CN116240207A - 用于鉴别三华李和早李的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于鉴别三华李和早李的引物组及其应用。本发明的15对InDel分子标记引物序列如SEQ ID NO.1‑30所示，使用本发明的分子标记引物能够快速、准确的鉴定区分华南李中的三华李和早李类型，能够鉴定三华李和早李类型间的天然杂种，能够有效鉴别三华李类和早李类型间经人工杂交所得后代是否为真杂种。本发明的引物组在保护和利用华南李种质资源及推进华南李杂交育种工作等方面都有着重要应用价值。

Description

用于鉴别三华李和早李的引物组及其应用
技术领域
本发明属于植物分子标记开发、分子标记辅助育种及种质资源鉴定技术领域，具体涉及用于鉴别三华李和早李的引物组及其应用。
背景技术
我国是世界上最大的李生产国，华南是我国李的主要栽培区，经过长期的自然选择和人工选择形成了一个需冷量很低的华南李品种群，其成熟期比长江流域平均早1个月以上，销路广、价格高、种植效益显著。广东省是华南李的主体，不仅是现有主栽华南李品种的原产地，而且产业规模约占华南地区的70％。目前广东省规模栽培的华南李主要包括三华李(约占全省80％)和早李(约占全省15％)等类群。
华南李类群的划分主要是依据成熟时果皮果肉的颜色，三华李成熟时为红皮红肉，早李为红皮黄肉。三华李和早李在花与叶片形态等方面存在着细微的区别，但由于栽培管理条件、树龄树势、类群内细微的自然变异、个人主观经验差异等诸多因素，使得在非果实成熟期，仅凭外部形态对华南李两种主要类群种质进行区分辨识，存在一定的难度与不准确性。
三华李和早李类群在广东李主产区长期混杂种植，在不断地自然选择与人工驯化过程中存在着一定程度的基因交流，可能存在着类群之间的天然杂种。此外，三华李和早李作为在华南李产区栽培历史最长、适应性最强的主栽品种类型，分别在果肉颜色与需冷量等性状方面有各自的优势与特色，通过人工杂交的方式创制筛选杂交新品种，以综合三华李与早李的优良性状，是培育华南李优良新品种的有效途径。目前仅凭成熟期果肉颜色等有限的形态标记，难以对华南李主要类群特别是对类群间的杂交后代进行高效可靠的鉴定与区分。
分子标记是在基因水平上的标记，直接在DNA分子水平上检测遗传变异，不受组织器官种类和环境等多因素的影响。插入缺失长度多态性(Insertion-Deletion LengthPolymorphism,InDel)标记是在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，属于第三代分子标记，主要基于全基因组测序而开发，具有标记特异性高、稳定性好、检测方法简单、经济等优点。
目前关于华南李分子标记的报道较为有限，且主要为SNP类型的标记，但存在着成本高、验证困难等问题。目前尚未有华南李中InDel标记的相关报道，且未有专门针对华南李中三华李和早李两大主要类群开发设计的分子标记。因此，开发InDel等简单高效的分子标记，区分三华李与早李等华南李主要品种类群，在分子层面对类群间的杂交后代进行准确鉴定，对进一步理清华南李种质资源类型及推动华南李的杂交育种的开展，都有着迫切的实际需求与重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于鉴别三华李和早李的引物组及其应用。
本发明的第一个目的是提供用于鉴别三华李和早李的引物组，为选自如下引物对中的至少3对引物的组合；
标记P1-6的引物对：上游引物：GGACCCCATGCTGAAGAAAA(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，下游引物：CAAATCTAAGGGCAAGTCCAAT(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；
标记P1-8的引物对：上游引物：GGTTTTCTCGAAGTCGGTGAT(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)，下游引物：GGCTTGTGATATATTAGAACCCATG(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
标记P2-8的引物对：上游引物：CCTGGAACCCACGAATTTCT(核苷酸序列如SEQIDNO.5所示)，下游引物：CTTTCCTGACCAAGACAGTGTGA(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
标记P3-8的引物对：上游引物：GGGTGGTCTGGTTCCCATAA(核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)，下游引物：CATCGGCACAATAGTAGAGAAGC(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)；
标记P4-26的引物对：上游引物：ACATAGGTGGCTGTGATTACGC(核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示)，下游引物：CATGTGATGGAGGAAGTCTTGC(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；
标记P4-29的引物对：上游引物：CCAGCTCACATGCTCTTTTCC(核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示)，下游引物：GATGCCTCTCATATGCCACTTG(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)；
标记P4-30的引物对：上游引物：CGCGCGGCTATACTATTTTT(核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示)，下游引物：GATTTGGGCAACCTCTACCC(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)；
标记P4-35的引物对：上游引物：ACCACCATTTTGCCAAGAGG(核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示)，下游引物：CCCAATCTTAGACTGGCCGTA(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)；
标记P5-7的引物对：上游引物：CAACAGTCACCCCGCAATTA(核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示)，下游引物：GTCAGCATCCCATCCCAAAT(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)；
标记P5-9的引物对：上游引物：CATTCCGTGAACCAAACAGG(核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示)，下游引物：CAATGCTGCCCAAATTGCTA(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)；
标记P6-8的引物对：上游引物：TGCGACTCATCAGTTTGT(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)，下游引物：CCTTTCCCGTTCTACCAT(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)；
标记P7-10的引物对：上游引物：TCCCATGAGGAGGGAAAACA(核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示)，下游引物：AATGAGCGTGAGTATACAATTAGGC(核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)；
标记P7-11的引物对：上游引物：CCATGAGGAGGGAAAACAAAA(核苷酸序列如SEQ IDNO.25所示)，下游引物：AATGAGCGTGAGTATACAATTAGGC(核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)；
标记P7-7的引物对：上游引物：CCTTGAAAAGACAGTGAACAGCA(核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示)，下游引物：TCCAAAGCCACCATTGTAACC(核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)；
标记P8-8的引物对：上游引物：TTCAGTGCCACAACAATAGGG(核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示)，下游引物：CGACGTACCCTTGTATCCCTTA(核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示)。
优选，所述的用于鉴别三华李和早李的引物组，为选自如下(1)-(8)引物对中的至少3对引物的组合：
(1)标记P1-6或P1-8的引物对，
(2)标记P2-8的引物对，
(3)标记P3-8的引物对，
(4)标记P4-26、P4-29、P4-30或P4-35的引物对，
(5)标记P5-7或P5-9的引物对，
(6)标记P6-8的引物对，
(7)标记P7-10、P7-11或P7-7的引物对，
(8)标记P8-8的引物对。
本发明还提供一种用于鉴别三华李和早李的试剂盒，其含有所述的用于鉴别三华李和早李的引物组。
本发明还提供所述的用于鉴别三华李和早李的引物组在鉴别华南李中三华李和早李类型及两种类型间杂交后代中的应用。
本发明还提供一种鉴别三华李和早李的方法，包括以下步骤：
S1.提取待鉴别华南李叶片DNA；
S2.利用所述的引物组中的各标记引物对，以步骤S1获得的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3.结果判定：将获得的PCR产物的条带大小与对应标记的三华李、早李类群特征条带大小(见表3)进行比较，判定待鉴别李为三华李或早李类型、或为两种类型间杂交后代。
优选，所述的PCR扩增，其体系为2×Flash PCR MasterMix(Dye)5μL，上游引物10μM0.4μL，下游引物10μM0.4μL，模板DNA 1μL，加ddH2O至10μL。
优选，所述的PCR扩增，其扩增程序为：98℃预变性2min；94℃10s，55℃15s，72℃10s，34次循环；最后72℃继续延伸2min。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供了15个区分三华李、早李两类种质的InDel分子标记。
2、本发明提供了位于李8条染色体上的15对InDel标记引物组，使用时可根据需要，选择本发明中位于不同染色体上的部分或全部引物进行分子鉴定，据此鉴别华南李种质所属的类型。因华南李类型的划分主要依据果皮果肉的颜色，故依据此发明，可对处于苗期或非果实成熟期的华南李种质的果肉颜色提前做出初步的鉴别。
3、当发现有综合了三华李类和早李类形态标记特征的未知华南李种质时，可选择本发明中位于不同染色体上的部分或全部引物，对其进行分子鉴定，以鉴定其是否为三华李类和早李类华南李的天然杂交种。当对三华李类与早李类的品种或种质进行类群间种质的人工杂交时，可选择本发明中位于不同染色体上的部分或全部引物，对所得的杂交后代进行分子鉴定，以鉴别筛选所得的杂交后代是否为真杂种。
附图说明
图1为利用引物P6-8扩增‘从早一号’和‘云开一号’DNA后所得产物片段序列与参考基因组序列比对示例图。
图2为‘从早一号’和‘云开一号’种质的InDel分子标记鉴定；每对引物对应的模板依次分别是‘从早一号’三月李(早李类型)、‘云开1号’三华李(三华李类型)；M是DNAmarker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图3为12份华南李种质的InDel分子标记鉴定；1-12为对应的表1中的种质编号，M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图4为‘从早一号’、‘云开一号’和‘LT-1’3个华南李种质的InDel分子标记鉴定；每对引物对应的模板依次分别是‘从早一号’三月李(早李类型)、‘云开一号’三华李(三华李类型)及‘LT-1’；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图5为使用引物P6-8鉴定‘三华李♀×早李♂’杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图6为使用引物P6-8鉴定‘早李♀×三华李♂’杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图7为使用引物P2-8鉴定‘三华李♀×早李♂杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图8为使用引物P2-8鉴定‘早李♀×三华李♂’杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图9为使用引物P7-7鉴定‘三华李♀×早李♂’杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图10为使用引物P7-7鉴定‘早李♀×三华李♂’杂交组合所得的杂交苗；‘华’为‘云开一号’三华李(三华李类型)，‘月’为‘从早一号’三月李(早李类型)，数字为对应的杂交苗编号；M是DNA marker，条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
一、实验方法
1、实验材料
选取采集自不同地点的7份三华李种质及5份早李种质，种质材料编号及信息见表1。选取‘云开一号’(三华李类群)和‘从早1号’(早李类群)做亲本，通过人工授粉分别开展正交与反交，收集杂交后的成熟果实，去除果肉取出种子后经过催芽后繁育成苗，每株苗按顺序独立编号。
表1用于种质鉴定的三华李和三月李种质材料信息
Figure BDA0004166714070000041
Figure BDA0004166714070000051
2、李叶片基因组DNA提取方法
采集李子新萌发的嫩叶，利用改良CTAB法[2％ CTAB，1mol/L Tris-HCl(pH8.0),0.5mol/LEDTA(pH 8.0),4mol/L NaCl，β-巯基乙醇]提取其基因组DNA。
(1)取0.3g嫩叶，在陶瓷研钵中加入液氮研磨粉碎，转入2mL离心管中。65℃预热CTAB提取液。
(2)加入800μL CTAB提取液(每1mL CTAB加入1.5μL β-巯基乙醇)，震荡混匀，55℃水浴30min，每10min上下颠倒摇匀1次。
(3)冰上预冷10min，加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混匀50-100次，4℃，12000rpm离心10min。
(4)取上清液转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，即出现絮状沉淀，冰上放置10min、4℃，12000rpm离心10min。
(5)去上清液，絮状沉淀于离心管底部，用70％乙醇轻轻漂洗沉淀1次，小心倒去上清，短暂离心，弃残液，开盖37℃干燥10min。
(6)管中加入50μL ddH2O(每10μL ddH2O加入1μLRNase)，用移液器轻轻吸打溶解沉淀，充分溶解后的DNA溶液在37℃保温30min。
(7)用分光光度计检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。
3、分子标记位点的查找及PCR引物的设计
以三月李已测序的基因组序列为参考基因组Prunus salicina Sanyueli WholeGenome v2.0(https://www.rosaceae.org/Analysis/9450778)，提取‘云开一号’和‘从早一号’的叶片DNA，送交北京诺禾致源科技股份有限公司进行重测序分析。利用基因组可视化软件IGV打开两个样本重测序结果中的BAM原始数据文件，同时导入三月李的参考基因组序列文件及对应的GFF3文件。利用IGV软件的可视化功能，逐条染色体人工检查重测序所得原始数据在两份材料中的差异情况，记录具体差异区域的位置信息，利用TBtools软件中的“Fasta Extract”功能提取差异区域上下游1kb左右的序列，用Primer Premier 5软件在差异区域上下游位置设计引物，检测差异区域片段的可靠性。
4、PCR分子鉴定
PCR反应试剂选用康为世纪的2×Flash PCR MasterMix(Dye)，引物缓冲液由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR扩增体系为2×Flash PCR MasterMix(Dye)5μL，ForwardPrimer(10μM)0.4μL，Reverse Primer(10μM)0.4μL，Template DNA(约20-60ng)1μL，加ddH2O至10μL。所用的PCR扩增程序为：98℃预变性2min；94℃10s，55℃15s，72℃10s，34次循环；最后72℃继续延伸2min，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
1、三华李和早李类群种质的分子鉴定
利用IGV可视化软件，分析‘云开一号’和‘从早一号’重测序数据，找出有明显差异的区段(差异区段大小以50-1000bp之间为宜)，在差异区段上下游设计引物，从中筛选出在‘云开一号’和‘从早一号’中条带单一、大小存在明显差别、且差异条带经PCR产物测序验证无误(图1、图2)的引物对。随后利用挑选出的引物对，对全部的7种三华李及5种早李进行进一步的分子鉴定，选择在类群内条带大小一致、类群间存在明显差别的引物作为区分两类种质的InDel分子标记(图3)。根据PCR的结果，保证每条染色体上至少有一个可用的标记，实现InDel分子标记引物组覆盖华南李的全部8条染色体。InDel标记对应引物序列见表2。InDel标记对应的早李和三华李类群中特异条带大小见表3。
表2InDel标记对应的引物序列
Figure BDA0004166714070000061
表3InDel标记对应的早李和三华李类群中特异条带大小
Figure BDA0004166714070000062
其中，标记引物对应的位置如下：
标记P1-6在1号染色体48304851bp处，位于基因evm.model.Chr1.631下游3736bp；
标记P1-8在1号染色体第47980264bp处，位于基因evm.model.Chr1.677上游608bp；
标记P2-8在2号染色体第33259105bp处，位于基因evm.model.Chr2.2410内部；
标记P3-8在3号染色体第27839522bp处，位于基因evm.model.Chr3.513上游3153bp；
标记P4-26在4号染色体第24553326bp处，位于基因evm.model.Chr4.1070下游15562bp；
标记P4-29在4号染色体第22025002bp处，位于基因evm.model.Chr4.1357下游1893bp；
标记P4-30在4号染色体第18058076bp处，位于基因evm.model.Chr 4.1697上游1206bp；
标记P4-35在4号染色体第20794482bp处，位于基因evm.model.Chr4.2268上游1242bp；
标记P5-7在5号染色体第15641614bp处，位于基因evm.model.Chr5.1262上游6081bp；
标记P5-9在5号染色体第14348887bp处，位于基因evm.model.Chr5.1407上游696bp；
标记P6-8在6号染色体第34658545bp处，位于基因evm.model.Chr6.3470内部；
标记P7-7在7号染色体第9973662bp处，位于基因evm.model.Chr7.631上游58342bp；
标记P7-10在7号染色体第12448256bp处，位于基因evm.model.Chr7.776上游13785bp；
标记P7-11在7号染色体第12698176bp处，位于基因evm.model.Chr7.792下游7609bp；
标记P8-8在8号染色体第13608235bp处，位于基因evm.model.Chr8.1018上游283bp。2、三华李和早李类群间天然杂种的分子鉴定
在广州从化区吕田镇发现的一份李种质材料，其果皮果肉颜色符合三华李类特征，但叶片形态特征、果实形状、果核特征等则与早李更为相似，将其编号为‘LT-1,’推测其可能为三华李类群与早李类群的天然杂交种。利用能区分华南李两类种质的InDel分子标记，对‘LT-1’进行分子鉴定，以分属三华李和早李类型的‘云开一号’三华李和‘从早一号’三月李种质为对照，统计每对引物经PCR扩增后的条带特征。结果(图4)显示，在利用多对引物进行PCR鉴定时，‘LT-1’种质同时有三华李类和早李类的特异条带，表现为双条带的特征；‘LT-1’种质经P4-29引物扩增出的单条带表现为三华李类特征条带，与其他引物均扩增出早李类条带的结果不同。以上结果可表明，‘LT-1’种质为三华李类和早李类华南李的天然杂种。
3、三华李和早李类群间人工杂交种质的分子鉴定
随机挑选位于3个不同染色体上的3个标记(P6-8、P2-8、P7-7)，对三华李和早李类群作为杂交亲本，分别进行正交和反交人工授粉所培育的杂交苗进行真假杂种鉴定。杂交苗的PCR鉴定结果中(图5-图10)，若包含父母本双亲的特征条带，表现为典型的双条带的，或者出现父本特异条带的，则可认为其为真杂种；若3对标记的PCR结果中均显示为母本特征条带的，则认为其为假杂种。故‘三华李♀×三月李♂’杂交组合的后代杂交苗鉴定中，1号-10号、12号、14号、16号-26号、28号-30号、32号-38号、40号、43号-44号、50号、51号-53号、55号-58号为真杂交种。而在‘三月李♀×三华李♂’杂交组合的后代杂交苗鉴定中，1号-5号、7号-27号为真杂交种。

Claims (7)

1.用于鉴别三华李和早李的引物组，其特征在于，为选自如下引物对中的至少3对引物的组合；
标记P1-6的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
标记P1-8的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
标记P2-8的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
标记P3-8的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
标记P4-26的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
标记P4-29的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
标记P4-30的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
标记P4-35的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
标记P5-7的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
标记P5-9的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
标记P6-8的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
标记P7-10的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
标记P7-11的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
标记P7-7的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
标记P8-8的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别三华李和早李的引物组，其特征在于，为选自如下(1)-(8)引物对中的至少3对引物的组合：
(1)标记P1-6或P1-8的引物对，
(2)标记P2-8的引物对，
(3)标记P3-8的引物对，
(4)标记P4-26、P4-29、P4-30或P4-35的引物对，
(5)标记P5-7或P5-9的引物对，
(6)标记P6-8的引物对，
(7)标记P7-10、P7-11或P7-7的引物对，
(8)标记P8-8的引物对。
3.一种用于鉴别三华李和早李的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的用于鉴别三华李和早李的引物组。
4.权利要求1所述的用于鉴别三华李和早李的引物组在鉴别华南李中三华李和早李类型及两种类型间杂交后代中的应用。
5.一种鉴别三华李和早李的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待鉴别华南李叶片DNA；
S2.利用权利要求1所述的引物组中的各标记引物对，以步骤S1获得的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3.结果判定：将获得的PCR产物的条带大小与对应标记的三华李、早李类群特征条带大小进行比较，判定待鉴别李为三华李或早李类型、或为两种类型间杂交后代。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其体系为2×Flash PCRMasterMix(Dye)5μL，上游引物10μM 0.4μL，下游引物10μM0.4μL，模板DNA 1μL，加ddH2O至10μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其扩增程序为：98℃预变性2min；94℃10s，55℃15s，72℃10s，34次循环；最后72℃继续延伸2min。
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