CN107400721A - 与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记，两个InDel标记分别为Chr3InDel‑fs01和Chr3InDel‑fs02，所述Chr3InDel‑fs01的核苷酸序列为TGTCTTATCCTATAGA，所述Chr3InDel‑fs02的核苷酸序列为CGAGAGA。本发明还公开了所述的InDel标记在黄瓜黄白色果皮分子标记辅助育种中的应用。具体方法是：(1)对F₂群体每个株系利用所得分子标记进行基因型鉴定。(2)利用上述(1)中F₂群体基因型鉴定结果，根据鉴定结果，对单株进行分类，并对表型结果进行鉴定和验证。本发明的InDel分子标记变异稳定，检测简易清晰，不需要酶切，实验成本低廉，提高了黄瓜果皮颜色育种的效率，加快黄瓜果皮颜色育种进程。

Description

与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记及应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及与黄瓜黄白色黄瓜基因紧密连锁的InDel标记。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativusL.)是葫芦科黄瓜属植物，起源于温暖湿润的喜马拉雅山南麓热带雨林地区。黄瓜是我国主要蔬菜作物之一，在我国栽培面积最大、种植范围最广。随着人们生活品质的提高，人们对商品品质的要求也越来越高，尤其是其外观品质。黄瓜果皮颜色、果长、果把长等是影响黄瓜商品性的重要性状。品质育种已经成为黄瓜育种的重点之一，研究黄瓜嫩果果皮颜色的遗传规律及分子标记具有重要的现实意义。

近年来，黄瓜遗传图谱的构建和重要经济性状基因遗传定位的研究取得了显著进展，已经获得黄瓜抗白粉病、果长、果把长和果肉厚度等性状的连锁分子标记。关于黄瓜果皮颜色相关的研究报道只是简要阐述黄瓜果皮颜色的遗传规律，Strong等(1931)认为皮色暗绿色由D基因控制，暗绿色为显性，顾兴芳等(2005)认为黄瓜嫩果果皮深绿色对绿色果皮的遗传受单一基因Dg控制，深绿色为显性，绿色dg为隐性。对于黄瓜黄白色果皮基因的定位研究相对薄弱，尚未有InDel标记用于黄瓜嫩果皮颜色辅助选择育种的研究报道。因此开发与黄瓜嫩果皮颜色基因相关的标记具有非常重要的生物学意义。

发明内容

针对以上问题，本发明通过在亲本和混池间筛选多态性分子标记，根据两个亲本间重测序的结果制备与黄瓜果皮颜色相关的InDel标记，并设计引物，在黄瓜果皮颜色育种中进行运用，从而加速黄白色果皮黄瓜品种选育进程。同时，这两个InDel标记也为黄瓜黄白色果皮基因的克隆及创新种质、选育黄白色果皮黄瓜新品种奠定了基础。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记，两个InDel标记分别为Chr3InDel-fs01和Chr3InDel-fs02，所述Chr3InDel-fs01的核苷酸序列为TGTCTTATCCTATAGA，所述Chr3InDel-fs02的核苷酸序列为CGAGAGA。

一对用于检测权利要求1所述的两个InDel标记的引物，包括Chr3InDel-fs01的上游引物5′-ATAAGAGTAAATTTGCATTCG-3′和反向引物5′-CAATATGTAATGCTTCTTATGA-3′；Chr3InDel-fs02的正向引物5′-TGTTATGTTGCCTCAAAGAC-3′和反向引物5′-CAGCGAGTGAATGAGGTAAG-3′。

一种权利要求1所述的InDel分子标记的筛选方法，步骤如下：

(1)对六个世代群体的单株进行果皮颜色表型鉴定；

(2)利用SSR分子标记技术，采用集群分析法来进行与黄瓜果皮绿色基因连锁的分子标记的研究，完成对果皮颜色的初步定位；

(3)结合两个亲本的重测序，在初步定位的候选区域开发InDel标记，并设计对应的InDel引物；

(4)利用对应的InDel引物，筛选在亲本以及混池间有多态性的引物，利用多态性引物对F₂群体进行基因型鉴定；

(5)将InDel分子标记的基因型鉴定结果，利用joinmap4.0进行遗传图谱构建，分析所鉴定的分子标记与果皮颜色相关基因的连锁程度。

利用上述技术措施，最终获得与黄瓜果皮颜色紧密连锁的InDel标记，对应黄瓜参考基因组物理图谱的位置，分别位于三号染色体的39207482和39210904bp。Chr3InDel-fs01的核苷酸序列为TGTCTTATCCTATAGA，该引物序列为Chr3InDel-fs01F:ATAAGAGTAAATTTGCATTCG,Chr3InDel-fs01R：CAATATGTAATGCTTCTTATGA,Chr3InDel-fs02的核苷酸序列为CGAGAGA。Chr3InDel-fs02F:TGTTATGTTGCCTCAAAGAC，Chr3InDel-fs02R:CAGCGAGTGAATGAGGTAAG。

上述鉴定黄瓜果皮颜色的分子标记在黄瓜果皮颜色育种的应用方法，包括如下几个步骤：

(1)对F₂群体每个株系利用所得分子标记进行基因型鉴定。

(2)利用上述(1)中F₂群体基因型鉴定结果，根据鉴定结果，对单株进行分类，并对表型结果进行鉴定和验证。

有益效果：本发明的InDel分子标记变异稳定，检测简易清晰，不需要酶切，实验成本低廉，提高了黄瓜果皮颜色育种的效率，加快黄瓜果皮颜色育种进程；本发明标记与控制黄瓜果皮颜色的基因紧密连锁，加快黄瓜果皮颜色基因的克隆与验证；本发明在DNA序列的保守区，在二级结构稳定、G+C含量高等因素的基础上，通过primer5软件设计高灵敏和特异性强的引物。

附图说明

图1是部分SSR标记在亲本和混池间(P1：黄白色果皮YN，P2：绿色果皮JIN5-508HL：黄白色果皮混池L：绿色果皮混池)聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性。由电泳图结果显示，亲本及混池在这两个标记间存在多态性差异，因此与果皮颜色相关的候选基因在这两个标记之间。

图2是SSR标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。

图3是InDel标记在亲本和混池间(P1：黄白色果皮YN，P2：绿色果皮JIN5-508HL：黄白色果皮混池L：绿色果皮混池)聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性。

图4是InDel标记在F2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测

图5是Chr3InDel-fs01选取20个已知黄瓜果皮颜色的黄瓜自交系，10个绿色果皮(ACUO57,KP2,AMO22,MM97，OFBAT17，JIN5，EP6411OFBAT07，649，D8)，10个黄白色果皮(白贵妃，CAP15，大白，海洋白黄瓜，CAP14，CAP11，YN,平望乳瓜，白秀，FRANCH)。

图6是Chr3InDel-fs02选取20个已知黄瓜果皮颜色的黄瓜自交系，10个绿色果皮(ACUO57,KP2,AMO22,MM97，OFBAT17，JIN5，EP6411OFBAT07，649，D8)，10个黄白色果皮(白贵妃，CAP15，大白，海洋白黄瓜，CAP14，CAP11，YN,平望乳瓜，白秀，FRANCH)。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、遗传分离群体的构建

1、F₂群体的构建

YN(母本)，黄白色果皮；茎杆粗壮，节间长到12-14节时顶端以一束雌花封顶而停止生长，叶片绿色，果实短，果把短，果皮黄白色。

JIN5-508(父本)，绿色果皮；为蔓生品种，植株高大，节间长，系从国内品种“津春5号”(天津科润农业科技股份有限公司)连续自交分离8代，在每一个子代中选择果把较长的植株，自交至第8代性状不再分离而获得的长果把自交系。

本实施案例利用这两个亲本配置了杂交组合F₁，F₁自交产生F₂群体。在551株F₂群体中，测量授粉后发育9d的黄瓜果实的果皮颜色。对果皮颜色进行目测和色差仪测量。计算分离比，进行卡方测验。

二、黄瓜黄白色果皮基因的初步定位

1、黄瓜基因组DNA的提取

使用CTAB法提取黄瓜亲本及F₂群体基因组DNA。

2、多态性SSR引物筛选

SSR引物来自于国际黄瓜基因组计划(CUGI)。详细信息可参见Ren等2009年在PLoSONE上发表的文章《An Integrated Genetic And Cytoenetic Map of Cucumber Genome》。SSR的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min(每个循环降低2℃)，72℃延伸1min，共6个循环；94℃变性30s，58-50℃退火1min(每个循环降低1℃)，72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸7min；4℃保存。采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR的特异性。共选用806对SSR引物在亲本间进行多态性标记筛选，其中49对引物在两亲本间表现出差异。对亲本间有多态性的引物在混池中进行验证，共有4对引物在混池中呈现与亲本一致的差异条带。

3、黄瓜黄白色果皮基因初步定位

根据扩增条带和F₂表型，利用joinmap4.0构建遗传图谱，对与果皮颜色相关的基因进行初步定位。SSR分子标记遗传图谱是基于87株JIN5-508*YN的F₂群体，根据图谱上的物理距离,可知控制黄瓜果皮基因位于SSR02106和SSR15312间，两者均位于3号染色体上。4、InDel分子标记的开发及鉴定

对双亲(YN和JIN5-508)进行基因组DNA重测序。依据重测序结果以及黄瓜基因组信息，在两侧翼标记SSR02106、SSR15312之间共设计了64个InDels。引物设计原则为，长度18～22bp，目标条带长度150～200bp。PCR扩增体系使用10μL扩增体系，包含0.1ulTaq酶，1ul模板DNA，0.2ul dNTP，1ul引物，1ul 10×PCR buffer(含Mg2+)，加ddH₂O至10μL。95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min(每个循环降低2℃)，72℃延伸1min，共6个循环；94℃变性30s，58-50℃退火1min(每个循环降低1℃)，72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸7min；4℃保存。在两亲本间及混池进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测，25对InDels在亲本间表现特异性。

三、黄瓜黄白色果皮基因精细定位

利用上述25对InDels标记鉴定F₂群体，鉴定F₂的基因型，结合表型结果，最终将黄瓜黄白色果皮基因精细定位到两个InDel标记之间，分别命名为Chr3InDel-fs01和Chr3InDel-fs02，物理距离为0.25Mb。利用这两个InDel标记定位的黄瓜黄白色果皮基因，有助于黄瓜黄白色果皮基因的最终克隆。

实施例2：InDel标记对黄瓜果皮颜色的黄瓜自交系的检测

(1)选取20个已知黄瓜果皮颜色的黄瓜自交系，10个绿色果皮(ACUO57,KP2,AMO22,MM97，OFBAT17，JIN5，EP6411OFBAT07，649，D8)。10个黄白色果皮(白贵妃，CAP15，大白，海洋白黄瓜，CAP14，CAP11，YN,平望乳瓜，白秀，FRANCH)。

(2)分别提取上述20个品种及亲本基因组DNA，使用Chr3InDel-fs01和Chr3InDel-fs02标记进行PCR扩增。ChrINdel-fs01在10个绿色果皮黄瓜自交系以及10个黄白色果皮黄瓜自交系中的结果，基因型与表型一致。(如图5)ChrINdel-fs02在10个绿色果皮黄瓜自交系以及10个黄白色果皮黄瓜自交系中的结果，基因型与表型一致。(如图6)

(3)琼脂糖凝胶电泳结果表明：果皮颜色鉴定与结果一致，上述两个InDel标记可以将黄白色果皮与绿色果皮自交系区分开。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记，其特征在于，两个InDel标记分别为Chr3InDel-fs01和Chr3InDel-fs02，所述Chr3InDel-fs01的核苷酸序列为TGTCTTATCCTATAGA，所述Chr3InDel-fs02的核苷酸序列为CGAGAGA。

2.一对用于检测权利要求1所述的两个InDel标记的引物，其特征在于，包括Chr3InDel-fs01的上游引物5′-ATAAGAGTAAATTTGCATTCG-3′和反向引物5′-CAATATGTAATGCTTCTTATGA-3′；Chr3InDel-fs02的正向引物5′-TGTTATGTTGCCTCAAAGAC-3′和反向引物5′-CAGCGAGTGAATGAGGTAAG-3′。

3.一种权利要求1所述的InDel分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

(1)对六个世代群体的单株进行果皮颜色表型鉴定；

(2)利用SSR分子标记技术，采用集群分析法来进行与黄瓜果皮绿色基因连锁的分子标记的研究，完成对果皮颜色的初步定位；

(3)结合两个亲本的重测序，在初步定位的候选区域开发InDel标记，并设计对应的InDel引物；

(4)利用对应的InDel引物，筛选在亲本以及混池间有多态性的引物，利用多态性引物对F₂群体进行基因型鉴定；

(5)将InDel分子标记的基因型鉴定结果，利用joinmap4.0进行遗传图谱构建，分析所鉴定的分子标记与果皮颜色相关基因的连锁程度。

4.如权利要求1所述的InDel标记在黄瓜黄白色果皮分子标记辅助育种中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体方法是：

(1)对F₂群体每个株系利用所得分子标记进行基因型鉴定。

(2)利用上述(1)中F₂群体基因型鉴定结果，根据鉴定结果，对单株进行分类，并对表型结果进行鉴定和验证。