CN111793713A - 一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用，该组引物包括7个点位所对应的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示；在对墨地龙冬瓜进行杂交种纯度鉴定时，首先提取待检测样品种子的基因组DNA作为模板，然后利用上述引物进行PCR扩增，最后通过电泳对扩增产物进行检测，通过对父母本与杂交种的带型进行比对，得到真杂交种数与可观测到条带的种子总数的比例，即杂交纯度。本发明提供的InDel标记可实现对亲本及杂交种的有效区别，鉴定成本低、效率高，且鉴定结果与田间鉴定结果的吻合度达99％以上。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，特别地，涉及一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用。
背景技术
分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的新遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异，可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因此被广泛应用于遗传育种、基因定位和多样性分析中。在植物遗传研究中常用的分子标记方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)和简单重复序列标记(SSR)等，但上述技术存在如下缺陷：RFLP需要放射性同位素的参与，技术较复杂；RAPD实验重复性较差，结果可靠性较低；SSR相比前两者较为简单、便宜，重复性较好，但有些扩增条带不清楚及出现假等位基因、无效等位基因等技术缺陷，导致SSR标记在基因型分型和数据分析上容易产生错误。近年来，随着基因组测序技术的快速发展，出现了包括InDel和SNP在内的第三代新型分子标记类型，其具有经济实用、特异性高、稳定性好等特点。
InDel标记指的是在近缘种或同一物种的不同个体间同源序列的等位基因位点上插入或缺失一定的核苷酸片段的分子标记。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。就分布密度而言，InDel仅次于SNP，但远高于SSR，而SNP受限于基因型分型技术，在小型和中型检测中需要特殊的设备，成本高且操作复杂。因此，InDel标记的应用前景广阔。
目前，我国对于冬瓜商品种的杂交纯度鉴定基本采用田间鉴定法，即根据作物在形态学上的表现来判断种子是否为杂交，该方法检测周期长、费时费工、土地占用面积大，加之可用于鉴定杂交种纯度的形态特征数量有限，且多数形态特征还易受环境影响，不能满足当年生产需要。
事实上，我国关于冬瓜分子标记开发利用方面的研究相对较少，也尚未有涉及冬瓜InDel标记应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用，以解决背景技术中提出的问题。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物，包括7个点位所对应的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示。
将上述InDel分子标记引物应用于对墨地龙冬瓜杂交种进行纯度鉴定。
鉴定方法为：首先提取墨地龙冬瓜待检测样品种子的基因组DNA作为模板，然后利用所述InDel分子标记引物进行PCR扩增，最后通过电泳对扩增产物进行检测，通过对父母本与杂交种的带型进行比对，得到真杂交种数与可观测到条带的种子总数的比例，即杂交纯度。
所述鉴定方法具体包括如下步骤：
1)预处理：对墨地龙冬瓜的杂交种子进行温汤浸种，浸种完成后用清水冲洗掉种子表面的粘液，然后将种子置于清水中在室温下保存8～12小时，沥干水分备用；
2)DNA提取：对步骤1)所得的种子进行催芽生根，待胚根长至1cm以上时选取根尖组织加入碱液并用沸水加热，然后加入缓冲液进行中和，将提取液冷却至室温；
3)PCR扩增：以步骤2)所得的提取液中的DNA为模板，加入至少一对InDel分子标记引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
4)电泳：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对步骤3)所得的扩增产物进行分离，使不同大小的扩增产物处于不同的位置；
5)银染检测：利用硝酸银染色液和显影液使凝胶上的条带显现，拍照观察并统计条带差异；
6)统计结果：对比父母本与杂交种子的带型，同时具有父母本双方特征带的种子为真正的杂交种，杂交种的数量与显现出条带的种子总数的比例即为杂交纯度。
上述InDel分子标记引物在墨地龙冬瓜的遗传图谱构建、遗传多样性分析以及分子辅助育种中的应用。
本发明提供的技术方案至少具有如下有益效果：
1、本发明采用了InDel标记，较之SSR标记具有远远超出的分布密度，较之SNP标记则呈现出共显性，可利用电泳平台进行分型，快捷经济，不需要复杂的实验仪器，可操作性强，且InDel标记在开发过程中变异稳定、准确性高，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊等问题。
2本发明采用分子标记形式，从DNA水平揭示了双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠；而且由于可在种子阶段进行鉴定，相比于田间鉴定要等到果实形成后结合植株发育后期的表现进行综合判断，无疑大大地缩短了实验周期，提高了鉴定效率，并节省实验成本，时间效果和经济效果显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是墨地龙冬瓜7个InDel标记PCR产物的电泳图谱；图1(a)和图1(b)分别是部分InDel标记PCR产物的电泳图谱，其中，9号引物对应chr640818838，12号引物对应chr412955559，16号引物对chr1252341989，17号引物对应chr1223923504，22号引物对应chr717248263，24号引物对应chr413443261，25号引物对应chr245098788，marker为聚合美的MF228。
图2是利用各InDel标记进行墨地龙冬瓜杂交种纯度鉴定的电泳图谱；其中，图2(a)为chr640818838对应引物的电泳图谱，图2(b)为chr1252341989对应引物的电泳图谱，图2(c)为chr1223923504对应引物的电泳图谱，图2(d)为chr412955559对应引物的电泳图谱，图2(e)为chr245098788对应引物的电泳图谱，图2(f)为chr413443261对应引物的电泳图谱，图2(g)为chr717248263对应引物的电泳图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：InDel分子标记的获得
通过对墨地龙冬瓜的全基因组重测序，获得了466条InDel标记，选择其中的26条进行PCR扩增，其中有7条InDel标记对应的引物获得了与父母本有明显区别的电泳条带，如下表1所示。
表1 7对InDel标记引物对应PCR扩增产物的条带特征
剩余的InDel标记虽然也可以获得条带，但是由于父母本与子代之间的差异不明显，在电泳条带上不容易用肉眼进行区别，因此不适用于快速准确地鉴定种子纯度，只有可稳定扩增且条带差异较大的InDel标记才是筛选目标。
实施例2：利用InDel分子标记引物对墨地龙冬瓜进行杂交纯度鉴定
(一)DNA提取
1、称取8g(约150粒)墨地龙冬瓜种子放入小尼龙袋中，将种子置于55℃的温水中浸种30min，浸种过程中不断搅拌，使种子受热均匀以及避免部分未能浸种，用清水冲洗掉种子外面表层的黏液，然后将种子置于清水中在室温放置8～12h，沥干水分备用；
2、用0.1％的升汞对催芽盒进行8～10min消毒，清水冲洗干净后备用，在催芽盒中铺设两层催芽试纸并加水保持湿润，将上述种子均匀分布于催芽盒中进行催芽，催芽温度设定为28～30℃，每天在催芽盒中加蒸馏水以保持催芽试纸湿润，一般3-5d就会萌发，待胚根长至1cm以上时进行取样；
3、用镊子和手术刀选取0.5cm左右的根尖组织放入96孔PCR板中，加入50ml浓度为0.1mol/L的NaOH溶液于沸水中加热5min，然后加入150ml浓度为0.1mol/L的Tris-HCl进行中和，冷却后取适量提取液为模板进行PCR扩增，提取的DNA可置于-20℃条件下保存。
(二)PCR扩增
使用步骤(一)中提取的DNA为模板，加入任意一对InDel分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
PCR扩增体系为10μL，PCR体系为2×PCR mix 5μL，F引物和R引物各0.3μL，模板1.5μL，补足dd H2O至10μL，PCR扩增程序为95℃5min，95℃30s，59-60℃30s，72℃90s，循环35次，72℃5min，16℃保存。
(三)聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、制胶
①玻璃板准备
用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将正反面玻璃用塑胶封严，斜立于电泳槽外备用；
②玻璃板密封
将1％琼脂糖用微波炉加热融化，用吸管吸取少量琼脂糖溶液，沿玻璃板底边的缝隙加入，使其密封，因存在虹吸现象，琼脂糖会进入双层玻璃中的夹缝中，使虹吸高度在0.5～1cm即可，待其冷却凝固后备用；
③PAGE凝胶的制备
配方：40％的丙烯酰胺溶液8ml；10倍的TBE缓冲溶液4ml；双蒸水16ml，20％的过硫酸铵200μL；四甲基乙二胺溶液20μL；将各成分称量好后均匀混合以备灌胶。
④灌胶
将玻璃板垂直放入电泳槽中，固定好后将电泳槽倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，灌胶完成后，放入制孔梳子，待胶体颜色变为浅白色时表示凝胶已凝固，灌入电泳缓冲液，液面没过下层玻璃5mm左右，取出制样梳子后，准备开始点样电泳；
2、上样电泳
①点样
用微量移液器吸取1.8μl的PCR扩增产物点入胶孔内，每块胶都要点上marker标记，为了确保各个胶孔之间都相互隔离，在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端，观察是否有渗漏现象；
②电泳
点样结束后，接通电源，调节电压至180V进行电泳，电泳时间为120min，电泳时间也可根据PCR产物的分子量适当延长，以扩增的DNA条带充分展开为止；
(四)银染
1、冲洗
用蒸馏水漂洗凝胶2次，每次2min，凝胶从水中取出后，控水10～20s；
2、染色
在1500ml蒸馏水中加入1.5g硝酸银，搅拌均匀后配好染色液，将凝胶放入染色液中，缓慢摇动，染色8min；
3、水洗
将染好色的凝胶放入蒸馏水中冲洗10s，迅速取出控水；
4、显影
在1500ml蒸馏水中加入22.5g氢氧化钠和6ml甲醛，搅拌均匀后配好显影液，将凝胶放入显影液中，缓慢摇动10min以上，直到条带显现为止；
5、冲洗
用蒸馏水漂洗凝胶2min，用保鲜膜将凝胶包裹后在显色板上拍照观察，统计条带差异。
(五)观察电泳检测结果
将父母本与杂交种子的带型进行对比，父本具有1条共显性特征带，母本具有1条共显性特征带，同时具有父母双亲本的2条特征带的种子鉴定为真正的杂交种，而缺少其中的任意一个条带均视为假杂种(如混入的亲本种子等)，杂交种的数量与显现出条带的种子总数的比例即为杂交纯度。
取7组不同批次的冬瓜种子，每组种子均分别采用传统的田间鉴定法以及实施例2中的方法进行杂交纯度鉴定，所得结果如下表2所示
表2不同方法对于冬瓜杂交纯度鉴定的结果
在本实施例中：1、从种子到得出鉴定结果所需的时间由传统的90d缩短至6-7d，鉴定效率大大提高。2、传统的田间鉴定方法每亩可鉴定1000株，每个样品100株，成本价在0.8万元左右，则平均每个的样品鉴定成本为800元，而采用本发明申请方法则每个样品鉴定的成本控制在150元以内，仅为传统方案的20％左右，经济效益明显。3、经过不同批次墨地龙冬瓜样品田间鉴定纯度对比，数据吻合度达99％以上。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。在本发明的精神和原则之内，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的任何改进或等同替换，直接或间接运用在其它相关的技术领域，均应包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南省蔬菜研究所
<120> 一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用
<130> Q20F0325
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttcactta gccaccccaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
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<400> 3
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<211> 18
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<400> 7
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<212> DNA
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cccattctcg tctcttcccc 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcgtccgaca tttgctgc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggagctaag cgatgcgt 18
Claims (7)
1.一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物，其特征在于，包括7个点位所对应的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示。
2.如权利要求1所述的一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物在墨地龙冬瓜杂交种纯度鉴定方面的应用。
3.一种利用权利要求1所述的InDel分子标记引物鉴定墨地龙冬瓜纯度的方法，其特征在于，首先提取墨地龙冬瓜待检测样品种子的基因组DNA作为模板，然后利用所述InDel分子标记引物进行PCR扩增，最后通过电泳对扩增产物进行检测，通过对父母本与杂交种的带型进行比对，得到真杂交种数与可观测到条带的种子总数的比例，即杂交纯度。
4.根据权利要求3所述的鉴定墨地龙冬瓜纯度的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)预处理：对墨地龙冬瓜的杂交种子进行温汤浸种，浸种完成后用清水冲洗掉种子表面的粘液，然后将种子置于清水中在室温下保存8～12小时，沥干水分备用；
2)DNA提取：对步骤1)所得的种子进行催芽生根，待胚根长至1cm以上时选取根尖组织加入碱液并用沸水加热，然后加入缓冲液进行中和，将提取液冷却至室温；
3)PCR扩增：以步骤2)所得的提取液中的DNA为模板，加入至少一对InDel分子标记引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
4)电泳：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对步骤3)所得的扩增产物进行分离，使不同大小的扩增产物处于不同的位置；
5)银染检测：利用硝酸银染色液和显影液使凝胶上的条带显现，拍照观察并统计条带差异；
6)统计结果：对比父母本与杂交种子的带型，同时具有父母本双方特征带的种子为真正的杂交种，杂交种的数量与显现出条带的种子总数的比例即为杂交纯度。
5.如权利要求1所述的一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物在墨地龙冬瓜遗传图谱构建中的应用。
6.如权利要求1所述的一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物在墨地龙冬瓜遗传多样性分析中的应用。
7.如权利要求1所述的一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物在墨地龙冬瓜分子辅助育种中的应用。
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