CN102726291A

CN102726291A - 一种诱导茄子花药形成愈伤组织的方法

Info

Publication number: CN102726291A
Application number: CN2012101113417A
Authority: CN
Inventors: 周晓慧; 刘军; 庄勇
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及一种诱导茄子花药形成愈伤组织的方法，属于植物生物技术领域。本发明所提供的高效诱导茄子花药形成愈伤组织的方法，是将茄子花药进行预处理，并经过热激处理后接种到本发明培养基上，在25~28℃条件下进行培养。本发明的培养效果好，利用本发明培养基进行茄子花药培养的方法具有愈伤组织诱导率高、培养周期短的优点。将本发明培养基及花药培养方法应用于茄子遗传育种中，可提高茄子花药培养的效率，缩短茄子育种的周期，为茄子的品种改良提供重要的技术支持。

Description

一种诱导茄子花药形成愈伤组织的方法

一、技术领域

本发明涉及一种诱导茄子花药形成愈伤组织的方法，属于植物生物技术领域。

二、背景技术

植物花药培养技术在作物遗传育种理论和实践研究中具有广阔的应用前景，通过花药培养可快速有效地获得纯合双单倍体，避免了通过传统育种手段需要多代自交才可以获得纯合稳定的品系，从而大大缩短了育种周期，提高了选择效率，降低成本。此外，通过花药培养获得的双单倍体可直接用于遗传图谱的构建、培育新品种或作为优良亲本用于品种改良。利用花药培养诱导单倍体或双单倍体已在很多作物上有成功的报道，同时利用获得的新种质资源已进行了新品种的选育和推广，并取得了良好的社会和经济效益。

茄子（Solanum melongena L.）起源于亚洲东南亚热带地区，古印度为最早驯化地。我国栽培茄子的历史悠久，一般认为中国是茄子第二起源地。茄子是我国栽培较广的茄果类蔬菜之一，它不仅具有较高的营养价值，且食用方法也多种多样，是一种可以鲜干结合、周年供应、经济实惠的大宗蔬菜，深受广大生产者和消费者的欢迎。尤其是近年来随着设施农业的发展，茄子设施栽培得到了长足的发展，并成为高效农业的重要组成部分，在保证市场供应和促进农民增收中发挥着重要作用。

随着植物花药培养技术的发展，为茄子新品种的选育开辟了一条新途径。利用茄子花药培养可快速获得纯系和突变体，创新种质资源，对茄子的品种改良具有重要的意义。虽然茄子花药培养的研究工作已开展多时，但是诱导过程中仍存在一些主要问题限制了茄子花药培养在实际育种中的应用，如愈伤组织诱导率较低，培养周期长等。因此，如何提高茄子花药培养中愈伤组织的诱导率是茄子花药培养技术研究中急需解决的一个难题。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于克服现有花药培养技术中愈伤组织诱导率低的不足，给出一种高效诱导茄子花药形成愈伤组织的专用培养基配方及方法，通过这种方法可快速诱导茄子花药形成愈伤组织，提高愈伤组织的诱导率，从而丰富适宜的茄子花药培养条件，为建立高效的茄子花药培养植株再生体系奠定基础。

技术方案

本发明提供了一种高效诱导茄子花药形成愈伤组织的方法。具体步骤如下：

1）取样与预处理：在盛花期于晴天上午8：00～9：00从健壮植株上取花蕾。采用显微镜镜检的方法鉴定小孢子发育时期。选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾进行低温预处理，花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理12小时。

2）培养基制备：培养基所用基本培养基为MS培养基，所用碳源为蔗糖，凝固剂为琼脂。培养基的组成成分为：MS+0.4mg/L2, 4-D+2.0mg/LKT+3%蔗糖+7%琼脂。

2）花蕾消毒：对预处理后的花蕾进行消毒，先用流水冲洗20分钟，再用75％的酒精表面消毒30秒，之后用7％的次氯酸钠消毒10~15分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次3分钟。

3）花药接种和培养：在无菌滤纸上用无菌的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花药柄去除干净，每一培养皿放入10~12枚花药。花药接种后，在36℃黑暗条件下热激处理3-7天，可观察到花药膨大。

4）愈伤组织诱导、萌发和植株再生于光照度2000lx、光照时间12h、室温25~28℃下继续培养三周后，可陆续观察到愈伤组织的出现。之后，将愈伤组织转到分化培养基和再生培养基中培养，直至形成根、芽、叶俱全的完整植株。

有益效果

1、本发明是建立在对茄子花药培养影响因素包括基因型、取蕾时期、温度处理和培养基成分等系统研究工作基础上的。通过愈伤组织发生途径获得花药培养再生植株。与已有技术相比，利用本发明培养基进行茄子花药培养的方法具有愈伤组织诱导率高、培养周期短的优点，愈伤组织诱导率在50%~80%之间,幼苗的移栽成活率达到93.2%。

2、花药具有取材方便、结构简单、基因型丰富等优点，对花药进行离体培养可以准确地控制雄核发育条件和研究雄核发育机制，以及可以快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料。同时，通过花药培养可以进行优良茄子无性系变异材料的筛选，创制新的种质资源。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法简便，易于操作和实际应用。

四、附图说明

图1 刚接种的茄子花药

图2 膨大的茄子花药

图3产生愈伤组织的茄子花药

图4 愈伤组织分化出茄子芽苗

图5 根芽叶俱全的再生植株

图6 诱导茄子花药形成愈伤组织流程图

五、具体实施方式

本实例以茄子苏崎3号和苏崎4号（种子公司购买）为材料，具体实施过程如下：

1、在盛花期于晴天上午8：00～9：00从健壮植株上取花蕾。采用显微镜镜检的方法鉴定小孢子发育时期：将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴少许去离子水浸没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在OLYMPUS显微镜下鉴定小孢子发育时期。选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾用于花药培养。

2、将小孢子发育处于单核靠边期的花蕾置于4℃低温冰箱预处理12小时。

3、将预处理后的花蕾进行消毒：先用流水冲洗20分钟，再用75％的酒精表面消毒30秒，之后用7％的次氯酸钠消毒10~15分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次3分钟。

4、在无菌滤纸上用无菌的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花药柄去除干净，接种在MS+0.4mg/L2，4-D+2.0mg/LKT+3%蔗糖+7%琼脂的培养基上。每一培养皿放入10~12枚花药（图1）。

5、花药接种后，在36℃黑暗条件下热激处理3-7天，可观察到花药膨大（图2）。

6、后于光照度2000lx、光照时间12h、室温25~28℃下继续培养三周后，可陆续观察到愈伤组织的出现，愈伤组织诱导率在50%~80%之间（图3）。之后，将愈伤组织转到分化培养基:MS+0.01mg/LNAA+2.5mg/L6-BA+2%蔗糖+6%琼脂中（图4），每20天继代一次，当芽苗长到2~3厘米时，转入再生培养基:1/2MS+0.2mg/LIBA+3%蔗糖+5.5%琼脂中培养，15~20天后有不定根出现，继续培养直至形成根、芽、叶俱全的完整植株幼苗（图5）,幼苗的移栽成活率93.2%。

Claims

1.一种诱导茄子花药形成愈伤组织的方法，包括：

1）在茄子盛花期于晴天上午8：00～9：00从健壮植株上取花蕾，选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾用于花药培养；

2）将小孢子发育处于单核靠边期的花蕾置于4℃低温冰箱预处理12小时；

3）将预处理后的花蕾进行消毒：先用流水冲洗20分钟，再用体积比为75％的酒精表面消毒30秒，之后用质量体积比为7％的次氯酸钠消毒10~15分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次3分钟；

4）在无菌滤纸上用无菌的镊子剥取花药，花药柄去除，接种在MS+0.4mg/L 2，4-D+2.0mg/L KT+质量体积比3%蔗糖+质量体积比7%琼脂的培养基上；

5）花药接种后，在36℃黑暗条件下热激处理3-7天，观察到花药膨大；

6）于光照度2000lx、光照时间12h、室温25~28℃下继续培养三周后，得到愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述接种方法为每一培养皿放入10~12枚花药。