CN103397091A

CN103397091A - 一种鉴定乳鸽性别的pcr方法

Info

Publication number: CN103397091A
Application number: CN2013103253498A
Authority: CN
Inventors: 李世军; 阳春义; 周伟; 龚炎长; 王一苇; 熊晓寒; 陈思; 徐子贺
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2013-11-20

Abstract

本发明公开了一种利用PCR和琼脂糖凝胶鉴定乳鸽性别的新方法。本发明还公开了一种用于鉴定乳鸽性别的引物对，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明是针对鸽子CHD序列自行设计的特异引物，具有高特异性，与以往利用苯酚-氯仿获得羽毛毛球DNA获得方法不同，本方法应用PCR缓冲液法快捷简单，更为重要的是省掉了氯仿-苯酚的提取步骤，节约了成本，消除了氯仿-苯酚对环境的污染，是一种绿色环保的DNA获取方法。本发明基因型判型方法不同，本方法只需要琼脂糖一步法判型，与贾晓旭等提供用酶切和聚丙烯酰胺胶判型的方法比较，耗时短，成本低，适合鸽业生产场家大样本的快速判别。

Description

一种鉴定乳鸽性别的PCR方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定乳鸽性别的PCR方法。

背景技术

鸽子是一种单态性鸟类，即无论是雏鸽还是成年鸽都很难从外观形态或其他行为上区分雌雄性别。用于鸽子性别鉴定的传统方法主要有翻肛法、腹腔镜检法、体尺测量法和粪便类固醇检测等，但这些方法或费时费力或有较大伤害性，准确度不高，难以对肉鸽这种繁殖量大的鸟类进行性别鉴定。本方法利用鸽子性染色体上的CHD基因（chromobox-helicase-DNA binding gene全称为染色体螺旋蛋白基因）在Z、W染色体上长度及同源序列的差异，雌鸟中有两个同源拷贝CHD-Z（长370bp，GenBank:GU289184.1）和CHD-W（长350bp，GenBank:GU289183.1），在雄鸟中只有CHD-Z，运用PCR扩增和琼脂糖凝胶分离CHD-Z、CHD-W从而达到对鸽子进行性别鉴定目的，是一种准确性高、简便、成本低、零污染并且对动物伤害极小的性别鉴定方法。

在性别鉴定的过程中，获取用于PCR扩增的DNA模板有很多种，主要有两种取样方法，即伤害性取样和非伤害性取样（Tabertlet et al,1999）。伤害性取样指的是通过杀死、伤害动物来获得血液、肌肉等组织样品；非伤害性取样指的是不采用杀死、伤害动物的方式，而是捕捉动物进行血液的抽取以及毛发或羽毛等样品的采集(Taberlet et al,1999；Morin and Woodruff,1996)。

在鸽子的实际养殖过程中，我们发现鸽子有时会存在同性恋的现象，且两只雌鸽子在一起可以产生无精蛋。近年来，由于鸽子蛋的高营养价值和药用价值越来越受到消费者的青睐，因此鸽子蛋的市场价格也有走高的趋势，目前大约3元一枚；由于鸽子的单态性，23日龄的雌雄乳鸽在体型和外貌上难以区分。23日龄的乳鸽在体型和外貌和50日龄的乳鸽没有太大区别，在这两个日龄的乳鸽售价相同，鸽子的23日龄至50日龄之间需要消耗饲料成本、人工成本、管理成本等，因此厂家为了追求最大的经济效益，一般会在乳鸽23日龄时留母售公，所以，对23日龄前的乳鸽进行性别鉴定具有重要实践意义和经济价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术的问题，本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定乳鸽性别的引物对。本发明的第二个目的是提供一种鉴定乳鸽性别的PCR试剂。本发明的第三个目的是提供一种鉴定乳鸽性别的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于鉴定乳鸽性别的引物对，如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

一种鉴定乳鸽性别的PCR试剂，由所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶、10*PCR缓冲液和镁离子组成。

所述引物对中各引物在所述的PCR试剂中的浓度均为0.2μM，所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度1mM，所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0.05IU/μl，所述镁离子在所述的PCR试剂中的浓度为2.0mM。含有所述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

所述的引物对、所述的试剂或所述试剂盒在鉴定乳鸽性别中的应用。

一种鉴定乳鸽性别的方法，包括以下步骤：用所述的引物对或所述的试剂或所述的试剂盒中的引物对对待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小分别为338bp和318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雌性，若所述PCR扩增产物中含有大小为338bp的片段而且不含有大小为318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雄性。

所述羽毛毛球基因组DNA的提取方法如下：1）：毛球DNA提取缓冲液终浓度配比：KCl50mM；Tris-HCl(pH8.3)10mM；MgCl₂2.0mM，蛋白酶K20μg/ml；2）羽毛毛球样本处理：样本采集到达实验室后，立即用手术刀切1～1.5mm的毛球薄片，放入事先加入90μL上述毛球DNA提取缓冲液的96孔PCR板中，毛球薄片集满一板96个样品后，3000转/分钟，离心2分钟；3）消化灭活：用PCR仪65℃60分钟消化，95℃，15分钟灭活蛋白酶K，3000转/分钟，离心2分钟，上清即为羽毛毛球基因组DNA，取上清1.2μl用于PCR扩增，其余贮存在-20℃备用。

所述PCR扩增中，以待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA为DNA模板；所述PCR扩增的退火温度为55℃。

所述PCR扩增产物中，所述338bp片段为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸，所述PCR扩增产物中，所述320bp片段为序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸。

检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明是针对鸽子CHD序列自行设计的特异引物，具有高特异性，羽毛毛球DNA获得方法不同，本方法应用毛球DNA提取缓冲液快捷简单，更为重要的是省掉了氯仿-苯酚的提取步骤，节约了成本，消除了氯仿-苯酚对环境的污染，是一种绿色环保的DNA获取方法。本发明基因型判型方法不同，本方法只需要琼脂糖一步法判型，与贾晓旭等（农业生物技术学报，2010年，第18卷，第5期，第1019～1023页）提供用酶切和聚丙烯酰胺胶判型的方法比较，耗时短，成本低，适合鸽业生产场家大样本的快速判别。

附图说明

图1未知性别雏鸽CHD基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；M：DNA markerI；1-4、6、8、9、11、12、15-20、22、24：雌性；5、7、10、13、14、21、23：雄性；CHD-Z片段长度：338bp；CHD-W片段长度318bp。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本实验中用到的试剂和仪器：

毛球DNA提取缓冲液、琼脂糖、TBE缓冲液、异丙醇、去离子水、电泳缓冲液、GSB、WB、EB、CHD基因引物（GZ-CHD-F₅：CAAGGATGAGGAACTGTGCAAGZ-CHD-R323：CTCGAGGAATGGTTCGTGGT）等。

利用oligo6进行引物设计，通过对CHD-Z（长370bp，GenBank:GU289184.1）5-24bp和323-342bp和CHD-W（长350bp，GenBank:GU289183.1）5-24bp和303-322bp的保守序列进行设计，得到引物1GZ-CHD-F5和引物2GZ-CHD--R323。

所需仪器有各种型号的EP管、移液枪及枪头、PCR仪、电泳设备、离心机、烧杯等。

毛球DNA提取缓冲液终浓度配比（KCl：50mM；Tris-HCl(pH8.3)：10mM；MgCl₂：2.0mM，蛋白酶K：20μg/ml）。

实施例1：羽毛毛球DNA的提取

1、样本采集

本研究的羽毛毛球样本采自湖北广水田园鸽业的4272窝20日龄雏鸽(Columba livia Gmelin)，总计8544个个体。羽毛样采集采用拔取翅膀与尾部羽毛毛球的方法，一般为2～3根，每次采集576个样本，用1.5mlEP管封装并标记鸽子编号，泡沫保温箱内加冰块，提供快递公司运到实验室，一般需要18-24小时。

2、羽毛的毛球DNA的提取

样本到达实验室后，立即用手术刀切1～1.5mm的毛球薄片，放入事先加入90μL毛球DNA提取缓冲液的96孔PCR板中，毛球薄片集满一板96个样品后，3000转/分钟，离心2分钟，用PCR仪65℃60分钟消化，95℃，15分钟灭活蛋白酶K，3000转/分钟，离心2分钟，上清即为羽毛毛球基因组DNA，取上清1.2μl用于PCR扩增，其余贮存在-20℃备用。

实施例2：CHD基因的获得

1、PCR扩增

PCR反应体系（10ul）：1.2μl DNA模板和8.8μlPCR试剂。其中PCR试剂包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、10*PCR缓冲液和镁离子组成；引物对包括引物1和引物2；具体PCR反应体系含量如下：1.0μl10*PCR缓冲液；0.1μlTaqE(5IU/μl)；0.8μl Mg²⁺(25mM)；0.1μl dNTP(10mM)；0.2μl引物1(0.2μM)；0.2μl引物2(0.2μM)；6.4μl去离子水。PCR反应程序为：94℃，5min，35个循环（94℃，40s，55℃，40s，72℃，40s），72℃，7min，15℃，1min。基因型判型用琼脂糖浓度3.5%，120伏特，80分钟进行琼脂糖凝胶电泳判断。

2、基因型与性别对应预实验

实验前用14只鸽子羽毛毛球按照上述步骤进行基因型鉴别，结果为9只雌鸽，5只雄鸽，经解剖检验全部对应，准确率100%，出现错误的概率6.1*10^-5，因此上述方法可以用于大规模性别鉴定。

3、电泳结果：

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，M：DNA markerI；1-4、6、8、9、11、12、15-20、22、24：从电泳图上可以看出：雌性；5、7、10、13、14、21、23：雄性；CHD-Z片段长度：338bp；CHD-W片段长度318bp。

实施例3：

本实验共对8544只白羽王鸽的性别进行鉴定，母鸽3901只,公鸽4101只，共有542只未测得性别，鉴定准确率100%，检出率93.65%，未检出的主要原因可能是一鸽子羽毛采集过程中没有真正把羽毛毛球采集下来；二毛球采集后放置时间过长，存放温度不合适；三毛球组织分离过大，蛋白质含量过高使DNA析出困难。使用毛球DNA提取缓冲液提取DNA，并用PCR扩增CHD基因用于鸽子的性别鉴定是可以实际应用的。这种方法只需要一台PCR仪，使用的试剂也是平常PCR扩增需要用的试剂，非常方便。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于鉴定乳鸽性别的引物对，其特征在于如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一种鉴定乳鸽性别的PCR试剂，由权利要求1所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶、10*PCR缓冲液和镁离子组成。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于，所述引物对中各引物在所述的PCR试剂终浓度均为0.2μM，所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为1mM，所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0.05IU/μl，所述镁离子在所述的PCR试剂中的浓度为2.0mM。

4.含有权利要求2或3所述的PCR试剂的试剂盒。

5.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述试剂盒在鉴定乳鸽性别中的应用。

6.一种鉴定乳鸽性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒中的引物对对待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小分别为338bp和318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雌性，若所述PCR扩增产物中含有大小为338bp的片段而且不含有大小为318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雄性。

7.根据权利要求6所述的鉴定乳鸽性别的方法，其特征在于，所述羽毛毛球基因组DNA的提取方法如下：1）：毛球DNA提取缓冲液终浓度配比：KCl50mM；Tris-HCl(pH8.3)10mM；MgCl₂2.0mM，蛋白酶K20μg/ml；2）羽毛毛球样本处理：样本采集到达实验室后，立即用手术刀切1～1.5mm的毛球薄片，放入事先加入90μL上述毛球DNA提取缓冲液的96孔PCR板中，毛球薄片集满一板96个样品后，3000转/分钟，离心2分钟；3）消化灭活：用PCR仪65℃60分钟消化，95℃，15分钟灭活蛋白酶K，3000转/分钟，离心2分钟，上清即为羽毛毛球基因组DNA，取上清1.2μl用于PCR扩增，其余贮存在-20℃备用。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，以待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA为DNA模板；所述PCR扩增的退火温度为55℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增产物中，所述338bp片段为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸，所述PCR扩增产物中，所述318bp片段为序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳。