CN103320427B - 一种辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒抗性的方法。本发明保护序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对甲。所述引物对甲具有如下(a)或(b)中的应用：(a)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；(b)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。采用本发明的方法，可以实现对大豆花叶病毒SMV-N1株系和SMV-N3株系抗性种质的分子辅助选择育种，与传统的抗病表型鉴定相比，可以实现早期选育(如子叶期)，选择效率达到98％以上，并大大节省实验时间和实验成本。本发明将在大豆育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒抗性的方法。
背景技术
大豆(Glycine max)原产于中国，是重要的经济作物。大豆花叶病毒(soybeanmosaic virus，SMV)引起的病害是危害大豆生产的主要病害之一，严重影响大豆产量和品质。培育抗病品种是目前控制SMV流行最有效方法。东北大豆产区SMV的优势毒株为N1株系和N3株系。利用分子标记技术定位与N1株系抗性和N3株系抗性相关基因和紧密连锁的分子标记有益于分子辅助选择抗性大豆品种的育种实践。
刘丽君等(2002)利用黑农39×合丰25的F2群体，筛选出共显性RAPD标记OPN1400/1300，与黑农39抗病基因的遗传距离为8.2cM。理论上，与抗病基因的遗传距离小于5cM的分子标记才具有分子辅助选择的应用价值，以往的研究结果所得到的标记-基因遗传距离较远，应用范围较小。因此，缩小抗病位点的遗传距离，寻找与抗病位点紧密连锁的分子标记对于提高分子辅助选择的效力具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒抗性的方法。
本发明保护序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对甲。
本发明还保护引物组合物，包括所述引物对甲。
所述引物组合物(引物组合物I)还可包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA片段和序列表的序列4所示DNA片段组成。所述引物组合物具体可由所述引物对甲和所述引物对乙组成。
所述引物组合物(引物组合物II)还包括引物对丙；所述引物对丙由序列表的序列5所示DNA片段和序列表的序列6所示DNA片段组成。所述引物组合物具体可由所述引物对甲和所述引物对丙组成。
所述引物组合物(引物组合物III)还可包括所述引物对乙和所述引物对丙。所述引物组合物具体可由所述引物对甲、所述引物对乙和所述引物对丙组成。
所述引物对甲可用于如下(a)或(b)：
(a)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(b)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
所述应用具体可采用如下方法：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与抗病大豆一致的带型(显示一条约150bp的特异条带)、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与感病大豆一致的带型(即显示一条约170bp的特异条带)，待测为候选的感大豆花叶病毒大豆。
所述抗病大豆具体可为东农93-046。所述感病大豆具体可为conrad。所述大豆花叶病毒为SMV-N1株系或SMV-N3株系。
所述引物组合物I可用于如下(c)或(d)：
(c)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(d)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
所述应用具体可采用如下方法(方法甲)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与抗病大豆一致的带型(显示一条约150bp的特异条带)、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与感病大豆一致的带型(即显示一条约170bp的特异条带)，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
所述应用还可包括如下方法(方法乙)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析，如果显示与抗病大豆一致的扩增曲线、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果显示与感病大豆一致的扩增曲线，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
方法乙可作为对方法甲的进一步验证。
所述抗病大豆具体可为东农93-046。所述感病大豆具体可为conrad。所述大豆花叶病毒为SMV-N1株系。
所述引物组合物II可用于如下(e)或(f)：
(e)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(f)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
所述应用具体可采用如下方法(方法甲)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与抗病大豆一致的带型(显示一条约150bp的特异条带)、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与感病大豆一致的带型(即显示一条约170bp的特异条带)，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
所述应用还可包括如下方法(方法丙)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对丙进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析，如果显示与抗病大豆一致的扩增曲线、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果显示与感病大豆一致的扩增曲线，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
方法丙可作为对方法甲的进一步验证。
所述抗病大豆具体可为东农93-046。所述感病大豆具体可为conrad。所述大豆花叶病毒为SMV-N3株系。
所述引物组合物III可用于如下(g)或(h)：
(g)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(h)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
所述应用具体可采用如下方法(方法甲)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与抗病大豆一致的带型(显示一条约150bp的特异条带)、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果待测大豆在100bp在250bp之间具有与感病大豆一致的带型(即显示一条约170bp的特异条带)，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
所述应用还可包括如下方法(方法乙)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析，如果显示与抗病大豆一致的扩增曲线、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果显示与感病大豆一致的扩增曲线，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
所述应用还可包括如下方法(方法丙)：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述引物对丙进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析，如果显示与抗病大豆一致的扩增曲线、待测大豆为候选的抗大豆花叶病毒大豆，如果显示与感病大豆一致的扩增曲线，待测大豆为候选的感大豆花叶病毒大豆。
方法乙和方法丙均可作为对方法甲的进一步验证。
所述抗病大豆具体可为东农93-046。所述感病大豆具体可为conrad。所述大豆花叶病毒为SMV-N1株系或SMV-N3株系。
本发明还保护抗大豆花叶病毒N1株系的基因位点RsmvN1-1或抗大豆花叶病毒N3株系的基因位点RsmvN3-1。
所述RsmvN1-1位点位于大豆的F连锁群，在单核苷酸突变位点SNP9和简单重复序列引物位点SSR23之间。
所述RsmvN3-1位点位于大豆的F连锁群，在简单重复序列引物位点SSR23和单核苷酸突变位点SNP11之间。
当LOD≥3.0时通过区间作图法能够在上述区间检测到基因位点RsmvN1-1和基因位点RsmvN3-1，可用上述基因位点进行抗SMV-N1株系和SMV-N3株系大豆品种的分子辅助选择。
以上任一所述大豆为大豆属(Glycine max)大豆，即可为栽培种(系)也可为野生种(系)。
采用本发明的方法，可以实现对大豆花叶病毒SMV-N1株系和SMV-N3株系抗性种质的分子辅助选择育种。一方面，可以快速高效地选择具有对大豆花叶病毒抗性的后代个体，进而选育优质抗病品种。另一方面，可以快速高效地选择具有对大豆花叶病毒抗性的打动品种，作为大豆杂交亲本，进而选育优质抗病品种。本发明的方法直接采用分子鉴定，与传统的抗病表型鉴定相比，可以实现早期选育(如子叶期)，选择效率达到98％以上，并大大节省实验时间和实验成本。本发明将在大豆育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为分子标记连锁图谱。
图2为实施例3中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3为实施例3中的扩增曲线(采用SNP9引物对)。
图4为实施例3中的扩增曲线(采用SNP11引物对)。
图5为实施例4中的扩增曲线(采用SNP9引物对)。
图6为实施例4中的扩增曲线(采用SNP11引物对)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大豆花叶病毒N1株系(简称SMV-N1株系)：公众可以从东北农业大学获得；参考文献：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传，细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006(page30)；感病叶片的表型为：叶脉间失绿，系统花叶。
大豆花叶病毒N3株系(简称SMV-N3株系)：公众可以从东北农业大学获得；参考文献：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传，细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006(page30)；感病叶片的表型为：叶片皱缩。
大豆品种东农93-046(抗病品种)：公众可以从东北农业大学获得；参考文献：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传，细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006(page30)。
大豆品种合丰25(感病品种)：公众可以从东北农业大学获得；参考文献：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传，细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006(page30)。
大豆品种conrad(感病品种)：公众可以从东北农业大学获得；参考文献：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传，细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006(page30)。
实施例1、引物对的设计和制备
设计并合成如下三对引物：
SSR23引物对(F代表上游引物，R代表下游引物)：
SSR23-F(序列表的序列1)：5’-TCGGTCCTATCCCCTCCTAA-3’；
SSR23-R(序列表的序列2)：5’-CGAGTCGCTTTTTCTCTTCTGT-3’。
SNP9引物对：
SNP9-F(序列表的序列3)：5’-GCTGGCTACACCAACGAAC-3’；
SNP9-R(序列表的序列4)：5’-TATTAGAATGTGGACGGCAAA-3’。
SNP11引物对：
SNP11-F(序列表的序列5)：5’-TATCATGGCTAGTAGGCATAGATAGA-3’；
SNP11-R(序列表的序列6)：5’-CCTTTATGAAAATTTTGTGATTGGAAC-3’。
实施例2、抗SMV-N1株系的基因位点(RsmvN1-1)和抗SMV-N3株系的基因位点(RsmvN3-1)的获得
一、重组自交系的构建
1、用中国东农93-046(♀)和合丰25(♂)进行杂交，得到杂交子一代(F1代)。
2、将F1代自花授粉获得130粒种子，即子二代(F2代)。
3、将F2代分别通过子代单粒传法(SSD)进行6次传代，获得130个F2：6代重组自交系。
将130个F2：6代重组自交系、东农93-046(母本)和合丰25(父本)分别进行步骤二和步骤三的鉴定。
二、植株抗SMV-N1株系和抗SMV-N3株系的鉴定
分别在独立的防蚜网室内对各组植株进行抗SMV-N1株系鉴定和抗SMV-N3株系鉴定。分别于2007年、2008年、2009年进行试验。
试验方法如下(进行三次重复试验，结果取平均值)：将感染SMV-N1株系(或SMV-N3株系)且呈现发病表型的合丰25叶片放入研钵中，加入pH7.0、0.01mol/L的磷酸缓冲液(每克叶片加入10ml磷酸缓冲液)和600目的金刚砂少许，将病叶研磨成匀浆状，即为接种液；用毛笔蘸取接种液在待测植株的对生真叶充分展开时沿叶脉摩擦接种，接种后立即用自来水冲洗叶片表面残渣。分别于接种后20天和30天调查发病情况。
三、遗传图谱构建及抗病基因定位
1、提取待测植株的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SSR23引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR体系(20μl)：2μl基因组DNA(100ng/μl)、1.5μl MgCl2(25mM)、0.25μl dNTPmixtures(10mM)、2μl 10×PCR buffer、3μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.25μl Taq polymerase(10units/μl)和11μl去离子水。
PCR程序：94℃预变性6min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35次循环；72℃终延伸5min。
3、将步骤2的PCR扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。根据SSR标记基因型在群体中的分离及SNP在群体间的基因分型情况，将母本类型的个体记为“A”，父本类型的个体记为“B”，杂合的和缺失不清的记为“-”。
4、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SNP9引物对进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析。
PCR体系(10μl)：1μl基因组DNA(100ng/μl)、1μl LCGreen plus(Idaho公司)、0.75μl MgCl2(25mM)、0.2μl dNTP mixtures(10mM)、1μl 10×PCR buffer，2μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.2μl Taq polymerase(10units/μl)和3.85μl去离子水。
PCR程序同步骤2。
5、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SNP11引物对进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析。
PCR体系(10μl)：1μl基因组DNA(100ng/μl)、1μl LCGreen plus(Idaho公司)、0.75μl MgCl2(25mM)、0.2μl dNTP mixtures(10mM)、1μl 10×PCR buffer，2μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.2μl Taq polymerase(10units/μl)和3.85μl去离子水。
PCR程序同步骤2。
6、根据步骤3、4和5的结果，利用Mapmaker/EXP3.0作图软件构建分子标记连锁图谱。应用Group命令进行连锁分析和分组(LOD＝5.0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1％，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。根据已由Song(2004)等定位的SSR标记作为锚定标记以确定相应的连锁。将LOD≥2.0作为QTL存在的阙值，用WinQTLcartographV2.0进行QTL定位。
结果如图1所示。抗SMV-N1株系的基因位点(RsmvN1-1)和抗SMV-N1株系的基因位点(RsmvN3-1)均定位于大豆的F连锁群，RsmvN1-1位于SNP9和SSR23之间，RsmvN3-1位于SSR23和SNP11之间，分别能够解释的表型变异分别为48.64％和55.12％。
实施例3、实施例1制备的三对引物在杂交后代选择中的应用
一、重组自交系的构建
1、用东农93-046(♀)和conrad(♂)进行杂交，得到杂交子一代(F1代)。
2、将F1代自花授粉获得150粒种子，即子二代(F2代)。
3、将F2代分别通过子代单粒传法(SSD)进行6次传代，获得150个F2：6代重组自交系。
将150个F2：6代重组自交系、东农93-046(母本)、conrad(父本)和合丰25(感病对照)分别进行步骤二和步骤三的鉴定。
二、植株抗SMV-N1株系和抗SMV-N3株系的鉴定
分别在独立的防蚜网室内对各组植株进行抗SMV-N1株系鉴定和抗SMV-N3株系鉴定。
试验方法如下(进行三次重复试验，结果取平均值)：将感染SMV-N1株系(或SMV-N3株系)且呈现发病表型的合丰25叶片放入研钵中，加入pH7.0、0.01mol/L的磷酸缓冲液(每克叶片加入10ml磷酸缓冲液)和600目的金刚砂少许，将病叶研磨成匀浆状，即为接种液；用毛笔蘸取接种液在待测植株的对生真叶充分展开时沿叶脉摩擦接种，接种后立即用自来水冲洗叶片表面残渣；以合丰25为对照，合丰25出现相应感病表型时(接种后20-30天)，开始调查发病情况。出现感病叶片表型(SMV-N1株系对应的表型为：叶脉间失绿，系统花叶；SMV-N3株系对应的表型为：叶片皱缩)的植株为感病植株，未出现感病叶片表型的植株为抗病植株。
部分结果见表1(R代表抗病，S代表感病)。
三、采用实施例1制备的三对引物进行分子鉴定
1、提取待测植株的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SSR23引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR体系(20μl)：2μl基因组DNA(100ng/μl)、1.5μl MgCl2(25mM)、0.25μl dNTPmixtures(10mM)、2μl 10×PCR buffer、3μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.25μl Taq polymerase(10units/μl)和11μl去离子水。
PCR程序：94℃预变性6min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35次循环；72℃终延伸5min。
3、将步骤2的PCR扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。对于某个F2： 6代重组自交系来说：如果在100bp在250bp之间具有与东农93-046一致的带型(即显示一条约150bp的特异条带)，待测大豆的检测结果为阳性，用“√”表示；如果在100bp在250bp之间具有与conrad一致的带型(即显示一条约170bp的特异条带)，待测大豆的检测结果为阴性，用“-”表示。部分结果见图2和表1。
4、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SNP9引物对进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析。
PCR体系(10μl)：1μl基因组DNA(100ng/μl)、1μl LCGreen plus(Idaho公司)、0.75μl MgCl2(25mM)、0.2μl dNTP mixtures(10mM)、1μl 10×PCR buffer，2μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.2μl Taq polymerase(10units/μl)和3.85μl去离子水。
PCR程序同步骤2。
对于某个F2：6代重组自交系来说：如果显示与东农93-046一致的扩增曲线，待测大豆的检测结果为阳性，用“√”表示；如果显示与conrad一致的扩增曲线，待测大豆的检测结果为阴性，用“-”表示。部分结果见图3和表1。
5、以步骤1的基因组DNA为模板，用实施例1制备的SNP11引物对进行PCR扩增，采用Lightscanner HRM高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统(Idaho公司)对PCR扩增产物进行分析。
PCR体系(10μl)：1μl基因组DNA(100ng/μl)、1μl LCGreen plus(Idaho公司)、0.75μl MgCl2(25mM)、0.2μl dNTP mixtures(10mM)、1μl 10×PCR buffer，2μl引物(上游引物和下游引物的浓度均为2μM)、0.2μl Taq polymerase(10units/μl)和3.85μl去离子水。
PCR程序同步骤2。
对于某个F2：6代重组自交系来说：如果显示与东农93-046一致的扩增曲线，待测大豆的检测结果为阳性，用“√”表示；如果显示与conrad一致的扩增曲线，待测大豆的检测结果为阴性，用“-”表示。部分结果见图4和表1。
四、结果分析
表1实施例1制备的三对引物在杂交后代选择中的应用
综合分析步骤二和步骤三的结果。
结果表明，SSR23引物对和SNP9引物对均可用于辅助鉴定植株对SMV-N1株系的抗性，如果待测植株的分子鉴定结果与抗病亲本一致，待测植株为候选的抗病植株，如果待测植株的分子鉴定结果与感病亲本一致，待测植株为候选的感病植株，对于本实施例来说，准确性达到100％。
结果表明，SSR23引物对和SNP11引物对均可用于辅助鉴定植株对SMV-N3株系的抗性，如果待测植株的分子鉴定结果与抗病亲本一致，待测植株为候选的抗病植株，如果待测植株的分子鉴定结果与感病亲本一致，待测植株为候选的感病植株，对于本实施例来说，准确性达到100％。
实施例4、三对引物在鉴定大豆对SMV-N1株系和SMV-N3株系的抗感性中的应用
一、分别应用实施例1制备的SSR23引物对对各个品种的大豆进行分子鉴定
方法同实施例3的步骤三。
二、植株抗SMV-N1株系和抗SMV-N3株系的鉴定
同实施例3的步骤二。
结果见表2(R代表抗病，S代表感病)。
三、结果分析
应用SNP9引物对进行分子鉴定的结果见图5。应用SNP11引物对进行分子鉴定的结果见图6。
表2大豆对SMV-N1株系和SMV-N3株系的抗感性
综合分析步骤一和步骤二的结果。
结果表明，SSR23引物对和SNP9引物对均可用于辅助鉴定植株对SMV-N1株系的抗性，如果待测植株的分子鉴定结果与东农93-046一致，待测植株为候选的抗病植株，如果待测植株的分子鉴定结果与conrad一致，待测植株为候选的感病植株，对于本实施例来说，SSR23引物对分子鉴定的准确性达到100％，SNP9引物对分子鉴定的准确性达到96.67％。
结果表明，SSR23引物对和SNP11引物对均可用于辅助鉴定植株对SMV-N3株系的抗性，如果待测植株的分子鉴定结果与东农93-046一致，待测植株为候选的抗病植株，如果待测植株的分子鉴定结果与conrad一致，待测植株为候选的感病植株，对于本实施例来说，SSR23引物对分子鉴定的准确性达到100％，SNP11引物对分子鉴定的准确性达到93.33％。
Claims (7)
1.一种引物对甲，由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成。
2.引物组合物，包括权利要求1所述引物对甲。
3.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物还包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA片段和序列表的序列4所示DNA片段组成。
4.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物还包括引物对丙；所述引物对丙由序列表的序列5所示DNA片段和序列表的序列6所示DNA片段组成。
5.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物还包括引物对乙和引物对丙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA片段和序列表的序列4所示DNA片段组成；所述引物对丙由序列表的序列5所示DNA片段和序列表的序列6所示DNA片段组成。
6.权利要求1所述引物对甲在如下(a)或(b)中的应用：
(a)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(b)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
7.权利要求2、3、4或5所述引物组合物在如下(A)或(B)中的应用：
(A)辅助鉴定大豆对大豆花叶病毒的抗性；
(B)辅助筛选抗大豆花叶病毒的大豆。
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