CN105177142A - 一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鱼类育种技术领域，本发明公开了一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法。所述线纹海马微卫星标记如SEQ.ID.NO:1~9中所示，所述微卫星标记的筛选方法，步骤包括：1）通过转录组测序筛选到线纹海马的Unigenes；2）在Unigenes序列中检测微卫星位点；3）根据微卫星位点两端序列设计其特异性引物；4）进行PCR扩增并检测其多态性，获得了9个微卫星标记。本发明首次公开了关于线纹海马的微卫星标记及其特异性引物，本发明中的线纹海马微卫星标记可应用于线纹海马种群的种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等研究。
Description
技术领域：
本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法。
背景技术：
海马，属海龙科(Syngthidae)、海马属(Hippocampus)，是一种名贵海洋中药材，在我国素有“南方人参”之称，具有补肾壮阳、强心催产、止血镇痛、镇静安神的功效，同时还具有很高的观赏价值和收藏装饰品的功能。在过去几十年中，由于长期过度捕捞、环境污染和气候变化等因素，海马种质资源受到严重退化的威胁，有些海马种甚至到了灭绝的边缘。为了有效保护海马的种质资源，38种海马被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)2012年濒危动物红色名录。因此，研究其种群遗传结构和遗传变异水平至关重要。线纹海马(HippocampuserectusPerry，1810)主要分布在大西洋西岸，是典型的热带亚热带型海马种群，其繁殖力强、个体较大、体型优美，其生长速率最快，目前已经发展为我国主要的养殖品种之一。微卫星标记因具有多态性丰富、共显性、操作简便等优点，已经成为目前动植物群体遗传分析、遗传背景分析、家系鉴定和野生资源保护等最常用的工具之一。然而，迄今为止针对线纹海马开发的微卫星标记尚未有记载，亟待开发。另一方面，目前微卫星开发主要采用富集文库法，需要进行DNA提取、基因组文库构建、探针杂交富集、克隆筛选等步骤，费时费力，通常只能得到少量标记。因此急需一种高效的线纹海马微卫星标记开发技术。
发明内容
本发明解决的技术问题在于针对现有线纹海马分子标记缺乏而提供一种微卫星标记及其筛选方法。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
本发明首次公开了一种线纹海马微卫星标记，所述微卫星标记序列如SEQ.ID.NO:1～9中所示。
本发明还提供了特异性扩增所述的线纹海马微卫星标记的引物，所述引物为SEQ.ID.NO：10+SEQ.ID.NO：11、SEQ.ID.NO：12+SEQ.ID.NO：13、SEQ.ID.NO：14+SEQ.ID.NO：15、SEQ.ID.NO：16+SEQ.ID.NO：17、SEQ.ID.NO：18+SEQ.ID.NO：19、SEQ.ID.NO：20+SEQ.ID.NO：21、SEQ.ID.NO：22+SEQ.ID.NO：23、SEQ.ID.NO：24+SEQ.ID.NO：25和SEQ.ID.NO：26+SEQ.ID.NO：27。
进一步地，本发明提供所述的线纹海马微卫星标记的筛选方法，所述方法步骤如下：
S1.提取线纹海马样品的总RNA，合成cDNA、将cDNA文库进行均一化处理，建立测序文库；
S2.采用IlluminaHiSeqTM2000测序，获得线纹海马原始序列；
S3.将步骤S2中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，对其进行从头组装得到线纹海马的Unigenes；
S4.对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找；
S5.根据步骤S4中微卫星位点的两端序列设计特异性引物；
S6.提取线纹海马基因组DNA；
S7.采用步骤S5中的特异性引物对步骤S6中的DNA进行PCR扩增；
S8.检测步骤S7中PCR产物的多态性，获得权利要求1所述的线纹海马微卫星标记。
本发明所述的构建方法高效、简便，能一次开发较多线纹海马微卫星标记。
优选地，利用TRIzol法对步骤S2中线纹海马的鳍条进行RNA提取。
优选地，步骤S3中采用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。
优选地，步骤S4中用MISA软件对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找。
用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个含有微卫星位点的序列，微卫星位点查找时重复次数为5～64，其中22582个单核苷酸重复序列，9311个二核苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核苷酸重复序列，33个六核苷酸重复序列。
在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer5软件设计微卫星位点的特异性引物，其中，筛选得到的具有扩增稳定、PCR产物杂带少的引物如表2所示；
优选地，步骤S6中线纹海马的DNA利用醋酸铵/异戊醇法对其鳍条进行提取。
优选地，以DNA为模板，利用设计好的引物进行微卫星标记PCR扩增。步骤S7中的PCR扩增的反应体系为10μL，包括：50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1UTaq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。
优选地，步骤S7中的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(不同位点设计的特异性引物具有不同的最佳退火温度)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
优选地，步骤S8中的微卫星PCR产物的多态性利用8％的非变性的聚丙烯凝胶电泳进行验证。
表1.本发明具有特异性的线纹海马微卫星引物序列信息
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次在线纹海马上建立了具有丰富多态性的微卫星标记，且对线纹海马的家系鉴定准确率高达97％以上，为线纹海马的种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等研究提供了强有力的工具；
2、本发明所使用的开发微卫星标记的方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1、线纹海马微卫星位点和特异性引物的获得和验证：
线纹海马样品收集及RNA提取：
从海马养殖公司中挑选30条健康、性腺发育良好的海马，剪取其背鳍鳍条，立即提取totalRNA，具体步骤如下：(1)将线纹海马的鳍条约50mg放入预冷的研钵中，利用液氮迅速研磨成粉末，放入2mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min，待溶液分层；(3)4℃，12,000r/min离心15min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min离心10min，弃去上清，短暂离心，吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7,500r/min离心5min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室温晾干乙醇，加入20μLDEPC处理水使RNA充分溶解，-80℃保存备用；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。
线纹海马转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点：
应用SMARTTMcDNA文库构建技术，对RNA样品进行cDNA的双链合成，用Trimmer-directcDNAnormalizationkit对全长cDNA进行均一化处理。采用IlluminaHiSeqTM2000进行测序，获得原始序列。去除原始序列的接头和低质量序列，获得高质量序列，采用Trinity软件对其进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。
用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个微卫星位点，微卫星位点查找时重复次数为5～64，其中22582个单核苷酸重复序列，9311个二核苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核苷酸重复序列，33个六核苷酸重复序列。
线纹海马基因组DNA提取：
线纹海马DNA的制备采用醋酸铵/异戊醇法进行，具体步骤如下：(1)将线纹海马的鳍条约50mg放入2mL离心管中；(2)离心管中加入600μL的组织裂解液(Tris-HCl100mM，pH8.0；EDTA50mM，pH8.0；SDS1％，pH8.0；NaCl125mM)，用干净的剪刀将组织剪碎；(3)65℃水浴2～4h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；(4)冷却到室温；(5)向离心管中加入200μL的7.5M的醋酸铵(NH4AC)，混匀，冰上放置5～10min；(6)4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μL)到另一干净1.5mL离心管中；(7)加入等体积的异丙醇，轻摇，放置1～2min；(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；(9)加入1ml70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量TE溶液(200-500μL)溶解DNA样品，每个DNA样品加入10mg/mLRNA酶1μL；(10)取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量；(11)将得到的DNA用双蒸水稀释成100ng/μL的工作液，-20℃备用。
微卫星位点PCR扩增和多态性验证：
以线纹海马的DNA为模板，在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer5软件设计微卫星位点的特异性引物，进行PCR扩增，体系为10μL，包括50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1UTaq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各个微卫星位点的最佳退火温度不同)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
PCR扩增完成后，利用8％的非变性聚丙烯凝胶电泳验证其多态性，具体步骤如下：(1)胶的制备：用自来水和洗涤剂把玻璃长板和耳板洗净晾干后夹紧，配制PAGE胶(纯水41mL，5×TBEBuffer14mL,40％丙烯酰胺14mL，10％APS650μL，TEMED65μL)并沿灌胶口灌进两个板中间，轻轻插上梳子，聚合至少2h。(2)电泳：将玻璃板放入电泳槽，上下槽分别加入0.5×TBEBuffer，将梳子拔出并加样，150V恒电压电泳120min。(3)银染：电泳完成后将胶取出，用纯水浸泡片刻；用0.1％AgNO3浸泡并轻摇20min左右；用纯水摇晃洗涤；称取10gNaOH和0.4gNa2CO3配制0.5L显色液，量取1.5mL甲醛加入其中，轻摇显色；待显色完毕，条带清晰，将胶放在纯水中终止显色；(4)置于凝胶成像系统中拍照，筛选出不同位点具有扩增稳定，杂带少的微卫星引物(见表2所示)。
表2.实施例1筛选得到的线纹海马微卫星引物序列信息
实施例2.线纹海马的家系鉴定试验：
线纹海马家系建立及样品收集：
从海马养殖公司中挑选30对健康、性腺发育良好的海马，每一个桶中放入1雌1雄的海马，在人工仿生态条件下诱导其催情、产卵、怀孕和产幼。待雄海马孵出幼海马后，立即剪取该配对组的雌、雄海马的背鳍鳍条，并收集刚出生的海马，每个家系10-15条，保存于100％的酒精中，作为家系鉴定的材料。
线纹海马亲本和子代DNA提取：
线纹海马DNA的制备采用醋酸铵/异戊醇法进行，具体步骤如下：(1)将线纹亲本的鳍条约50mg和整只幼海马放入2mL离心管中；(2)离心管中加入600μL的组织裂解液(Tris-HCl100mM，pH8.0；EDTA50mM，pH8.0；SDS1％，pH8.0；NaCl125mM)，用干净的剪刀将组织剪碎；(3)65℃水浴2～4h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀。(4)冷却到室温；(5)向离心管中加入200μL的7.5M的醋酸铵(NH4AC)，混匀，冰上放置5～10min；(6)4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μL)到另一干净1.5mL离心管中；(7)加入等体积的异丙醇，轻摇，放置1～2min；(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；(9)加入1ml70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量TE溶液(200-500μL)溶解DNA样品，每个DNA样品加入10mg/mLRNA酶1μL。(10)取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量；(11)将得到的DNA用双蒸水稀释成100ng/μL的工作液，-20℃备用。
微卫星位点PCR扩增和基因型分型：
以亲本和子代的DNA为模板，用9对微卫星引物(H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14、26)(详见表2)对所有亲本和子代进行PCR扩增，体系为10μL，包括50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1UTaq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各个微卫星位点的最佳退火温度和荧光修饰基团见表2)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
PCR扩增完成后，从每个个体的每个位点的PCR产物中吸出0.5μL，根据片段的大小和荧光标记的颜色，按照表2的组合所示，将每一个位点的PCR产物混合在一起，作为上机检测的样品。将混合1.5μL的PCR产物样品加入到ABI3730基因分析仪配置的96孔板内，每个孔内加入0.5μL的GeneScanTM350ROXTM标准片段(ABI)，另外在每个孔内加入8μL的GenescanHi-DiTM甲酰胺(ABI)，将96孔板放入PCR仪器内于95℃变性10min，变形后立即置于冰上，然后上样到ABI3730XL型基因分析仪分析。待基因分析仪电泳结束后，用软件GeneMapper4.0做基因型分析，读取各个体在各微卫星位点的基因型。
数据分析：
在线纹海马繁殖亲本在9个微卫星位点的PCR产物经基因分析仪待基因分析仪电泳结束后，根据荧光标记的颜色，用软件GeneMapper4.0(ABI)做基因型分析，读取各个体在各个微卫星位点的基因型(片段大小)。
用MicrosoftExcel统计亲本和子代在9个微卫星位点的基因型，采用软件CERVUS3.0计算子代在各微卫星座位上的等位基因频率、期望杂合度(HE)、观测杂合度(HO)和多态信息含量(PIC)、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等参数，具体结果见表3。跟据LOD值(亲子鉴定似然比的对数转换值)鉴定152尾个体的父母本。
将鉴定的结果与海马实际家系信息相比较，148尾被准确鉴定，准确率为97.37％。其中4尾没有被准确鉴定，其原因是由于DNA质量问题和操作原因，该样品有的微卫星位点没能够成功分型。
表3.实施例2中9个微卫星标记引物在线纹海马家系中的检测值
| 微卫星标记 | n | Na | HO | HE | HW | Excl 1 | Excl 2 | F(null) |
| H.ere-6 | 152 | 5 | 0.763 | 0.668 | ** | 0.255 | 0.289 | +0.001 |
| H.ere-17 | 152 | 6 | 0.822 | 0.785 | NS | 0.315 | 0.404 | +0.003 |
| H.ere-18 | 152 | 6 | 0.842 | 0.761 | ** | 0.324 | 0.375 | +0.004 |
| H.ere-15 | 152 | 7 | 0.888 | 0.767 | NS | 0.432 | 0.368 | -0.001 |
| H.ere-20 | 152 | 5 | 0.789 | 0.678 | NS | 0.268 | 0.289 | +0.012 |
| H.ere-22 | 152 | 6 | 0.739 | 0.682 | NS | 0.366 | 0.368 | +0.008 |
| H.ere-30 | 152 | 6 | 0.645 | 0.612 | ** | 0.322 | 0.354 | -0.007 |
| H.ere-14 | 152 | 8 | 0.743 | 0.674 | ** | 0.452 | 0.486 | +0.005 |
| H.ere-26 | 152 | 4 | 0.895 | 0.822 | ** | 0.218 | 0.225 | +0.011 |
| Total exclusion | 5.89 | 0.995 | 0.999 |
注：Na为等位基因数目，n为检测家系子代个体数目，HO为观察杂合度，HE为期望杂合度，HW为哈迪温伯格平衡检验，NS表示符合，**表示偏离显著，Excl1表示父本排除率，Excl2表示母本排除率，F(null)表示无效等位基因频率，Totalexclusion表示累积排除率。
对比例1：
方法同实施例2，不同的是采用的引物为表2中的H.ere-1、2、3、4、5、8、9、24和25，其结果显示如表4：
表4.对比例1中9个微卫星引物在线纹海马家系中的检测值
| 微卫星引物 | n | Na | HO | HE | HW | Excl 1 | Excl 2 | F(null) |
| H.ere-1 | 152 | 2 | 0.691 | 0.732 | ** | 0.078 | 0.058 | +0.005 |
| H.ere-2 | 152 | 3 | 0.711 | 0.756 | ** | 0.189 | 0.228 | +0.024 |
| H.ere-3 | 152 | 2 | 0.809 | 0.821 | ** | 0.112 | 0.125 | +0.004 |
| H.ere-4 | 152 | 2 | 0.842 | 0.867 | ** | 0.145 | 0.142 | -0.008 |
| H.ere-5 | 152 | 3 | 0.724 | 0.762 | ** | 0.215 | 0.252 | +0.002 |
| H.ere-8 | 152 | 3 | 0.513 | 0.622 | ** | 0166 | 0.168 | +0.014 |
| H.ere-9 | 152 | 2 | 0.559 | 0.582 | ** | 0.085 | 0.096 | -0.0015 |
| H.ere-24 | 152 | 2 | 0.737 | 0.789 | ** | 0.0788 | 0.105 | +0.0000 |
| H.ere-25 | 152 | 2 | 0.888 | 0.856 | ** | 0.112 | 0.124 | +0.0004 |
| Total exclusion | 2.33 | 0.435 | 0.576 |
从表中看出，利用该9对微卫星引物进行家系鉴定，其等位基因数量、父本和母本的排除率远远低于本发明所采用的H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14和26这9对微卫星标记的排除率。在实际应用中，利用该9对微卫星引物进行家系鉴定的准确率仅为54.25％，远低于本发明所采用的H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14和26这9对微卫星标记的准确率(97.37％)。因此，在进行线纹海马家系鉴定时，本发明所采用的微卫星引物远远优于其他引物。
同时，本发明发现，本发明所提供的9对引物在同时应用于PCR扩增时，需要将PCR扩增产物混合后，才能获得最佳的家系鉴定效果。
通过本实验，筛选到了9对(H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14、26)多态性高、扩增稳定、杂带少的微卫星标记引物，其相应扩增的微卫星标记序列分别如SEQ.ID.NO:1～9所示；而其他的微卫星标记不能达到该家系鉴定的效果。本发明所提供的线纹海马标记尤其适用于群体遗传分析、家系鉴定等实验的研究。
SEQUENCELISTING
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ggagtggtcctcggtaaag19
Claims (10)
1.一种线纹海马微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记序列如SEQ.ID.NO:1~9中所示。
2.一种特异性扩增如权利要求1所述的线纹海马微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物为SEQ.ID.NO：10+SEQ.ID.NO：11、SEQ.ID.NO：12+SEQ.ID.NO：13、SEQ.ID.NO：14+SEQ.ID.NO：15、SEQ.ID.NO：16+SEQ.ID.NO：17、SEQ.ID.NO：18+SEQ.ID.NO：19、SEQ.ID.NO：20+SEQ.ID.NO：21、SEQ.ID.NO：22+SEQ.ID.NO：23、SEQ.ID.NO：24+SEQ.ID.NO：25和SEQ.ID.NO：26+SEQ.ID.NO：27。
3.一种权利要求1所述的线纹海马微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
S1.提取线纹海马样品的总RNA，合成cDNA，将cDNA文库进行均一化处理，建立测序文库；
S2.采用IlluminaHiSeqTM2000测序，获得线纹海马原始序列；
S3.将步骤S2中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，对其进行从头组装得到线纹海马的Unigenes；
S4.对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找；
S5.根据步骤S4中微卫星位点的两端序列设计特异性引物；
S6.提取线纹海马基因组DNA；
S7.采用步骤S5中的特异性引物对步骤S6中的DNA进行PCR扩增；
S8.检测步骤S7中PCR产物的多态性，获得权利要求1所述的线纹海马微卫星标记。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用TRIzol法对步骤S2中线纹海马的鳍条进行RNA提取。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3中采用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S4中用MISA软件对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S6中线纹海马的DNA利用醋酸铵/异戊醇法对其鳍条进行提取。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S7中的PCR扩增的反应体系为10μL，包括：50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1UTaq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S7中的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min；94°C变性30s，退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸8min，最后4°C保存。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S8中的微卫星PCR产物的多态性利用8%的非变性的聚丙烯凝胶电泳进行验证。
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