CN103789441A - 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 - Google Patents
一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103789441A CN103789441A CN201410056237.1A CN201410056237A CN103789441A CN 103789441 A CN103789441 A CN 103789441A CN 201410056237 A CN201410056237 A CN 201410056237A CN 103789441 A CN103789441 A CN 103789441A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hippocampus
- hmo
- ssr
- japanese
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法,利用日本海马和三斑海马的EST序列,共设计了六对SSR分子标记引物,分别为Hmo48、Hmo421、Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8,其中Hmo242和Hmo244属于日本海马与三斑海马共有引物;Hmo48和Hmo421属于日本海马特有引物,Htr6和Htr8属于三斑海马特有引物。提取海马DNA,利用以上引物对其进行PCR扩增。本发明公开的引物在两个海马种群间特异性极高,稳定性极强,因此将PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测,可快速判断海马种群,为海马遗传多样性的保护与良种的引进提供了参考。
Description
技术领域
本发明属于鉴定鱼类物种的分子技术领域,具体涉及一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法。
背景技术
海马(Hippocampus)隶属海龙科、海马属,属国际海洋保护动物,部分种类因环境恶化和人类活动而濒临灭绝。海马是重要的水族观赏动物和名贵的中药材,具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能,特别是对于治疗神经系统的疾病更为有效,深受东南亚国家的青睐。
海马在世界范围内分布广泛,我国共有13种天然海马,近年来,随着人工养殖海马技术的成功,海马已成为我国海水养殖产业的新星。日本海马和三斑海马是我国目前养殖的重要海马种。由于海马人工繁殖技术的不规范,导致了海马种群的高度近亲繁殖,遗传多样性水平严重降低,优良品种选育已成为当前海马养殖的重要议题。
本发明专利提供了一种稳定性高,快速便捷的两种海马种群鉴别的分子标记方法。本方法开发了两个海马种群间特异性极高,稳定性极强的SSR引物,因此不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳片段分离,只需要进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种海马的SSR分子标记引物,本方法开发的两个海马种群间特异性极高,稳定性极强的SSR引物,不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳片段分离,只需要进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对种群的快速鉴定。
本发明的另一个目的在于提供了一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法,方法简单,鉴定结果准确,用时短,耗材少,费用低,比片段分离的多态性分析法更为准确实用。
本发明最后一个目的在于提供了一种海马的SSR分子标记引物在日本海马(H.mohnikei)和三斑海马(H.trimaculatus)种群鉴定中的应用。
为了实现上述目的,本发明采取以下技术措施:
一种海马种群的SSR分子标记引物,引物信息如下:
一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法,其步骤如下:
1)提取待鉴定海马的DNA;
2)用6对引物对海马个体DNA模板进行PCR扩增;
3)对6对引物的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;
4)记录6对引物各自的电泳条带信息,进行分析,鉴定种群所属。
一种分子标记引物在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用,其应用过程如下:利用本发明中引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物;引物对Hmo48和Hmo421仅可在在日本海马中扩增出高质量的SSR产物,在三斑海马中无扩增产物;引物对Htr6和Htr8仅可在在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物,在日本海马中无扩增产物。因此,根据琼脂糖凝胶电泳结果分析:若海马个体DNA在Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244四对引物PCR扩增后有高质量产物,在Htr6和Htr8两对引物PCR扩增后无扩增条带,则此个体为日本海马;若海马个体DNA在Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8四对引物PCR扩增后有高质量产物,在Hmo48和Hmo421两对引物PCR扩增后无扩增条带,则此个体为三斑海马。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明首次针对海马,发明了一种鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法,弥补了形态学鉴别的不足,为海马遗传多样性的保护与良种的引进提供了参考。
附图说明
图1为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo48条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
图2为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo421条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
图3为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo242条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
图4为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo244条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
图5为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Htr6条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
图6为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Htr8条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马,6、7、8、9、10为三斑海马。
具体实施方式
实施例1:
海马SSR分子标记引物设计
本发明中引物对Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244是根据日本海马EST序列设计得到;引物Htr6和Htr8是根据三斑海马EST序列设计得到,具体信息如下:
实施例2:
一种分子标记引物在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用,其应用过程如下:
1)通过形态学鉴定方法(Lourie et al.,1999),选取日本海马和三斑海马两个海马种群各30个个体,作为鉴定样品;
2)使用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取各海马样本的DNA;
3)应用实施例1中的6对引物对各个海马样本DNA模板进行PCR扩增;
PCR反应体系为10μl体系:
PCR反应过程为:94℃预变性5min,30个循环(94℃变性35s,退火35s,72℃延伸45s),72℃后延伸8min,16℃保存。
用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,结果判断标准如下:本发明中引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物;引物对Hmo48和Hmo421仅可在日本海马中扩增出高质量的SSR产物,在三斑海马中无扩增条带;引物对Htr6和Htr8仅可在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物,在日本海马中无扩增条带。
因此,根据琼脂糖凝胶电泳结果分析:若海马个体DNA在Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244四对引物PCR扩增后有明显条带,在Htr6和Htr8两对引物PCR扩增后无明显条带,则此个体为日本海马;若海马个体DNA在Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8四对引物PCR扩增后有明显条带,在Hmo48和Hmo421两对引物PCR扩增后无明显条带,则此个体为三斑海马。
对6对引物的PCR扩增产物进行浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳;电泳结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示;图中个体1、2、3、4、5为日本海马,个体6、7、8、9、10为三斑海马;电泳结果显示:日本海马群体的5个个体电泳结果完全符合鉴定原则;三斑海马5个个体电泳结果也完全符合鉴定结果。
利用本发明的SSR分子标记的方法对日本海马和中国海马的鉴定结果,与形态学的鉴定方法完全相符。
本方法中海马样本鉴定结果准确,用时短,耗材少,费用低,比片段分离的多态性分析法更为准确实用。
SEQUENCE LISTING
<110>华中农业大学
<120>一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法
<130>一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ccaaacctgctacacgacat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
cacaaagcaagcaagaaagc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
cagttcagggtgtcgtcg 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
acagttctaatagtttgatttcgtt 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
ggacttttgtgacaaggaga 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
gtgccaagttgtcttatcag t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
tctttggagcttagaaggct a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
aagatcttgctcaaagaatc c 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
ttggtttcgcactgacat 18
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
atagttgggagtattgttacattat 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
ggctactcaggcgacaaaac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
gcggaaaatcttcgctattc 20
Claims (3)
1.一种海马的SSR分子标记引物,具体如下:
Hmo48 F: CCAAACCTGCTACACGACAT
R: CACAAAGCAAGCAAGAAAGC
Hmo421 F: CAGTTCAGGGTGTCGTCG
R: ACAGTTCTAATAGTTTGATTTCGTT
Hmo242 F: GGACTTTTGTGACAAGGAGA
R: GTGCCAAGTTGTCTTATCAGT
Hmo244 F: TCTTTGGAGCTTAGAAGGCTA
R: AAGATCTTGCTCAAAGAATCC
Htr6 F: TTGGTTTCGCACTGACAT
R: ATAGTTGGGAGTATTGTTACATTAT
Htr8 F: GGCTACTCAGGCGACAAAAC
R: GCGGAAAATCTTCGCTATTC。
2.利用权利要求1所述的引物鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法,具体步骤如下:
1)提取待鉴定海马的DNA;
2)用以下6对引物对海马个体DNA模板进行PCR扩增;
Hmo48 F: CCAAACCTGCTACACGACAT
R: CACAAAGCAAGCAAGAAAGC
Hmo421 F: CAGTTCAGGGTGTCGTCG
R: ACAGTTCTAATAGTTTGATTTCGTT
Hmo242 F: GGACTTTTGTGACAAGGAGA
R:GTGCCAAGTTGTCTTATCAGT
Hmo244 F:TCTTTGGAGCTTAGAAGGCTA
R: AAGATCTTGCTCAAAGAATCC
Htr6 F:TTGGTTTCGCACTGACAT
R:ATAGTTGGGAGTATTGTTACATTAT
Htr8 F:GGCTACTCAGGCGACAAAAC
R:GCGGAAAATCTTCGCTATTC;
3)对6对引物的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测;
结果判断标准如下:引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物;引物对Hmo48和Hmo421在日本海马中扩增出高质量的SSR产物,在三斑海马中无扩增条带;引物对Htr6和Htr8在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物,在日本海马中无扩增条带。
3.权利要求1所述的引物在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410056237.1A CN103789441B (zh) | 2014-02-19 | 2014-02-19 | 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410056237.1A CN103789441B (zh) | 2014-02-19 | 2014-02-19 | 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103789441A true CN103789441A (zh) | 2014-05-14 |
CN103789441B CN103789441B (zh) | 2015-06-03 |
Family
ID=50665492
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410056237.1A Expired - Fee Related CN103789441B (zh) | 2014-02-19 | 2014-02-19 | 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103789441B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104531870A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-22 | 中国科学院南海海洋研究所 | 中国近海海马微卫星标记的特异性引物及鉴定方法 |
CN105177143A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法 |
CN105177142A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法 |
CN117025788A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-11-10 | 山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心) | 一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用 |
-
2014
- 2014-02-19 CN CN201410056237.1A patent/CN103789441B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
ADAM G.JONES,ET AL: "Microsatellite evidence for monogamy and sex-biased recombination in the Western Australian seahorse Hippocampus angustus", 《MOLECULAR ECOLOGY》 * |
M THANGARAJ AND A P LIPTON: "Assesment of genetic variation in closely related seashorse speices(Genus:Hippocampus)using mtDNA marker", 《INDIAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
MIRJAM S. VAN DE VLIET, ET AL: "Highly polymorphic microsatellite markers for the short-snouted seahorse (Hippocampus hippocampus), including markers from a closely related species the long-snouted seahorse (Hippocampus guttulatus)", 《 CONSERVATION GENET RESOUR》 * |
PETER H. A. GALBUSERA,ET AL: "Isolation of microsatellite markers for the endangered Knysna seahorse Hippocampus capensis and their use in the detection of a genetic bottleneck", 《MOLECULAR ECOLOGY NOTES》 * |
吴平等: "海马类药材的分子遗传标记鉴定研究", 《药学学报》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104531870A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-22 | 中国科学院南海海洋研究所 | 中国近海海马微卫星标记的特异性引物及鉴定方法 |
CN105177143A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法 |
CN105177142A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法 |
CN105177142B (zh) * | 2015-09-16 | 2018-06-26 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法 |
CN105177143B (zh) * | 2015-09-16 | 2018-06-26 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法 |
CN117025788A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-11-10 | 山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心) | 一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用 |
CN117025788B (zh) * | 2023-08-29 | 2024-03-26 | 山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心) | 一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103789441B (zh) | 2015-06-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102134593B (zh) | 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用 | |
CN103789441B (zh) | 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 | |
CN106086167A (zh) | 一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及方法 | |
CN105483261B (zh) | 一种蓝腹库蠓的特异基因及其分子鉴定方法 | |
CN107475458A (zh) | 鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 | |
CN103937802A (zh) | 日照海蝉的dna条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法 | |
CN103805609A (zh) | 一种台湾蠛蠓分子鉴定方法 | |
CN103397091A (zh) | 一种鉴定乳鸽性别的pcr方法 | |
CN105821054B (zh) | 一种四川华鳊dna条形码标准检测序列及其应用 | |
CN104120189A (zh) | 鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法 | |
CN108384859A (zh) | 与脂尾型绵羊的尾型性状相关的snp标记及应用 | |
CN102899321A (zh) | 刀鲚性别特异srap标记带的筛选方法及性别鉴定方法 | |
CN105002171A (zh) | 一种与中华绒螯蟹体重相关的snp标志及其应用 | |
CN102643912B (zh) | 一种检测水貂源性成分的扩增引物 | |
CN106480226A (zh) | 乌鳢雄性分子标记引物及应用 | |
CN102041310B (zh) | 一种检测鸡玫瑰冠性状的方法 | |
CN111057771B (zh) | 一种用于区分“中洋1号”和普通暗纹东方鲀的snp分子标记及其应用 | |
CN110541035A (zh) | 一种中华倒刺鲃dna条形码序列及其应用 | |
CN104988240A (zh) | 利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法 | |
CN102864241B (zh) | 一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法 | |
CN105087564B (zh) | 鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法 | |
CN104293907A (zh) | 用于团头鲂家系鉴定的srap分子标记引物及其方法和应用 | |
CN105063202B (zh) | 利用SNP标记rs4208349鉴别蜂群王浆高产性状的方法 | |
CN107164481A (zh) | 甜瓜抗白粉病相关ssr标记及其应用 | |
CN105483281A (zh) | 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150603 Termination date: 20160219 |