CN114717355A - 一种西瓜全基因组SNP-Panel - Google Patents

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Abstract

本发明属于西瓜分子育种技术领域，具体公开了一种西瓜全基因组SNP‑Panel，包含722个均匀覆盖西瓜全基因组的SNP标记及其位点信息，且涉及的每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点用于检测该位点的等位基因变化。722个SNP位点最高可达到同时进行10000个样品的检测。针对每一个SNP标记有一对相对应的特殊的引物，且引物通过多重PCR和高通量测序技术进行高通量检测获得DNA序列数据，并自动化完成指定的数据分析得出相应的基因型数据。该SNP标记可用于西瓜遗传背景鉴定、种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种等应用。利用该技术可实现分子育种领域的基因检测及分析需求，检测覆盖度广，分析速度快，检测成本低，大幅度提高我国西瓜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展。

Description

一种西瓜全基因组SNP-Panel
技术领域
本发明属于西瓜分子育种技术领域，特别是关于一种西瓜全基因组 SNP-Panel。
背景技术
用传统育种方法培育一个品种，通常时间长、工作量大、效率低。近年来，基因组测序技术的飞速发展极大地提高了分子标记开发效率，大量与基因紧密连锁标记或功能分子标记被开发，进而推动了分子标记辅助选择技术在育种中的广泛应用，从而极大地提升了育种效率和质量。分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有准确、所需时间短、效率高、不受环境条件干扰的优点。分子设计育种技术将实现对农艺性状的精确改良，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向。
西瓜全基因组SNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现西瓜分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国西瓜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；通过西瓜SNP-Panel的技术开发积累，相关技术还可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种；满足不同物种的分子育种需求，加快优质品种的开发时间，满足人民对生活物质“量”和“质”的需求。
目前分子标记辅助育种的技术有SSR/InDel、KASP和基因芯片， SSR/InDel和KASP可用的标记少，单价高，不适合全基因组范围的分子标记辅助育种；在国际上，以先正达公司为首的种业巨头早已实现玉米、大豆、西瓜等多种作物的分子育种，并育成一系列优质抗病农作物新品种。然而，我国的优质抗病高端农作物种子大部分依赖进口，国内种业公司的研发能力和育种技术也远远落后于国外，鉴于当前的国际形势，不利于国内育种的安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西瓜全基因组SNP-Panel，其能够满足个性化需求的全基因组水平的分子标记育种技术。
本发明提供了一种西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，包含722个均匀覆盖西瓜全基因组的SNP标记及其位点信息，且涉及的每个SNP标记位点包含两个不同碱基变异位点，用于检测位点的等位基因变化。
优选地，722个所述SNP标记的序列为ID号Cla97001至Cla97722的 primer。
优选地，722个所述SNP标记在染色体上的分布如下：Chr01染色体71 个SNPs；Chr02染色体75个SNPs；Chr03染色体65个SNPs；Chr04染色体 49个SNPs；Chr05染色体76个SNPs；Chr06染色体64个SNPs；Chr07染色体65个SNPs；Chr08染色体57个SNPs；Chr09染色体76个SNPs；Chr10 染色体65个SNPs；Chr11染色体59个SNPs；平均每条染色体65.66个SNPs；标记密度504.43Kb。
优选地，722个所述SNP标记包括目标性状基因和一套背景选择标记。
优选地，每个所述SNP标记设有一对相对应的特异扩增引物，每一个SNP 标记仅对应1个正向引物和一个反向引物，且所有722个SNP的所有引物间无重复。
优选地，所述SNP-Panel用于同时检测1000个西瓜DNA样品。
与现有技术相比，根据本发明的一种西瓜全基因组SNP-Panel，包含722 个均匀覆盖西瓜全基因组的SNP标记及其位点信息，且涉及的每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点用于检测该位点的等位基因变化。722个SNP位点最高可达到同时进行10000个样品的检测。针对每一个SNP标记有一对相对应的特殊的引物，且引物通过多重PCR和高通量测序技术进行高通量检测获得DNA序列数据，并自动化完成指定的数据分析得出相应的基因型数据。该方法可用于西瓜遗传背景鉴定、种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种等应用。利用该技术可实现分子育种领域的基因检测及分析需求，检测覆盖度广，分析速度快，检测成本低，大幅度提高我国西瓜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的722个SNP在西瓜基因组上的分布情况示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
如图1所示，本发明实施例提供了一种西瓜全基因组SNP-Panel，包含722 个均匀覆盖西瓜全基因组的SNP标记及其位点信息，且涉及的每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点用于检测该位点的等位基因变化。722个SNP位点最高可达到同时进行10000个样品的检测。针对每一个SNP标记有一对相对应的特殊的引物，且引物通过多重PCR和高通量测序技术进行高通量检测获得DNA序列数据，并自动化完成指定的数据分析得出相应的基因型数据。该方法可用于西瓜遗传背景鉴定、种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种等应用。利用该技术可实现分子育种领域的基因检测及分析需求，检测覆盖度广，分析速度快，检测成本低，大幅度提高我国西瓜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展。
具体地：
1.基于全基因组重测序鉴定到的大量SNP标记，在西瓜基因组上均匀挑选出的1000个左右SNPs，然后使用Primer3软件设计扩增引物并使用ePCR 软件检测引物的特异性，最后挑选出检测每个SNP标记的特异引物。
2.结合多重PCR技术和第二代测序技术，高通量、低成本地获得包含每个SNP位点的PCR产物序列。具体来说，首先使用特异引物扩增目标SNP 位点，然后添加测序接头，即可完成二代测序文库的构建，最后在illumina 测序仪上完成PE150测序获得序列数据。
3.开发专门的生物信息学分析软件，自动化完成数据分析，得到各样品的基因型，指导客户进行育种选择。
实施例一，西瓜基因组DNA的提取
1.选取水稻组织，优选幼嫩组织，包括干种子、新鲜叶片、幼穗老叶、幼苗或幼嫩茎段；
2.试剂配制：CTAB缓冲液，包括2％CTAB，1.4M NaCl，lOOmM Tris-HCl， lOmMEDTA，pH＝8.0；洗涤缓冲液，包括76％乙醇，lOmM乙酸铵；TE缓冲液，包括20mM Tris-HCl,lmM EDTA，pH8.O；冰无水乙醇，将无水乙醇预先存放于-20℃，存放时间大于1小时。
3.使用CTAB法提取水稻组织中的DNA：将取自西瓜的组织剪碎，并在液氮环境中研磨；加入与组织的量相当的预热CTAB，并迅速置于65℃水浴，水浴30min至lh，每隔5分钟摇动一次，其中，优选水浴1小时；4℃， 12000rpm/min离心lOmin后，移出上清并加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀；4℃,12000rpm/min离心15min后，移出上清并加入两倍体积冰无水乙醇，于-20℃放置30min以上，优选为lh；4℃，12000rpm/min离心lOmin后，弃上清，沉淀经洗涤缓冲液洗涤后风干；加入50μL至lOOμL的TE缓冲液，充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测浓度和纯度；将检测后的DNA保存于-20℃。
实施例二，设计得到特定SNP标记的扩增引物。
1.SNP标记的选择，基于西瓜重测序结果分析全基因组SNP和已报道的已克隆西瓜重要功能基因，通过按每0.5Mb距离选择1个SNP变异，获得全基因组上的大量SNP标记，其中所述均匀分布于西瓜基因组上的大量SNP标记的数量为1000或1000以上；
2.扩增引物设计，经过序列比对、分析和拼接后，将基因组数据转换为数据库文件后，使用Primer3进行扩增引物的批量设计，并使用NCBI-ePCR 程序对SNP标记的扩增引物逐一测试，筛选只能扩增出含有SNP标记的单一条带，并将该SNP标记定位于模板所在染色体位点，最终得到本发明中722 个SNP标记的扩增引物对，该每一引物对仅对应一个SNP标记，且引物对与引物对之间无重复，参见表1：
表1 722个SNP标记引物
Figure BDA0003631448290000051
Figure BDA0003631448290000061
Figure BDA0003631448290000071
Figure BDA0003631448290000081
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Figure BDA0003631448290000101
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Figure BDA0003631448290000131
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Figure BDA0003631448290000161
Figure BDA0003631448290000171
Figure BDA0003631448290000181
Figure BDA0003631448290000191
Figure BDA0003631448290000201
Figure BDA0003631448290000211
3.扩增引物验证，随机选择10对引物合成，其中每对引物特异性扩增一个SNP标记，为一个引物对，然后通过实时荧光定量PCR扩增验证，包括以下步骤：
1)配制PCR反应体系，该体系为20μL体系，包括：2μL上述提取的水稻基因组DNA、2.5mMdNTP混合物、lμL引物对、2μL扩增缓冲液、0.6μLTaqDNA 聚合酶、15mMMgC12，最后加水，补至终体积20μL；
2)PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s， 72℃延伸60s，共35个循环；72℃，延伸5min；溶解曲线段；室温保持；
3)根据溶解曲线段Tm值确认引物验证结果。
实施例三，个体楛因型的检测和分析。
1.多重PCR扩增，本发明涉及722个SNP标记的扩增，将722个SNP 标记进行组合，构成一个基因Panel，使用该722对SNP标记的扩增引物，对提取的西瓜组织DNA的目标区域进行扩增；将扩增产物酶切后添加接头，回收和纯化后选择片段，最终完成二代测序文库的构建；
2.质控与定量，包括采用凝胶电泳、实时荧光定量PCR和Agilent 2100 对构建好的文库进行质控和定量，为上机测序做准备；
3.在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据。
4.使用“MMBB-Panel“生物信息学软件进行分析，其中“MMBB-Panel”为自主开发的软件，包括：内置水稻全基因组标准序列；原始数据中正向数据集和反向数据集分离模块；测序结果比对拼接模块；SNP标记基因分型模块；分析准确率验证模块。
实施例四，西瓜全基因组SNP-Panel的育种应用。
由于西瓜全基因组SNP-Panel选取了均匀分布于基因组上的722 个SNP标记，因此标记度高，可高程度解读西瓜基因组，得到各样品的基因型，从而应用于遗传研究和育种的各个方面，为育种全过程提供支持。
1.在西瓜育种过程中鉴定各项指标的表型中的应用；
西瓜育种的核心是选择和组合合适的表型，包括但不限千：株高、叶夹角、开花时间、每株分蘖数、含油量、粒色差异、抗病、耐逆。基因型与表型有显著关联，因此通过确定基因型可预侧水稻表型，从而进行水稻的人工选择和培育。
2.在西瓜种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
种质资源是育种的基础和前提，育种首先要对种质资源有初步认识。西瓜全基因组SNP-Panel标记数目多，单次样本检测量大，具有较高的区分度，且可以很方便地对育种资源进行群体目标性状的筛选和鉴定；
西瓜全基因组SNP-Panel可标记待改良植株表型，通过与表型有显著关联的基因标记对相关品种进行精确改良，且可实现多个优良性状的聚合。
功能基因鉴定最有效的方法是功能标记，基因功能标记来源于功能基因内部直接引起表型性状变异的多态性基因序列。使用西瓜全基因组SNP-Panel 对野生型和改良型植株进行标记，比对分析两者差异，从而获得优良植株的育种方法，为育种提供辅助。另一方面，通过西瓜全基因组SNP-Panel辅助育种，在苗期即可进行基因型测定，大大缩短育种年限，提高育种选择效率。
3.在西瓜分子设计育种中的应用；
使用西瓜全基因组SNP-Panel分析优异品质的西瓜植株基因，联合抗倒伏、抗菌核病等基因，可用于植株各种性状的设计，以育成更加优质的水稻新品种。
本发明中的有益效果为：
1.由于解决了之前全基因组分子标记，成本过高不能使用的问题，同时解决了不能客户不同需求的个性化问题，该产品可以用于种质资源的DNA指纹图谱；遗传相似度分析与杂种优势群的划分；基因/QTL初步定位；GWAS 分析；全基因组分子标记辅助育种，解决重要经济性状形成与调控、经济作物对环境的响应机制及优质丰产生理基础等科学问题。
2.西瓜SNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现西瓜分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国西瓜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；该技术实施后可减少农药施用，节省人工，带动西瓜产业可持续发展，促进农业增效、农民增收；通过西瓜西瓜SNP-Panel的技术开发积累，相关技术可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种，加快优质品种的开发，满足人民对农副产品“量”和“质”的需求，为科技助力精准扶贫和实现乡村全面振兴提供强有力的技术和产业支撑。

Claims (6)

1.一种西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，包含722个均匀覆盖西瓜全基因组的SNP标记及其位点信息，且涉及的每个SNP标记位点包含两个不同碱基变异位点，用于检测位点的等位基因变化。
2.如权利要求1所述的西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，722个所述SNP标记的序列为ID号Cla97001至Cla97722的primer。
3.如权利要求1所述的西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，722个所述SNP标记在染色体上的分布如下：Chr01染色体71个SNPs；Chr02染色体75个SNPs；Chr03染色体65个SNPs；Chr04染色体49个SNPs；Chr05染色体76个SNPs；Chr06染色体64个SNPs；Chr07染色体65个SNPs；Chr08染色体57个SNPs；Chr09染色体76个SNPs；Chr10染色体65个SNPs；Chr11染色体59个SNPs；平均每条染色体65.66个SNPs；标记密度504.43Kb。
4.如权利要求1所述的西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，722个所述SNP标记包括目标性状基因和一套背景选择标记。
5.如权利要求1所述的西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，每个所述SNP标记设有一对相对应的特异扩增引物，每一个SNP标记仅对应1个正向引物和一个反向引物，且所有722个SNP的所有引物间无重复。
6.如权利要求1所述的西瓜全基因组SNP-Panel，其特征在于，所述SNP-Panel用于同时检测1000个西瓜DNA样品。
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