CN108866226A

CN108866226A - 一种冬瓜皮色基因的indel分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN108866226A
Application number: CN201810669599.6A
Authority: CN
Inventors: 江彪; 谢大森; 刘文睿; 孙飘云; 王敏; 何晓明; 彭庆务; 林毓娥; 梁肇均
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: CN108866226B

Abstract

本发明公开了一种控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物，该引物能产生黑皮材料特异性标记和黄皮材料特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。本发明还公开了一种冬瓜皮色的鉴定方法，该方法准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便。本发明进一步公开了上述控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物在鉴定冬瓜皮色中的应用。

Description

一种冬瓜皮色基因的indel分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于分子标记引物技术领域，具体涉及一种冬瓜皮色基因的indel分子标记引物及其应用。

背景技术

果皮颜色是果实重要的外观性状，在一定程度上决定着果实的商品价值，同时也是判断其成熟与否的关键指标。冬瓜以老熟果实为食用器官，其果皮颜色主要有银灰、黄、绿、黑(墨绿)等多种类型。由于各地消费习惯不同，对冬瓜果皮颜色的要求各有差异，如在广东、广西、福建、海南等华南地区，以食用黑色冬瓜为主；而北方地区则以食用银灰或黄色果皮冬瓜为主。由此可见，果皮颜色是影响冬瓜外观品质的重要性状。

由于果皮颜色为冬瓜果实的重要性状，在结果前难以区分。因此，如何在苗期对果实皮色做鉴定，并减少工作量成为了难题。开发与皮色相关的分子标记，能够在苗期进行分子标记辅助选择，可提高选择的准确性，缩小育种群体，从而加速育种进程，提高育种效率。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物，该引物能产生黑皮材料特异性标记和黄皮材料特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。

本发明的第二个目的在于提供一种冬瓜皮色的鉴定方法，该方法准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便。

本发明的第三个目的在于提供上述控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物在鉴定冬瓜皮色中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物，所述引物包括上游引物PC-F和下游引物PC-R，其中上游引物PC-F的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，下游引物PC-R的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

本发明申请人早期以黑皮冬瓜B227与黄皮冬瓜B214为亲本构建6世代分离群体，研究果皮颜色的遗传规律，结果显示黑色与黄色为一对核基因控制的质量性状，黑色对黄色为显性。随后，利用F₂群体构建冬瓜高密度遗传图谱，将皮色基因定位于第5号染色体，与两侧标记间的遗传距离分别为1.0cM和1.9cM。

进一步根据冬瓜全基因组De Novo测序(B227)和146份核心资源(包含B214)的基因组重测序信息，重点比较皮色基因粗定位区间内的序列，筛选到一个候选基因MYC类转录因子，将其命名为BhMYC2。通过比较黑皮亲本与黄皮亲本基因组中BhMYC2序列，发现在黑皮亲本中存在1个6bp碱基的插入。

所述indel分子标记引物位于插入位点两侧，所述插入位点是：控制冬瓜黑色果皮和黄色果皮的基因定位于第5号染色体，与黄皮亲本B214(如序列表SEQ ID NO.5所示)相比，黑皮亲本B227中该基因在121bp处有一个6bp碱基的插入(如序列表SEQ ID NO.6所示)，该6bp碱基的插入位置即为插入位点。

在插入位点两侧设计一对特异性控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物，命名为PC-F和PC-R。

具体的，该indel分子标记的上游引物和下游引物的具体核苷酸序列分别如下：

PC-F：5’-GGATGACAACGCCTCCATGA’(SEQ ID NO.1)；

PC-R：5’-GACGGGTTTACTCGGGTCAG’(SEQ ID NO.2)。

以上indel分子标记引物带型清晰、重复性好，经特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，分析结果得知：该indel分子标记引物能产生142bp的黑皮亲本B227特异性标记PC₁₄₂(SEQ ID NO.4)和136bp的黄皮亲本B214特异性标记PC₁₃₆(SEQ ID NO.3)。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种冬瓜皮色的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取冬瓜叶片的基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用上述的indel分子标记引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)当indel分子标记引物仅产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物能同时产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂和136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物仅产生136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黄皮冬瓜。

在该冬瓜皮色的鉴定方法中：

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应体系包括1μL浓度为200ng·μL^-1的基因组DNA、2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer、1.5μL浓度为2.5mM的dNTPs、1μL浓度为10mM的上游引物PC-F、1μL浓度为10mM的下游引物PC-R、1U Taq酶、添加ddH₂O至20μL。

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

优选的，步骤(3)中凝胶电泳时采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物在鉴定冬瓜皮色中的应用。

本发明通过对电泳结果进行分析，该indel标记能产生142bp的黑皮亲本B227特异性标记PC₁₄₂和136bp的黄皮亲本B214特异性标记PC₁₃₆。由于该标记为共显性标记，同时具有亲本特异性条带的单株为杂合体。

因此，当indel分子标记引物仅产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物能同时产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂和136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物仅产生136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黄皮冬瓜。

因此，本发明中的控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物能用于冬瓜皮色的鉴定。

本发明具有如下优点：

(1)本发明中的indel分子标记引物能同时产生黑皮亲本B227特异性标记和黄皮亲本B214特异性标记，且特异性强；

(2)本发明的方法可在苗期快速鉴定冬瓜的果皮表型(冬瓜皮色)；

(3)本发明方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1-2中冬瓜皮色基因indel标记的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(M：100bp LadderⅠ分子量标准；B227：黑皮亲本，B214：黄皮亲本；F₁：B214与B227间的杂种一代)；

图2为实施例3中该标记在第1-96号F_4:5家系单株中的扩增结果；

图3为实施例3中该标记在第97-192号F_4:5家系单株的扩增结果；

图4为实施例3中该标记在第193-288号F_4:5家系单株的扩增结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物的开发及验证过程如下：

根据冬瓜皮色基因定位及候选基因筛选等前期研究结果，设计1对特异indel标记黑皮亲本B227、黄皮亲本B214及其F₁(B214与B227间的杂种一代)中进行扩增，结果该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示：

PC-F：5’-GGATGACAACGCCTCCATGA-3’(SEQ ID NO.1)；

PC-R：5’-GACGGGTTTACTCGGGTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；

以冬瓜基因组DNA为模板，使用上述indel分子标记引物进行PCR扩增—对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，结果如图1所示，分析图1中结果得知：该标记能产生142bp的黑皮亲本B227特异性标记PC₁₄₂和136bp的黄皮亲本B214特异性标记PC₁₃₆。

实施例2

本实施例提供的冬瓜皮色的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)冬瓜DNA的提取

实验材料为B227、B214及F1的新鲜叶片，提取基因组DNA步骤如下：

①取少量新鲜叶片放入2mL离心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干时迅速加入800μL 2％CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴45min(每隔10min摇匀一次)；

②静置至室温后，加入800μL的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置2min后离心，12000rmp，15min，取上清(约510μL)转移至新的1.5mL离心管；

③加入上清液1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入上清液1.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，轻柔混匀后置于-20℃30min-1h；

④12000rmp，离心10min，弃上清；

⑤向离心管中加入75％乙醇(预冷的)洗涤DNA沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；

⑥加入50μL TE(或ddH₂O)溶解，作为冬瓜基因组DNA备用。

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用实施例1中设计出的indel分子标记引物进行PCR扩增。

PCR体系(20μL)

PCR扩增的程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃终延伸7min，置于4℃保存。

(3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测

①将PCR产物加入4μL 6×Loading buffer，甩下后涡旋混匀；

②取2μL扩增产物用8％(质量百分比)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180V稳压60min；

③将PAGE胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％AgNO₃溶液染色10min；

④用蒸馏水洗2遍，再用2％NaOH、0.04％Na₂CO₃、0.4％甲醛显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。

(4)扩增结果

该indel引物在黑皮亲本B227中扩增出142bp的条带，在黄皮亲本B214中扩增出136bp的条带(见图1)。

回收特异条带，送生工公司测序。136bp、142bp条带的序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示，分别与B227和B214扩增产物的序列相符。

当indel分子标记引物仅产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物能同时产生142bp的黑皮亲本特异性标记PC₁₄₂和136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黑皮冬瓜；当indel分子标记引物仅产生136bp的黄皮亲本特异性标记PC₁₃₆时，该冬瓜为黄皮冬瓜。

实施例3

采用实施例2的方法对B227与B214的F4:5家系群体(F2群体自交一代是F2:3家系、再自交一代是F3:4、然后是F4:5)单株进行验证。该群体共计288株，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(见图2、图3、图4)；根据图2-4中的说明，两条带是杂合的带型是黑皮，一条带的，大片段是黑皮，小片段是黄皮。

通过标记检测结果发现，142bp带型的单株有124个(黑皮纯合)，136bp带型的单株有120个(黄皮纯合)，杂合带型44个(黑皮杂合)。

田间性状纯度鉴定结果表明，288个单株中，168个为黑色果皮，120个为黄色果皮，与标记检测结果一致，准确率达到100％。

以上实施例表明，本发明的方法可将黑色果皮与黄色果皮材料进行有效区分，准确并快速检测出材料的果皮颜色表型。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种冬瓜皮色基因的indel分子标记引物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 1

ggatgacaac gcctccatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 2

gacgggttta ctcgggtcag 20

<210> 3

<211> 136

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 3

ggatgacaac gcctccatga tggatgtttt catgaacacc gatctcagtt ctttctgggt 60

tacgccgccg cagccgcagc cgcagcaact tcctcaccca ccctattcga cgtcaactga 120

cccgagtaaa cccgtc 136

<210> 4

<211> 142

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 4

ggatgacaac gcctccatga tggatgtttt catgaacacc gatctcagtt ctttctgggt 60

tacgccgccg cagccgcagc cgcagccgca gcaacttcct cacccaccct attcgacgtc 120

aactgacccg agtaaacccg tc 142

<210> 5

<211> 2043

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 5

atgactgact accgtttacc ccccaccatg aatctctggg cggatgacaa cgcctccatg 60

atggatgttt tcatgaacac cgatctcagt tctttctggg ttacgccgcc gcagccgcag 120

caacttcctc acccacccta ttcgacgtca actgacccga gtaaacccgt cggtcaagca 180

ccaccaccgt cggtttttaa ccaagagact cttatgcagc gtctccaaac gttgattgaa 240

ggtgctcatg agaactggac ttacgctatt ttctggcagt cttcgtatga ttattccggc 300

ggtacggtgt tggggtgggg agatggatat tataaagggg aggaagataa agggaaagag 360

aaagcgaaat cgagcacttc gaaagcagag caagagcacc ggaagaaggt acttcgtgag 420

cttaattctc tcatttctgg ttctcctacc tctgaaggtg acgccgtcga tgaggttgtc 480

accgacaccg agtggttcta cttggtgtcg atgactcaat cgtttatatc cggtattgga 540

ttgcccggtc aggcgttttt cgattcgaac cctatttggg ttgctggttc ggatcggctt 600

gcgagttcgt tctgtgagcg agctcgtcag ggtcaggttt tcgggttgca gactatggtt 660

tgtatcccgt cggcgaacgg agttgttgaa ttgggatcga gtgatttgat ttttcaaaac 720

tccgatctga tgaataaggt tagggttttg tttaatttca ataatctgga ggttgagact 780

tggccaatta gtggggttga ccaaggggaa aatgatcctt cttcgctttg gattagcgaa 840

ccatcttcaa acgccgccat tgaaattact aatcctgttg cttcagcttc agttccaact 900

ccaagcacaa caaacagcca accgatttcc aaaattacaa cagagtcgat cgagaaccaa 960

cctaaatcta gtgttgtgat tgaaactcca agctctgcta cccctcctcc ttctcaaaaa 1020

actcaccgac tgtcacagcc gattcagaca cagagcttct tcaacaacag ggaattgaat 1080

ttctctgaat ttgggtatga gaatggccgg ttgaaggatg ggaattcgac atcgttgaag 1140

ccggaatctg gtgagattct gaattttggg gagagtaaga ggaattctta ccccaacaca 1200

gataacaact tgccttctgg aaattcttta tttggtgggg atgagaacaa gaagaagagg 1260

tctcccactt cacgtgggag taatgaagag gggatgcttt cttttacttc tggtgtgatt 1320

cttccttctt ctgggggtgt gaaatcgggt gtttgtgctg gcgattctga tcactctgat 1380

cttgaagctt cggtgattcg tgaggtggag agtagtagag tggtggaacc ggagaaacgg 1440

cctcgaaaaa gagggcgaaa gccagcaaat ggtagagaag aaccattgaa tcacgttgaa 1500

gcagaaaggc agagaagaga aaagcttaac caaagattct atgctcttcg agctgttgtt 1560

ccgaatgtat cgaaaatgga caaagcttca ctccttggtg atgctatctc ttacatcaat 1620

gaactcagag ggaagcttca aactgcagaa tcagataaag aggatttgca gaagcaattg 1680

gattcagtga agaagttaat gatatcttct agtaaagatc cgtgcatatc aagctcaaat 1740

caacccccac cagatcaaga cataaaatca tcaaatataa accataacga tatcgaaacc 1800

gatatcgacg tgaagataat cagttgggat gctatgatcc gaatccaatc tagtaagaaa 1860

aaccatcctg ctgcacgact gatggtggct ttggaagaac ttgacttgga tatcaaccac 1920

gcgagcatct cagttgtcaa tgatctcatg atccaacaag caactgtgaa gatgggtagt 1980

cggttataca ctcaagacca gctaaggata gcattatcgt cgaaaattgg cacaactcgg 2040

tag 2043

<210> 6

<211> 2049

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 6

atgactgact accgtttacc ccccaccatg aatctctggg cggatgacaa cgcctccatg 60

atggatgttt tcatgaacac cgatctcagt tctttctggg ttacgccgcc gcagccgcag 120

ccgcagcaac ttcctcaccc accctattcg acgtcaactg acccgagtaa acccgtcggt 180

caagcaccac caccgtcggt ttttaaccaa gagactctta tgcagcgtct ccaaacgttg 240

attgaaggtg ctcatgagaa ctggacttac gctattttct ggcagtcttc gtatgattat 300

tccggcggta cggtgttggg gtggggagat ggatattata aaggggagga agataaaggg 360

aaagagaaag cgaaatcgag cacttcgaaa gcagagcaag agcaccggaa gaaggtactt 420

cgtgagctta attctctcat ttctggttct cctacctctg aaggtgacgc cgtcgatgag 480

gttgtcaccg acaccgagtg gttctacttg gtgtcgatga ctcaatcgtt tatatccggt 540

attggattgc ccggtcaggc gtttttcgat tcgaacccta tttgggttgc tggttcggat 600

cggcttgcga gttcgttctg tgagcgagct cgtcagggtc aggttttcgg gttgcagact 660

atggtttgta tcccgtcggc gaacggagtt gttgaattgg gatcgagtga tttgattttt 720

caaaactccg atctgatgaa taaggttagg gttttgttta atttcaataa tctggaggtt 780

gagacttggc caattagtgg ggttgaccaa ggggaaaatg atccttcttc gctttggatt 840

agcgaaccat cttcaaacgc cgccattgaa attactaatc ctgttgcttc agcttcagtt 900

ccaactccaa gcacaacaaa cagccaaccg atttccaaaa ttacaacaga gtcgatcgag 960

aaccaaccta aatctagtgt tgtgattgaa actccaagct ctgctacccc tcctccttct 1020

caaaaaactc accgactgtc acagccgatt cagacacaga gcttcttcaa caacagggaa 1080

ttgaatttct ctgaatttgg gtatgagaat ggccggttga aggatgggaa ttcgacatcg 1140

ttgaagccgg aatctggtga gattctgaat tttggggaga gtaagaggaa ttcttacccc 1200

aacacagata acaacttgcc ttctggaaat tctttatttg gtggggatga gaacaagaag 1260

aagaggtctc ccacttcacg tgggagtaat gaagagggga tgctttcttt tacttctggt 1320

gtgattcttc cttcttctgg gggtgtgaaa tcgggtgttt gtgctggcga ttctgatcac 1380

tctgatcttg aagcttcggt gattcgtgag gtggagagta gtagagtggt ggaaccggag 1440

aaacggcctc gaaaaagagg gcgaaagcca gcaaatggta gagaagaacc attgaatcac 1500

gttgaagcag aaaggcagag aagagaaaag cttaaccaaa gattctatgc tcttcgagct 1560

gttgttccga atgtatcgaa aatggacaaa gcttcactcc ttggtgatgc tatctcttac 1620

atcaatgaac tcagagggaa gcttcaaact gcagaatcag ataaagagga tttgcagaag 1680

caattggatt cagtgaagaa gttaatgata tcttctagta aagatccgtg catatcaagc 1740

tcaaatcaac ccccaccaga tcaagacata aaatcatcaa atataaacca taacgatatc 1800

gaaaccgata tcgacgtgaa gataatcagt tgggatgcta tgatccgaat ccaatctagt 1860

aagaaaaacc atcctgctgc acgactgatg gtggctttgg aagaacttga cttggatatc 1920

aaccacgcga gcatctcagt tgtcaatgat ctcatgatcc aacaagcaac tgtgaagatg 1980

ggtagtcggt tatacactca agaccagcta aggatagcat tatcgtcgaa aattggcaca 2040

actcggtag 2049

Claims

1.一种控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物，其特征是所述引物包括上游引物PC-F和下游引物PC-R，其中上游引物PC-F的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，下游引物PC-R的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

2.一种冬瓜皮色的鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

(1)提取冬瓜叶片的基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1中的indel分子标记引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3.根据权利要求2所述的冬瓜皮色的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应体系包括1μL浓度为200ng·μL^-1的基因组DNA、2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer、1.5μL浓度为2.5mM的dNTPs、1μL浓度为10mM的上游引物PC-F、1μL浓度为10mM的下游引物PC-R、1U Taq酶、添加ddH₂O至20μL。

4.根据权利要求2所述的冬瓜皮色的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

5.根据权利要求2所述的冬瓜皮色的鉴定方法，其特征是：步骤(3)中凝胶电泳时采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.权利要求1所述的控制冬瓜皮色基因的indel分子标记引物在鉴定冬瓜皮色中的应用。