CN116121438B - 一种鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的分子标记引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用。本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树基因组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认标记M32359、M5268和M1060的核心引物能够分别对养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’扩增出二条特异性条带、三条特异性条带和三条特异性条带，可以分别从养蚕叶用桑品系中鉴别出养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’。本发明通过直接检测‘粤桑162’的M32359标记和/或M5268标记和/或M1060标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。
Description
技术领域
本发明涉及到品种资源的鉴定和种质创新技术领域，具体涉及养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的分子标记引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
我国是世界第一蚕桑生产大国，蚕茧产量占世界总量的70％，生丝产量占60％。丝织品是我国传统的出口创汇产品，行销世界五大洲，销量占世界总量的75％。目前全国有27个省(市、区)有蚕桑生产，年饲养蚕种2000多万张，鲜茧产量约80万吨，桑园总面积约1300万亩，其中华南蚕区的广东、广西2省(区)，现有桑园面积300多万亩，占全国桑园总面积25％以上。华南蚕区为热带亚热带季风气候区，年气温高，降雨量多，桑树生长期长，一年可多次采叶，多批养蚕，是我国最大的蚕茧生产基地。但目前华南蚕区现行的桑品种产量和品质都有待提高，因此要提高亩桑经济效益，必须加快选育和推广桑树新品种的应用。
‘粤桑162’是由广东桑种(Morus atropurpurea Roxb.)资源‘塘10’为母本，‘伦109’为父本，杂交后经过多倍体诱导，定向培育而成的多倍体养蚕叶用桑新品种，该品种具有产量高、发条数多，耐剪伐，可全年收获条桑进行条桑育养蚕等特性，可适应华南地区蚕桑产业发展新的需求。该品种于2017年5月通过农业农村部品种保护办公室审查登记，授予植物新品种权(CNACNA20140728.1)。其特征在于：植株发芽期早，花性为雄花株，幼叶花青甙显色弱，顶端叶着生姿态斜上，叶柄着生姿态上举；植株叶片长心脏形，叶面皱缩程度弱，夜尖长尾，叶基肾形，叶缘粗圆齿；枝条皮色灰褐色，节间直，叶序为1/3叶序；冬芽形状为正三角，冬芽着生姿态腹离。‘粤桑162’经多地引种生产实践证明，该品种产量高，叶片大，叶质较优，成林桑园每亩年产叶3000～3800kg，桑叶含粗蛋白质21.1～25.6％，可溶性糖7.1～8％；经养蚕鉴定，万头茧层量3.94kg，壮蚕100kg叶产量7.62kg；该品种易感青枯病，耐寒性较弱，抗旱性中等。适合于珠江流域及长江以南等热带、亚热带地区各种土壤类型种植，具有极高的推广应用价值。
‘粤桑162’是近年来新育成并获得国家植物新品种授权的用无性繁殖的多倍体养蚕叶用桑新品种，因其具有的产量高、品质优的特点，近年来各地已出现用其他品种假冒该品种销售现象，但因无性繁殖苗期外部形态特征难以区分辨别品种的真实性，难以有效的监督和仲裁，给该品种的开发利用带来了较大的影响。因此需找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分该品种的简单、快速和有效的鉴别技术非常急需。
传统的养蚕叶用桑新品种鉴定主要是以表型性状为基础，受环境影响较大、稳定性差、测试周期长，严重影响了新品种鉴定的有效性和权威性。分子标记技术因其具有多态性高、测试周期短、不受环境影响等特性，成为品种鉴定和保护的未来发展方向。其中简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)具有共显性、重复性好、易检测、操作简单等优点，因此，SSR分子标记在养蚕叶用桑新品种特异性评价与保护中具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是一种鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的分子标记引物组、试剂盒及其应用，其操作简单，可用于养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’真实性的鉴定，当出现品种假冒或有争议时可以有效的监督和仲裁。
本发明的第一个目的是提供一种鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的SSR分子标记，包括SSR分子标记M32359和/或M5268和/或M1060；
所述的SSR分子标记M32359的重复基序为(TTC)n，其中n≥7，其右侧序列如SEQ IDNO.8所示，其左侧序列如SEQ ID NO.7所示；所述的SSR分子标记M5268的重复基序为(CTC)n，其中n≥6，其右侧序列如SEQ ID NO.10所示，其左侧序列如SEQ ID NO.9所示；所述的SSR分子标记M1060的重复基序为(TGC)n，其中n≥5，其右侧序列如SEQ ID NO.12所示，其左侧序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的SSR分子标记的核心引物组，包括针对SSR分子标记M32359的引物和/或针对SSR分子标记M5268的引物和/或针对SSR分子标记M1060的引物：
所述的针对SSR分子标记M32359的引物：
M32359-F：5’-GCTTCTAGAACCCAAGGATCTTC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
M32359-R：5’-GAGCTTCGGAATAACAGCGTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的引物M32359-F的5’端标记有荧光报告基团；
所述的针对SSR分子标记M5268的引物：
M5268-F：5’-ACACTCTCCATAGTACTCGCCAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
M5268-R：5’-TCGGGAAGAGAAATGGGTC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
所述的引物M5268-F的5’端标记有荧光报告基团。
所述的针对SSR分子标记M1060的引物：
M1060F：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGTT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
M1060-R：5’-CATGCAAATTAACGACAATGGTA-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
所述的引物M1060-F的5’端标记有荧光报告基团。
优选，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
本发明的第三个目的是提供一种养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的快速检测试剂盒，包括上述的SSR分子标记的核心引物组。
优选，所述的快速检测试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和ddH2O。
本发明的第四个目的是提供一种利用SSR分子标记鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测养蚕叶用桑样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的引物对M32359-F/M32359-R和/或M5268-F/M5268-R和/或M1060-F/M1060-R进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)中的PCR扩增产物进行分型，对分型结果进行条带判别；若以引物对M32359-F/M32359-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有115bp和124bp二条特异性条带，以引物对M5268-F/M5268-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108bp、117bp和123bp三条特异性条带，以引物对M1060-F/M1060-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有140bp、143bp和146bp三条特异性条带，则表明待测样品为养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’，否则，则表明待测样品为非养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’。
优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，包括：50ng/μL DNA模板0.5μL、10×PCR buffer 2μL、25mM MgCl2 2μL、10mM dNTPs 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL和ddH2O 13.8μL。
优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。
本发明的第五个目的是提供上述的SSR分子标记或SSR分子标记的核心引物组或快速检测试剂盒在鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’中的应用。
本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树转录组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认SSR分子标记M32359的核心引物M32359-F/M32359-R能够对养蚕叶用桑新品种’粤桑162’扩增得到的PCR扩增产物只有115bp和124bp二条特异性条带，以引物对M5268-F/M5268-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108bp、117bp和123bp三条特异性条带，以引物对M1060-F/M1060-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有140bp、143bp和146bp三条特异性条带，则表明待测样品为养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’，否则，则表明待测样品为非养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’，可以分别从叶用桑品系(尤其是广东桑种)中鉴别出新品种‘粤桑162’，可用于新品种‘粤桑162’的快速鉴定和检测。本发明通过大量实验数据得到了扩增出‘粤桑162’特异性条带的特异性引物，通过直接检测‘粤桑162’的M32359标记和/或M5268和/或M1060标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。
附图说明
图1为SSR分子标记M32359核心引物扩增‘粤桑162’及38个亲缘、表型相近的养蚕叶用桑品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤桑162、S2为塘10(母本)、S3为伦109(父本)、S4为Tang7、S5为Tang11、S6为Tang12、S7为Tang14、S8为Tang15、S9为Lun408、S10为Lun439、S11为Lun518、S12为Lun540、S13为Lun602、S14为Miao15、S15为Miao33、S16为Miao60、S17为Miao61、S18为Xuan26、S19为Hxuan4、S20为Hxuan9、S21为Guang1、S22为Guang6、S23为Guang7、S24为Xinza3、S25为Xinza6、S26为Xinza9、S27为Bei1、S28为Bei7、S29为Za10、S30为Za12、S31为Shang1、S32为Shang2、S33为Nanjiang1、S34为Nanjiang3、S35为Nanjiang4、S36为Ding28、S37为Shi11、S38为Shi12、S39为Zi1。
图2为SSR分子标记M32359核心引物扩增30个育成的养蚕叶用桑新品种、果叶两用品种、生产推广应用新品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤桑162、S2为伦教40号、S3为抗青10号、S4为试11、S5为农桑10号、S6为农桑12号、S7为农桑14号、S8为何叶白、S9为育2号、S10为育71-1、S11为强桑1号、S12为粤椹74、S13为鄂桑2号、S14为鄂桑1号红、S15为云桑798号、S16为粤椹大10、S17为粤椹74、S18为粤椹28、S19为红果2号、S20为云桑1号、S21为云桑2号、S22为嘉陵30、S23为粤桑69、S24为粤桑78、S25为强桑5号、S26为粤椹12、S27为粤椹143、S28为粤椹145、S29为粤椹20、S30为抗青283。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段和功效，以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’特异性引物序列的筛选获得
1、SSR引物选择
利用MISA软件对桑树基因组数据库中的基因组序列进行检索，检索出基因组序列中SSR位点，检索的SSR基序重复单元长度为2～6个核苷酸，分别设置2个、3个、4个、5个、6个核苷酸的最少搜索重复次数为6、5、5、4、4次，且SSR位点侧翼序列的长度≥150bp，根据搜索到的SSR位点用Primer3v2.3.4(http://primer3.sourcego-rge.net)软件设计SSR引物，设计标准为：引物长度为18-25bp，退火温度为57-63℃，GC含量为40-70％，PCR产物的长度为100-300bp，随机选取能与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对的SSR位点合成出300对引物，每对引物由一个上游引物A和一个下游引物B组成。引物序列由深圳华大基因科技有限公司合成。
2、养蚕叶用桑新品种DNA的提取
以养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’、母本‘塘10’、父本‘伦109’及36个亲缘、表型相近的同桑种种质资源与创制叶用桑品系，共39个(序号1-39，其中包括具有‘粤桑162’亲本血统的10个创制叶用桑品系，这10个叶用桑品系与‘粤桑162’亲缘关系较近；其余26份种质资源与‘粤桑162’叶片、枝条等性状表型相近)进行初步筛选。初步筛选所用的种质资源与创制叶用桑品系具体见表1(取自国家桑树种质资源圃-华南分圃)。
表1初步筛选所用的39个亲缘、表型相近的种质资源与创制叶用桑品系
具体筛选步骤如下：
利用改良的CTAB法提取养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’及同为广东桑种的其他38个亲缘、表型相近的种质资源与创制养蚕叶用桑品系(见表1)的DNA，DNA提取具体步骤如下：
(1)配制CTAB提取液(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)的配方为：2％CTAB，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)；
(2)将1g材料(尽量选取幼嫩材料)放入研钵中，液氮研磨至粉末；
(3)将研磨后的材料加入10mL离心管中，加入4mL CTAB提取液和80μLβ-巯基乙醇(已在65℃中预热)混匀后65℃水浴45min，中间混匀3～4次；
(4)加入1mL 5M KAc，冰浴20min；
(5)加入4mL氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀乳化10min；
(6)室温下12000rpm离心10min，离心后将上清液转移至一新的10mL离心管中；
(7)取上清液并加入1/10～1/5体积的3M NaAc(pH 5.2)翻转混匀，加入等体积的异丙醇，混匀至出现DNA沉淀；
(8)沉淀中加入1mL 75％乙醇漂洗3～4次，并用无水乙醇漂洗1次；DNA沉淀，晾干；
(9)加入100μL含10μg/ml RNase A的TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA；
(10)用电泳法检测质量，用分光光度计法检测DNA浓度，调节DNA浓度为50ng/μL，保存于-20℃。
3、PCR扩增
以步骤2提取的桑树基因组DNA为模版，利用SSR荧光标记检测技术进行PCR扩增，引物包括一个5’端标记有荧光报告基团(FAM、HEX、TAMRA、或ROX，本发明中使用HEX荧光标记)的上游引物和一个下游引物，所述上游引物为在步骤1设计合成的上游引物，所述下游引物为步骤1设计合成的下游引物。5’端标记有荧光报告基团的上游引物引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。
PCR反应总体系为20μL，其中，50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer 2.0μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ddH2O 13.8μL。
PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，得到扩增产物。
4、多态性引物的筛选
上述步骤3扩增产物取2.5μL，加入1.5μL Loading Buffer混匀上样，2％的琼脂糖凝胶电泳25min后进行条带检测，筛选有扩增条带的产物用于测序分型。将上述步骤筛选到的有扩增产物条带的产物稀释到0.5ng以内，取0.5μL至含有liz500的Hidi中，用3730XLDNA测序仪(ABI，USA)进行分型，分型结果用GeneMarker(soft Genetics LLC，USA)进行条带判别。
5、数据分析
筛选结果显示，上述步骤1合成的300对引物中共筛选出153对多态性引物；进一步选择重复性、稳定性好，能够对养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’扩增出特异性等位位点的核心引物，最终得到引物对M32359-F/M32359-R(M32359-F：5’-GCTTCTAGAACCCAAGGATCTTC-3’，如SEQ ID NO.1所示，M32359-R：5’-GAGCTTCGGAATAACAGCGTC-3’，如SEQ ID NO.2所示)、引物对M5268-F/M5268-R(M5268-F：5’-ACACTCTCCATAGTACTCGCCAC-3’，如SEQ ID NO.3所示，M5268-R：5’-TCGGGAAGAGAAATGGGTC-3’，如SEQ ID NO.4所示)和引物对M1060-F/M1060-R(M1060-F：CTGCTGTTGTTGCTGCTGTT-3’，如SEQ ID NO.5所示，M1060-R：5’-CATGCAAATTAACGACAATGGTA-3’，如SEQ ID NO.6所示)可作为鉴定’粤桑162’的特异性核心引物。核心引物M32359-F/M32359-R对应的SSR分子标记为M32359标记，其重复基序为(TTC)n，n≥7，该M32359标记的左侧序列如SEQ ID NO.7所示，右侧序列如SEQ ID NO.8所示。核心引物M5268-F/M5268-R对应的SSR分子标记为M5268标记，其重复基序为(CTC)n，n≥6，该M5268标记的左侧序列如SEQ ID NO.9所示，右侧序列如SEQ ID NO.10所示。核心引物M1060-F/M1060-R对应的SSR分子标记为M1060标记，其重复基序为(TGC)n，n≥5，该M1060标记的左侧序列如SEQ ID NO.11所示，右侧序列如SEQ ID NO.12所示。
以SSR荧光标记引物M32359-F/M32359-R为引物，养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’在M32359标记的扩增产物为115bp(如SEQ ID NO.13所示)和124bp(如SEQ ID NO.14所示)二条特异性条带；以SSR荧光标记引物M5268-F/M5268-R为引物，养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’在M5268标记的扩增产物为108bp(如SEQ ID NO.15所示)、117bp(如SEQ ID NO.16所示)和123bp(如SEQ ID NO.17所示)三条特异性条带；；以SSR荧光标记引物M1060-F/M1060-R为引物，养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’在M1060标记的扩增产物为140bp(如SEQ ID NO.18所示)、143bp(如SEQ ID NO.19所示)和146bp(如SEQ ID NO.20所示)三条特异性条带。用SSR荧光标记引物M32359-F/M32359-R一组引物对可把‘粤桑162’从其“塘10”(母本)外的其他38个亲缘、表型相近的种质资源与创制养蚕叶用桑品系中鉴别出(图1)，指纹数据见表2；用SSR荧光标记引物M5268-F/M5268-R和M1060-F/M1060-R中任一组引物对均可把‘粤桑162’从其38个亲缘、表型相近的种质资源与创制养蚕叶用桑品系中鉴别出，指纹数据见表2。
表2 3对引物分别对39份亲缘、表型相近的种质与创制品系毛细管电泳条带统计
6、引物的进一步验证
对筛选得到3对鉴定‘粤桑162’的特异性核心引物M32359-F/M32359-R、M5268-F/M5268-R和M1060-F/M1060-R进行进一步地验证，选取30个目前全国育成的养蚕叶用桑、果叶两用桑树新品种及在生产上具有一定面推广应用的叶用桑品系与‘粤桑162’同时进行扩增检测，DNA提取、扩增及检测方法同上，结果发现，这3对特异性核心引物均可以将‘粤桑162’与其他品种区分开，‘粤桑162’及其他品种的扩增特异性等位位点如表3所示。
表3验证所用育成的养蚕叶用桑新品种、生产推广应用新品系毛细管电泳条带统计
说明书
由上述图2和表3结果可以看出，SSR分子标记M32359、M5268和M32359均具有高度的多态性，均能够快速的从38个亲缘、表型相近的养蚕叶用桑品系和30个育成的养蚕叶用桑新品种、生产推广应用新品系中准确鉴定出‘粤桑162’。但考虑到未来可能会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上3对SSR分子标记的核心引物同时进行检测，若3对SSR荧光标记引物扩增得到的结果与本发明一致，则可以鉴定该品种为桑果新品种‘粤桑162’。
在获取鉴定‘粤桑162’特异性分子标记的过程中，本发明首先重视了引物的获取，从桑树基因组数据库中随机设计获取了300对SSR引物，以便客观的评价品种特性。引物筛选时对养蚕叶用桑品系做了适当选取，首先用38个亲缘、表型相近的养蚕叶用桑品系进行初步筛选，这些品系与‘粤桑162’在表型性状上较相似，通过表型鉴定存在一定困难，因此在这些品系中筛选得到能够对养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’扩增出特异性条带的特异性核心引物具有十分重要的意义。在初步筛选获得特异性核心引物的基础上，通过选取30个育成的养蚕叶用桑新品种、果叶两用新品种及生产推广应用新品系进行验证，带型结果与前面表现一致，能够快速准确的从中鉴定出‘粤桑162’，表明这对引物其特异性和稳定性较好。
上述方法中采用特异性核心引物M32359-F/M32359-R、M5268-F/M5268-R和M1060-F/M1060-R为‘粤桑162’的快速、准确检测、鉴定提供了较好的保障。
上述特异性核心引物M32359-F/M32359-R、M5268-F/M5268-R和M1060-F/M1060-R也可直接作为快速检测试剂盒的一部分，用于快速鉴定桑果新品种‘粤桑162’。
SEQ ID NO.13：
GCTTCTAGAACCCAAGGATCTTCACCGGCCACGGCGATCGTCATCGCCGGCGACGAGGACTGTGTGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGAGAAGCGACGCTGTTATTCCGAAGCTC
SEQ ID NO.14
GCTTCTAGAACCCAAGGATCTTCACCGGCCACGGCGATCGTCATCGCCGGCGACGAGGACTGTGTGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGAGAAGCGACGCTGTTATTCCGAAGCTC
SEQ ID NO.15：
ACACTCTCCATAGTACTCGCCACGTCCTTATCTTCTTCCTCGCCCTCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAAGTCCCCTCCCCCCTCCCGCCCCGACCCATTTCTCTTCCCGA
SEQ ID NO.16：
ACACTCTCCATAGTACTCGCCACGTCCTTATCTTCTTCCTCGCCCTCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAAGTCCCCTCCCCCCTCCCGCCCCGACCCATTTCTCTTCCCGA
SEQ ID NO.17：
ACACTCTCCATAGTACTCGCCACGTCCTTATCTTCTTCCTCGCCCTCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAAGTCCCCTCCCCCCTCCCGCCCCGACCCATTTCTCTTCCCGA
SEQ ID NO.18：
CTGCTGTTGTTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGCGGAGCCTCCGTTTTGTCCTCCGCCTTTTCCTTGGTTGTTGTTATTGCCAACCTTTTGACCCTTGTTGTTGTTGTTTCCACCTTTACCATTGTCGTTAATTTGCATG
SEQ ID NO.19：
CTGCTGTTGTTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGAGCCTCCGTTTTGTCCTCCGCCTTTTCCTTGGTTGTTGTTATTGCCAACCTTTTGACCCTTGTTGTTGTTGTTTCCACCTTTACCATTGTCGTTAATTTGCATG
SEQ ID NO.20：
CTGCTGTTGTTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGAGCCTCCGTTTTGTCCTCCGCCTTTTCCTTGGTTGTTGTTATTGCCAACCTTTTGACCCTTGTTGTTGTTGTTTCCACCTTTACCATTGTCGTTAATTTGCATG
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
需要特别说明的是，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的SSR分子标记，其特征在于，包括SSR分子标记M5268和M1060中的一种或两种；所述的SSR分子标记M5268的重复基序为(CTC)n，其中n＝6、9和11，其右侧序列如SEQ ID NO.10所示，其左侧序列如SEQ ID NO.9所示；所述的SSR分子标记M1060的重复基序为(TGC)n，其中n＝5、6和7，其右侧序列如SEQ ID NO.12所示，其左侧序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种用于鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，包括针对权利要求1所述的SSR分子标记M5268的引物和SSR分子标记M1060的引物中的一组或二组：
所述的针对SSR分子标记M5268的引物：
M5268-F：5’-ACACTCTCCATAGTACTCGCCAC-3’；
M5268-R：5’-TCGGGAAGAGAAATGGGTC-3’；
所述的引物M5268-F的5’端标记有荧光报告基团；
所述的针对SSR分子标记M1060的引物：
M1060-F：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGTT-3’；
M1060-R：5’-CATGCAAATTAACGACAATGGTA-3’；
所述的引物M1060-F的5’端标记有荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
4.一种用于鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的SSR分子标记的核心引物组。
5.一种利用SSR分子标记鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测养蚕叶用桑样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用权利要求2或3所述的引物对M5268-F/M5268-R和/或M1060-F/M1060-R进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)中的PCR扩增产物进行分型，对分型结果进行条带判别；以引物对M5268-F/M5268-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108bp、117bp和123bp三条特异性条带，以引物对M1060-F/M1060-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有140bp、143bp和146bp三条特异性条带，则表明待测样品为养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’，否则，则表明待测样品为非养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’。
6.根据权利要求5所述的利用SSR分子标记鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，包括：50ng/μL DNA模板0.5μL、10×PCR buffer 2μL、25mM MgCl2 2μL、10mM dNTPs 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL和ddH2O 13.8μL；步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。
7.权利要求2或3所述的核心引物组或权利要求4所述的快速检测试剂盒在鉴定养蚕叶用桑新品种‘粤桑162’中的应用。
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