CN106591460B

CN106591460B - 一种ssr分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法及应用

Info

Publication number: CN106591460B
Application number: CN201611223131.1A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 黄丹娟; 马建强; 马春雷; 徐艳霞; 王松琳; 姚明哲
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN106591460A

Abstract

本发明公开了一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法，以SSR分子标记CSR1442作为引物进行鉴定，所述引物序列为：正向引物：5’‑TCCGATCTTCATTCCTCACC‑3’反向引物：5’‑AAGAGGGGTGGGTTGAGACT‑3’。本发明还公开了上述SSR分子标记在制备用于鉴定“中茶302”茶树品种的试剂盒中的应用。本发明通过利用CSR1442特异引物进行“中茶302”品种真实性和纯度检测，操作步骤简单，检测效率高，结果可靠且直观，当出现品种假冒或有争议时可进行有效地监督和仲裁，有利于该品种的推广利用和保护。

Description

一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法及应用

技术领域

本发明涉及茶树育种和生物技术领域，特别是涉及一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法及应用。

背景技术

中国茶树种质资源丰富、种类多、分布广，且利用历史悠久，经济价值高。一个品种经国家(鉴、认)或省级(鉴、认)定前需经单株筛选、品系比较试验、品种区域试验，耗时漫长。随着茶树育种进程的不断发展，新培育出的茶树优良品种越来越多。到2016年，通过国家级审(认、鉴)定的品种达134个，通过省级审(认、鉴)定的品种达170多个。在茶树良种推广过程中，出现品种假冒或有争议时难以进行有效的监督和仲裁。因此，保证品种的真实性、维护生产者与育种家的权益显得日趋重要。依据形态特征和生化成分去鉴别品种真实性，易受发育阶段、栽培措施和环境条件的影响。

与传统形态及生化鉴定相比，分子标记鉴定技术拥有非常明显的优势：(1)在基因组中分布广泛，数量极多；(2)自然存在诸多等位变异，多态性高；(3)变异表现为DNA的形式，在生长发育不同时期和组织都能检测到，几乎不受环境影响。常用的分子标记包括：RFLP(Restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified fragmentlength polymorphism，扩增片段长度多态性)、ISSR(Inter-simple sequence repeat，简单重复区间序列)、SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)、SNP(Singlenucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)等。其中SSR标记因其具有等位变异高、共显性遗传、稳定性好、操作简便快速等优点，成为目前植物遗传多样性分析、亲缘关系比较和品种鉴定、遗传连锁图谱构建和QTL分析等领域最受欢迎的遗传标记。

“中茶302”是中国农业科学院茶叶研究所选用源于格鲁吉亚的“格鲁吉亚6号”为母本，以产于中国的“福鼎大白茶”为父本，人工杂交后经单株选育，于2010年11月通过了全国农业技术推广服务中心农作物品种鉴定。通过与“福鼎大白茶”对照，结果表明，“中茶302”具有以下优点：春季营养芽萌发早，育芽能力强，产量显著高于对照。抗寒、抗旱性较强，较抗病虫。扦插成活率高，制绿茶品质优。“中茶302”已在四川、浙江、山东等地区推广种植，并取得了良好的经济效益。

在“中茶302”茶树品种推广过程中，当出现品种假冒或有争议时经常难以进行有效的监督和仲裁。因此，如何提供一种鉴定“中茶302”茶树品种的方法，使其具有检测快速、准确的优点，当出现品种假冒或有争议时可进行有效地监督和仲裁，成为当前急需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种利用SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法，使其具有检测快速、准确的优点，当出现品种假冒或有争议时可进行有效地监督和仲裁。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法，以SSR分子标记CSR1442作为引物进行鉴定，所述引物序列为：

正向引物：5’-TCCGATCTTCATTCCTCACC-3’

反向引物：5’-AAGAGGGGTGGGTTGAGACT-3’。

进一步地，包括如下步骤：

(1)对“中茶302”和待测茶树品种提取DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以CSR1442为引物序列，分别进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)的PCR产物进行电泳分离，获得各样品的分离带型；

(4)对步骤(3)中的样品进行带型统计，对比判定，如果待测茶树品种的PCR扩增样品电泳条带与“中茶302”的PCR扩增样品结果带型一致，主带均为特征条带基因型AB，附带也一致，则表明待测茶树品种为“中茶302”；如果不一致，则表明待测茶树品种非“中茶302”。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种SSR分子标记在制备用于鉴定“中茶302”茶树品种的试剂盒中的应用，以快速、准确的鉴定“中茶302”茶树品种。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种SSR分子标记在制备用于鉴定“中茶302”茶树品种的试剂盒中的应用，所述SSR分子标记为CSR1442，其引物序列为：

正向引物：5’-TCCGATCTTCATTCCTCACC-3’

反向引物：5’-AAGAGGGGTGGGTTGAGACT-3’。

通过采用上述技术方案，本发明至少具有如下优点：

本发明利用SSR技术，通过对茶树15个连锁群上的180对SSR引物进行筛选，确认CSR1442引物序列针对“中茶302”品种具有较好的特异性，可用于“中茶302”品种的鉴定和检测。本发明通过大量实验验证得到了扩增出“中茶302”特征条带的特异性引物。利用该特异引物进行“中茶302”品种真实性和纯度检测，操作步骤简单，检测效率高，结果可靠且直观，有利于该品种的推广利用和保护。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1为本发明筛选得到的“中茶302”特异性引物CSR1442在茶树品种中扩增出的可能基因型示意图，“中茶302”特异条带基因型为AB。

图2为本发明筛选得到的“中茶302”特异性引物CSR1442在85个茶树优良品种中的电泳图；箭头标记为“中茶302”的特征带型。

图3为引物CSR1432在85个茶树优良品种中的电泳图；箭头标记表明带型与32号“中茶302”一致，该引物不是“中茶302”的特征引物。

具体实施方式

实施例1“中茶302”茶树品种特异性引物序列CSR1442的筛选获得

1、SSR引物选择

SSR引物选用覆盖茶树遗传连锁图谱的15个连锁群共180对引物，150个选自MaJQ,Yao MZ,Ma CL,Wang XC,Jin JQ,Wang XM,Chen L.Construction of a SSR-BasedGenetic Map and Identification of QTLs for CatecConstruction of a SSR-basedgenetic map and identification of QTLs for catechins content in tea plant(Camellia sinensis).Plos One,2014,9(3):e93131，以“迎霜”×“北跃单株”为亲本构建的茶树遗传连锁图谱中，另30个选自Taniguchi F,Furukawa K,Ota-Metoku S,YamaguchiN,Ujihara T,Kono I,Fukuoka H,Tanaka J.Construction of a high-densityreference linkage map of tea(Camellia sinensis).Breeding Science,2012,62:263-273，以“Sayamakaori”and“Kana-Ck17”为亲本构建的遗传连锁图谱中。每个连锁群上12对引物。引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。

2、茶树品种的选择、DNA提取、PCR扩增以及电泳

以“中茶302”及同为浙江省的其他茶树优良品种共48个(序号1-48，其中包括具有“福鼎大白茶”血统的14个品种，1个“格鲁吉亚8号”有性后代“寒绿”，这15个品种可作为“中茶302”的姊妹系)进行初步筛选。初步筛选所用的茶树品种具体见表1(取自国家种质杭州茶树圃和云南勐海茶树分圃)：

表1初步筛选用茶树品种

具体筛选步骤如下：

(1)利用天根DNA提取试剂盒，分别对每个茶树品种提取DNA，并稀释至20ng/μL待用。

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以步骤1中的SSR引物为引物序列，分别进行PCR扩增；

10μL PCR反应扩增体系设置如下：0.4U Taq酶，0.2μl dNTP(10mM)，1μL10×Buffer(含Mg²⁺)，正向和反向引物(10μM)各0.2μL，2μL模板DNA，不足部分ddH₂O补足。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸7min；PCR产物置于4℃保存备用。

3、对步骤2的PCR产物进行电泳分离，电泳前，加入2μL loading buffer混匀，然后取2μL在10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，电泳90min。银染显色。

4、对步骤3显色后的样品进行带型统计，利用excel表中突出显示重复单元功能，筛选出PCR扩增的“中茶302”带型与其它均不相同的引物。

筛选结果表明，“中茶302”的特异引物共有7对，分别是CSR781、CSR841、CSR1018、CSR1291、CSR1442、CSR1588、LG11-5；

CSR781引物序列为：

正向引物：CGGAGCTGGAATCTGAAGAG(Seq ID No：3)

反向引物：GGAAGGGTTGCAAATTCTGA(Seq ID No：4)

CSR841引物序列为：

正向引物：TAGACGTAACGCCGTCAACA(Seq ID No：5)

反向引物：GTCGAAGGTACCAAGCCAGA(Seq ID No：6)

CSR1018引物序列为：

正向引物：GGTGGTGTGGTTTAGAGGGA(Seq ID No：7)

反向引物：TTCATCTTGGGGAGCAATTC(Seq ID No：8)

CSR1291引物序列为：

正向引物：ATTGTCACCGGAGTTTTGGA(Seq ID No：9)

反向引物：ATTTGGGAGTTGGCAGAATG(Seq ID No：10)

CSR1442引物序列为：

正向引物：TCCGATCTTCATTCCTCACC(Seq ID No：1)

反向引物：AAGAGGGGTGGGTTGAGACT(Seq ID No：2)

CSR1588引物序列为：

正向引物：AAGGATCACTGGTAAAAAGCCA(Seq ID No：11)

反向引物：CTTCTGAGCCGTTCTTGAGC(Seq ID No：12)

LG11-5引物序列为：

正向引物：ACCAGGAGTTGAATATGCCCAAGT(Seq ID No：13)

反向引物：GTTTGCCCAACGTCTCTAGCATTCTCA(Seq ID No：14)

5、特异引物序列的二次筛选

初步筛选得到的“中茶302”部分特异引物电泳图谱杂带较多，并不适合直接用于茶树品种的鉴定工作，因此需要进一步进行筛选。二次筛选时材料选择与“中茶302”遗传背景差异较大的云南省的31个品种(序号

49-79)和江苏的6个品种(序号81-85)为基础，品种具体见表2(取自国家种质杭州茶树圃和云南勐海茶树分圃)。

表2二次筛选用茶树品种

利用初步筛选出来的7对引物、上述二次筛选用茶树品种及“中茶302”进行了进一步筛选，最终得到“中茶302”的特异引物CSR1442。最后通过10个品种进行重复验证，与前面电泳条带相一致。表明本发明筛选得到的结果准确、直观、可靠。

上述特异性引物的筛选实验结果可参考图1、图2、图3所示，图1为本发明筛选得到的“中茶302”特异性引物CSR1442在茶树品种中扩增出的可能基因型示意图，“中茶302”特异条带基因型为AB。图2为本发明筛选得到的“中茶302”特异性引物CSR1442在表1、表2中的85个茶树优良品种中的电泳图(还包括其中10个品种的重复验证结果)，箭头标记为“中茶302”的特征带型。图3为引物CSR1432在85个茶树优良品种中的电泳图(还包括10个品种的重复验证结果)，箭头标记表明带型与32号“中茶302”一致，该引物不是“中茶302”的特征引物。CSR1432引物序列为：

正向引物：GAGAGACAGAGAGATGGGCAA(Seq ID No：15)

反向引物：TGACCACCACCAGACCACTA(Seq ID No：16)

由上述结果可以看出，引物CAR1442具有较好的特异性，且主带和附带电泳图谱清晰可见，适用于鉴定“中茶302”品种的真实性。

在获取特异性分子标记的过程中，本发明首先重视了引物的选取，在众多的茶树遗传连锁图谱中，优选了两个由不同亲本构建的遗传连锁图谱进行组合，从中选取了在所有连锁群上均匀分布的180对SSR标记，以便客观地评价品种特性。筛选时，对茶树品种做了适当选取，首先对“中茶302”姊妹系品种及同一省份的品种进行筛选。因为部分姊妹系品种继承了“福鼎大白茶”的遗传物质，在表型上与“中茶302”较相似，通过表型鉴定存在一定困难。因此，在来源相同或遗传背景相同的品种中筛选得到的特异引物具有十分重要的意义。

在初步筛选的基础上，又进行了二次筛选，第二次筛选时又对茶树品种做了适当选择，选择了遗传背景不同的云南省的茶树品种，它们的表型性状与“中茶302”差异较大，一般通过表型鉴定也能辨别开来。根据引物CSR1442电泳图谱基因型结果，此组材料也未出现“中茶302”特异条带。

最后选用10个材料，对特异引物CSR1442的稳定性进行了重复了验证，带型结果与前面扩增的结果一致，参考图2所示。

实施例2利用SSR分子标记鉴定”中茶302”茶树品种的方法

本发明中鉴定“中茶302”茶树品种的方法，包括以下步骤：

1、采用天根植物基因组DNA提取试剂盒，分别对“中茶302”和待测茶树品种提取DNA，NanoDrop分光光度计测定浓度后，稀释至20ng/μl备用；

2、以步骤1中提取的DNA为模板，以CSR1442为引物序列，分别进行PCR扩增；

所述CSR1442引物序列为：

正向引物：5’-TCCGATCTTCATTCCTCACC-3’(Seq ID No：1)

反向引物：5’-AAGAGGGGTGGGTTGAGACT-3’(Seq ID No：2)

10μL PCR反应扩增体系设置如下：0.4U Taq酶，0.2μl dNTP(10mM)，1μL 10×Buffer(含Mg²⁺)，正向和反向引物(10μM)各0.2μL，2μL模板DNA，不足部分ddH₂O补足。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸7min；PCR产物置于4℃保存备用。

3、对步骤2的PCR产物进行电泳分离，电泳前，加入2μl loadingbuffer混匀，然后取2μL在10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，电泳90min，银染显色。

4、对步骤3显色后的样品进行带型统计，对比判定，如果待测茶树品种的PCR扩增样品电泳条带与“中茶302”的PCR扩增样品结果带型一致，主带均为特征条带基因型AB，附带也一致，则表明待测茶树品种为“中茶302”；如果不一致，则表明待测茶树品种非“中茶302”。

上述鉴定方法中采用特征引物CSR1442为“中茶302”的快速、准确检测、鉴定提供较好地保障。

上述特征引物CSR1442也可直接作为快速检测试剂盒的一部分，应用于快速鉴定“中茶302”茶树品种。

最后，对本发明中所用到的主要试剂介绍如下：

1、DNA提取：北京天根植物基因组快速提取试剂盒；

2、CSR1442及其他引物均由上海生工生物有限公司合成提供；

3、Taq酶、dNTP、10×Buffer购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120>一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法及应用

<160> 16

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tccgatcttc attcctcacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

aagaggggtg ggttgagact 20

<210>3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

cggagctgga atctgaagag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

ggaagggttg caaattctga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

tagacgtaac gccgtcaaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

gtcgaaggta ccaagccaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

ggtggtgtgg tttagaggga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

ttcatcttgg ggagcaattc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

attgtcaccg gagttttgga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

atttgggagt tggcagaatg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

aaggatcact ggtaaaaagc ca 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

cttctgagcc gttcttgagc 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

accaggagtt gaatatgccc aagt 24

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

gtttgcccaa cgtctctagc attctca 27

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

gagagacaga gagatgggca a 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 16

tgaccaccac cagaccacta 20

Claims

1.一种SSR分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法，其特征在于，以SSR分子标记CSR1442作为引物进行鉴定，所述引物序列为：

正向引物：5’-TCCGATCTTCATTCCTCACC-3’

反向引物：5’-AAGAGGGGTGGGTTGAGACT-3’。

2.根据权利要求1所述的鉴定“中茶302”茶树品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对“中茶302”和待测茶树品种提取DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，以CSR1442为引物，分别进行PCR扩增；

3.一种SSR分子标记在制备用于鉴定“中茶302”茶树品种的试剂盒中的应用，其特征在于，所述SSR分子标记为CSR1442，其引物序列为：

正向引物：5’-TCCGATCTTCATTCCTCACC-3’

反向引物：5’-AAGAGGGGTGGGTTGAGACT-3’。