箱条件为光照强度3000lx、温度25±1℃；转入光照条件下后生长6-8天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中将子叶切成5mm×5mm小块。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的诱导培养基的配方为：MS+0.8mg/L 6-BA+3mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，固体培养基PH为5.78-5.82。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的培养箱条件为光照强度3000lx、温度25±1℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的增殖培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，固体培养基PH为5.78-5.82。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的培养箱温度为25±1℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的培养14天继代一次，共培养28天。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的液体悬浮培养基的配方为：MS+1mg/L NAA+30g/L蔗糖，液体培养基PH为5.78-5.82。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中的液体悬浮培养以0.04g/mL的接种量接种到液体培养基中，在黑暗条件下，温度25℃，转速120r/min的摇床中震荡悬浮培养14天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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